La plasticidad sináptica en hipocampo como posible sustrato neurobiológico del desarrollo de tolerancia rápida a benzodiazepinas

La administración crónica de bezodiazepinas induce tolerancia a sus efectos sedativos, como así también los que se observan sobre las alteraciones motoras y a su efecto como relajante muscular. Es de destacar que el desarrollo de tolerancia a las distintas acciones mencionadas, se desarrolla de manera rápida. Recientemente distintos autores han descripto que la administración previa de antagonistas de los receptores al glutámico de tipo N-metil-D-aspartato (NMDA) es capaz de revertir el desarrollo de tolerancia al efecto hipolocomotor de diazepam (DZ). Resultados recientes de este laboratorio han demostrado que durante el desarrollo de tolerancia al efecto hipolocomotor de DZ se produce un incremento de la plasticidad sináptica en el hipocampo de estos animales. Ha sido sugerido que un fenómeno asociativo o de aprendizaje, subyace al desarrollo de tolerancia a benzodiazepina como así también al desarrollo de tolerancia a otras drogas psicoactivas. Los receptores de glutamato, involucrados en la prevención del desarrollo a la tolerancia a DZ, como así también a otras drogas psicoactivas, es un tipo de receptores al glutámico, llamado NMDA. Estos receptores han sido relacionados con la plasticidad neural y conductual. Más aún, se ha propuesto que proponen que la tolerancia y la dependencia a opiáceos depende de la activación de receptores NMDA. Objetivos del proyecto: * Demostrar que en el desarrollo rápido de tolerancia al efecto hipolocomotor de DZ participan elementos que demuestran la existencia de un proceso de aprendizaje. * Determinar si el incremento de la plasticidad sináptica observada en el hipocampo de animales en los cuales se desarrolló tolerancia al efecto hipolocomotor de DZ, puede ser el sustrato neurobiológico del proceso de aprendizaje postulado.

Sistemas involucrados en la biosíntesis de hormonas tiroideas en tejidos tiroideos con diferentes estados funcionales

Existen antecedentes previos realizados en nuestro laboratorio, que demuestran que la aplicación de una sesión de electroshock mínimo (MES) es capaz de revertir la muerte neuronal en el hipocampo producida como consecuencia de la adrenolectomía. Teniendo en cuenta estos resultados es importante determinar si la acción protectiva neuronal, que es inducida por la aplicación de MES, se puede extender a otros tipos de muerte neuronal. Para ello se estudiará, en dos modelos experimentales distintos, en los cuales existe daño neuronal, si la aplicciónde MES también puede ejercer protección neuronal. En estos dos modelos de la muerte neuronal se produce en diferentes regiones cerebrales. Un modelo es la destrucción de células dopaminérgicas, producidas por la administración intracerebral, en la sustancia nigra, de la neurotoxia 6/OHDA (modelo de enfermedad de Parkinson). El otro modelo resulta de la administración sistémica del agonista glutamaérgico. Este induce la manifestación de estatus epilépticus con la consecuente detrucción de ciertas poblaciones neuronales principalmente en el hipocampo, amígdala y corteza entrhinal. Asimismo este proyecto propone estudiar la posible participación de algunos factores tróficos en la protección neuronal inducida por la aplicación de algunos de MES. Para ello se determina la distribución y los niveles de algunos de los factores tróficos y sus receptores después de la administración de MES. Los experimentos propuestos indican el estudio de los mecanismos celulares y moleculares que podrían participar en los fenómenos de muerte celular.

Procesos de plasticidad sináptica en gyrus dentado hipocampal durante la administración crónica y el síndrome de abstinencia a cocaína. Synaptic plasticity in hippocampal dentate gyrus during chronic administration and withdrawal from cocaine.

Los procesos neuronales adaptativos que se observan como consecuencia de la administración crónica de drogas de abuso, son similares a los procesos plásticos que subyacen al aprendizaje y la memoria. Por otra parte, el hipocampo forma parte del circuito neuronal responsable de los cambios conductuales observados como consecuencia de la administración crónica de diferentes drogas de abuso. De acuerdo con esto, resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que la plasticidad sináptica en el hipocampo y las claves contextuales relacionadas con la administración de la droga, son relevantes para el incremento de la plasticidad hipocampal por la administración crónica de diazepam. Específicamente en el gyrus dentado hipocampal se han descripto fenómenos plásticos relacionados con la exposición crónica a psicofármacos, tales como facilitación en la transmisión sináptica, disminución de la proliferación celular y el aumento del factor de transcripción ?Fos B. Debido a la correlación existente entre los mecanismos de plasticidad neuronal, los aprendizaje asociativos y formación de memorias y aquellos responsables de la adicción, el objetivo general de este trabajo es caracterizar los cambios inducidos por la exposición repetida de cocaína y durante el periodo de abstinencia, en la excitabilidad neuronal de las células del gyrus dentado hipocampal, los canales iónicos afectados y los posibles mecanismos bioquímicos involucrados en dichos cambios, que podrían explicar las alteraciones conductuales observadas después de dicho tratamiento. Con este propósito, se estudiará: 1) la plasticidad sináptica (potenciación a largo plazo, LTP y depotenciación a largo plazo, LTD) en el gyrus dentado, mediante registros electrofisiológios multiunitarios; 2)la excitabilidad de las células granulares del gyrus dentado y la actividad de los canales iónicos, utilizando la técnica de patch clamp; 3) las alteraciones en la neurotransmisión glutamatergica, midiendo los niveles del neurotransmisor in vivo, utilizando la técnica de microdiálisis; el tráfico de receptores glutamatérgicos, utilizando la técnica de western-blott, 4) la participación del óxido nítrico en los cambios adaptativos observados como consecuencia de la sensibilización a cocaína. Además, mediante la utilización de técnicas comportamentales (avoidance inhibitorio), se estudiarán las posibles alteraciones de conductas que se sabe dependen de la integridad funcional del hipocampo.En relación a los resultados del presente proyecto se espera obtener un incremento en la plasticidad sináptica, en la excitabilidad neuronal de las células granulares del gyrus dentado de la formación hipocámpica, en la liberación extracelular de glutamato in vivo, como así también en el tráfico de receptores glutamatérgicos. Además se espera obtener un aumento de las vías de señalización activadas por la acción de glutamato, como la de óxido nítrico/GMPc, como consecuencia de la administración crónica de cocaína. Con este aumento global de la plasticidad sináptica hipocampal, las conductas dependientes de esta estructura debieran estar facilitadas, demostrando así una participación activa del hipocampo en los procesos de sensibilización y posiblemente en la adicción a psicoestimulantes. La caracterización del impacto del desarrollo de sensibilización a cocaína en la excitabilidad neuronal en el hipocampo, sobre los sistemas de neurotransmisión y las vías de señalización involucradas contribuirían a dilucidar los mecanismos que contribuyen al desarrollo de sensibilización a cocaína, los cuales podrían representar potenciales blancos terapéuticos para el tratamiento de la adicción, considerando principalmente aspectos específicos de la actividad eléctrica neuronal y la plasticidad sináptica asociada con las diferentes fases del ciclo de la adicción.

Rol de los factores de crecimiento Wnt sobre el desarrollo de polaridad neuronal y crecimiento axonal. Role of Wnt growth factors on neuronal polarity and axon growth.

El desarrollo y funcionamiento del sistema nervioso dependen de la formación de circuitos neuronales específicos y de programas intrínsecos y extrínsecos que actúan como moduladores del desarrollo neuronal. Inicialmente, los neuroblastos "sensan" a través de receptores específicos, la presencia en el medio de factores de crecimiento, como neurotrofinas clásicas (BDNF, NGF, etc), IGF-1, factores Wnts, que regulan la diferenciación neuronal, polarización, migración, etc. Hasta hace pocos años, las funciones específicas de los diferentes sistemas de factor de crecimiento-receptor en el establecimiento de polaridad y la regulación del crecimiento axonal eran mayormente desconocidas. Más recientemente, trabajos de nuestro y otros grupos de investigación han aportado significativamente al conocimiento de los mecanismos que involucran los sistemas IGF-1-receptor de IGF-1, BDNF-TrkB y NGF-TrkA sobre el desarrollo de polaridad neuronal. Sin embargo, si bien se conoce que los factores de crecimiento Wnt cumplen un rol crucial en eventos que ocurren durante la maduración neuronal (dendritogénesis, sinaptogénesis) poco se sabe sobre los mecanismos por los cuales estos factores regularían el establecimiento inicial de polaridad y el crecimiento axonal. Los factores Wnt como así también su primer efector intracelular Dishevelled (DVL) y sus cascadas de señalización participan de procesos como neurogénesis, guiado axonal, desarrollo dendrítico y formación y mantenimiento de sinápsis. Por estas razones, para el desarrollo del presente proyecto planeamos estudiar los efectos de los factores Wnts, su receptor Frizzled (Fz) y su efector DVL sobre el establecimiento de polaridad y la regulación del crecimiento axonal. También compararemos los efectos de los factores Wnt con los de IGF-1 (el único factor de crecimiento conocido esencial para el establecimiento de polaridad). Finalmente, intentaremos determinar cuál o cuáles de las cascadas intracelulares de señalización activadas por los Wnts están involucradas en sus efectos axogénicos. La metodología a utilizar se basará en el empleo de cultivos primarios de neuronas de hipocampo de embriones de rata de 18 días de gestación, los que serán expuestos a los factores Wnt y/o IGF-1. Se diseñarán experimentos tendientes a evaluar los efectos de dichos factores durante los diferentes estadíos de diferenciación neuronal que se analizarán por microscopía de fluorescencia confocal. Al mismo tiempo se realizarán ensayos de subfraccionamiento que permitan purificar conos de crecimiento aislados en los que se evaluará el rol local de Wnt y sus efectores sobre la fosforilación de quinasas que median la adición local de membrana y elongación axonal. Se examiná el rol de DVL sobre la especificación axonal a través de la expresión epistática en neuronas no diferenciadas como así también se bloqueará su expresión a tavés del uso de siRNA o cDNAs que actúen como dominantes negativas. Finalmente, se examinará una posible "transactivación" por IGF-1 o Wnts de sus receptores o primeros efectores intracelulares específicos, IRS-1- PI3K para IGF-1 y Dishevelled para Wnts. Para ello, se diseñarán experimentos en los que se utilizarán inhibidores farmacológicos específicos y se realizan ensayos de fosforilación en conos de crecimiento aislados y en cultivos neuronales. Los resultados serán cuantificados y sometidos softwares estadísticos adecuados.El desarrollo de estos experimentos nos permitirá examinar posibles paralelismos entre la activación del sistema Wnt-Frizzled-Dishevelled y del sistema IGF-1-Receptor de IGF-1-PI3K, el único sistema factor de crecimiento-receptor conocido esencial para el establecimiento de la polaridad neuronal y así poder lograr un acercamiento al/los posible mecanismo/s que regula/n la diferenciación neuronal y el crecimiento axonal.

Bases neurobiológicas del efecto de grelina sobre ansiedad, memoria e ingesta. Neurobiological mechanisms of ghrelin effect on anxiety, memory and food intake.

El objetivo de este proyecto es investigar el sustrato neurobiológico que subyace a los efectos centrales de grelina (Gr) en estructuras extrahipotalámicas tales como núcleo dorsal del rafe (NDR), hipocampo(Hi) y amígdala(Am) donde hemos demostrado que el péptido incrementa la memoria e ingesta, Los mecanismos neurales, neurotrasmisores(nt), segundos mensajeros, etc., involucrados en estos procesos fisiológicos, inducidos por el péptido, necesitan aun ser esclarecidos. Hemos demostrado que grelina incrementa la retención de la memoria cuando es inyectado en Hi, NDR y Am. También incrementa la ingesta al ser administrado en Hi y NDR pero no así en Am. En Hi los efectos de Gr sobre la memoria se correlacionan con incremento en los niveles tisulares de óxido nítrico (NO) y con la disponibilidad del nt 5-HT. En lo que a electrofisiología se refiere hemos demostrado que Gr disminuye el umbral para generar potenciación a largo plazo (LTP). A fin de aportar nuevas evidencias que contribuyan a esclarecer los efectos del péptido sobre memoria e ingesta utilizaremos estudios conductuales, determinaciones bioquímicas y determinaciones electrofisiológicas. En lo que a ingesta se refiere intentaremos esclarecer el papel de los núcleos central y basolateral de la Am en aspectos hedónicos de la ingesta inducida por Gr En esta etapa, más específicamente nos proponemos:1) Determinar si los efectos de grelina sobre ingesta y memoria demostrados en hipocampo y NDR después de la su administración se correlacionan con modificaciones en la liberación de serotonina utilizando cortes de hipocampo precargados con 5HT tritiada en presencia y ausencia del péptido.2) Evaluar si el incremento de óxido nítrico inducido por grelina en hipocampo se correlaciona con cambios en la expresión de nNOS, utilizando Western-blot y la importancia de NOS/NO en la acción de grelina repitiendo los experimentos previo tratamiento de las ratas con inhibidores de NOS. 3)Estudiar la participación del nt glutamato en los efectos hipocampales de Gr sobre la memoria. Analizando a) si grelina modifica la liberación del nt a partir de sinaptosomas aislados de hipocampo de ratas pretratadas con Gr.b) la participación de los receptores NMDA y GABAa en los efectos de grelina previo bloqueo farmacológico del mencionado receptor y el test step down.c) la participación de los receptores NMDA y GABAa en los efectos de grelina utilizando electrofisiología y Western Blot. 4) Estudiar el efecto de la administración de Gr en Amigdala Central y Basolateral sobre aspectos hedónicos de la ingesta utilizando diferentes paradigmas conductuales en animales. Estudiaremos:a) si Gr modifica el consumo de alimento de diferente palatabilidad en animales y si afecta el componente motivacional de la conducta de ingesta paradigma de "runway".

BASES NEUROBIOLOGICAS DE LA FORMACION DE MEMORIAS TRAUMATICAS EN MODELOS ANIMALES: APROXIMACIÓN FARMACOLOGICA PARA SU REVERSION

La hipótesis de la reconsolidación propone que una memoria consolidada entra nuevamente en un estado lábil seguido por un nuevo proceso de estabilización dependiente de síntesis de proteínas, definido como reconsolidación. Durante el proceso de desestabilización, la traza puede actualizarse incorporando nueva información ajustándose a nuevas exigencias ambientales. Esta visión le otorga a la memoria una propiedad flexible y dinámica, contrariamente a lo sugerido por la clásica teoría de la consolidación que definía el trazo de memoria como algo inflexible e inmutable. La reconsolidación de la memoria consta de dos fases: un proceso de labilización o desestabilización, seguido de una fase de re-estabilización. Evidencias recientes de nuestro laboratorio sugieren que la ocurrencia de un estado emocional negativo, como el generado por un evento traumático (estrés) reduce la vulnerabilidad de la traza durante la evocación, es decir la memoria bajo estas condiciones se vuelve resistente a la interferencia y disminuye las probabilidades de la ocurrencia de la reconsolidación. La abstinencia al etanol genera un estado emocional negativo de características similares al generado por estrés en el complejo basolateral de la Amígdala (BLA). El presente proyecto está dirigido a estudiar los mecanismos neurobiológicos implicados en la memoria resistente, en dos áreas cerebrales críticamente involucradas en la memoria de miedo contextual: BLA y el hipocampo dorsal (HD). Se verificará la reactividad a los agentes interferentes (Midazolam y Propranolol) sobre la reconsolidación tanto en animales estresados como en abstinentes. Además, estudiaremos la expresión de las subunidades de receptores NMDA y GABA-A en las áreas mencionadas. Además nos proponemos re-establecer la capacidad dinámica de la traza con herramientas farmacológicas como la infusión local de un agonista parcial de receptores NMDA. Bajo este esquema hipotético, este tratamiento permitirá re-establecer las propiedades biológicas que definen el proceso de labilización/reconsolidación, con la recuperación de la vulnerabilidad a los agentes interferentes de esta fase ante la presentación del recordatorio. En síntesis, proponemos que los cambios originados por la instauración de un estado emocional negativo modelan la dinámica de la memoria resultante al momento de la evocación. Listado de abreviaturas usadas: BLA: Complejo basolateral de la amígdala HD: hipocampo dorsal R-NMDA: receptores NMDA R-GABAA: receptores GABAA MDZ: Midazolam PROP: propranolol DCS: d-cycloserina