Consecuencias del metabolismo de colina en <i> Pseudomonas aeruginosa </i>: Respuestas adaptativas en microorganismos

Objetivos Generales: Mediante el abordaje experimental desde el punto de vista fisiol��gico, bioqu��mico y molecular se pretende conocer la respuesta adaptativa de <i> P. aeruginosa </i> frente a diferentes est��mulos ambientales tales como osmolaridad, pH y distintos tipos de ayuno nutricional. Objetivos Espec��ficos: Aspectos Bioqu��micos a) Se continuar��n los estudios de las propiedades cin��ticas y fisicoqu��micas de la fosforilcolina fosfatasa de <i> P. aeruginosa.</i> b) Se caracterizar��n los sistemas de transporte en <i> P. aeruginosa</i> para: compuestos de amonio cuaternario (colina, beta��na, carnitina, N-trimetillisina); amino��cidos b��sicos (lisina, arginina) y ��cidos (glut��mico); poliaminas y Pi. Se tratar�� de establecer la presencia o ausencia de prote��nas unidoras peripl��smicas para estos compuestos. c) Se tratar�� de establecer la relaci��n entre el metabolismo de colina y otros compuestos de amonio cuaternario con el metabolismo del ��cido glut��mico y trealosa en <i> P. aeruginosa</i> crecidas en medios iso e hiperosmolares obtenidos con soluciones salinas y solutos no ionizables. d) Se tratar�� de establecer en <i> P. aeruginosa</i> el recambio o destino metab��lico del Pi y colina que se produce cuando la bacteria se enfrenta a diferentes situaciones nutricionales y otros tipos de est��mulos tales como pHs extremos y distinta osmolaridad, tanto a nivel de prote��nas peripl��smicas, citos��licas, de membranas interna y citos��lica, fosfol��pidos, glucofosfol��pidos, glucol��pidos y lipopolisac��ridos (LPS) y compuestos fosforilados de bajo peso molecular, ej. acetilfosfato, alarmonas, etc. Aspectos Genéticos y Moleculares a) Se obtendr��n mutantes de <i> P. aeruginosa</i> con fenotipos caracter��sticos relacionados con los puntos anteriores. (...) b) Se construir�� la librer��a gen��mica de <i> P. aeruginosa</i> en c��smido, pl��smido y cDNA. Posteriormente se pretende la identificaci��n, clonado y secuenciaci��n de los genes relacionados con: 1) La s��ntesis de la fosfatasa ��cida, colinesterasa y PLC. 2) El transporte de compuestos de amonio cuaternario, teniendo en cuanta que, al menos para colina, existen dos componententes, uno de alta y otro de baja afinidad. 3) La s��ntesis de las enzimas responsables de la oxidaci��n de colina hasta beta��na, v��a la formaci��n de aldeh��do de beta��na. (...) 4) La s��ntesis de las enzimas responsables de la degradaci��n de beta��na hasta glicina. (...) 5) La s��ntesis de las enzimas responsables del metabolismo de carnitina en condiciones de alta y baja osmolaridad. (...) 6) La adaptabilidad de la bacteria al pH en condiciones de baja osmolaridad. (...)

Estudios sobre aspectos bioqu��micos, moleculares y funcionales de prote��nas del citoesqueleto

Los microt��bulos son elementos del citoesqueleto celular y est��n constituidos por tubulina, la prote��na cuantitativamente m��s importante y prote��nas asociadas a microt��bulos (MAPs) conocidas como HMW y tau. En la c��lula los microt��bulos participan en numerosas funciones. En el caso de la enfermedad de Alzheimer, la red de microt��bulos se encuentra disminuida y se observa un ac��mulo de manojos de filamentos de tau hiperfosforilada. En este proyecto se estudiar�� de qu�� manera el grado de fosforilaci��n de tau influye sobre la formaci��n de microt��bulos y sobre la interacci��n con tubulina, tau normal, MAP 1 Y MAP 2. Se espera tener un mayor conocimiento acerca de las causas por las cuales, en la enfermedad de Alzheimer, hay una alteraci��n en la formaci��n de microt��bulos y un ac��mulo de filamentos helicoidales de tau hiperfosforilada. Otros aspectos de nuestros estudios est��n dirigidos a conocer la funci��n post-traducci��n de detirosinaci��n-tirosinaci��n de la tubulina. En esta reacci��n participan dos enzimas: una carboxipeptidasa que remueve la tirosina del terminal COOH de la tubulina alfa y una ligasa que es capaz de reincorporar la tirosina removida. En este proyecto est�� programado obtener el cDNA de la ligasa de rata y analizar la secuencia y la expresi��n de la enzima, "in vivo", en diferentes tejidos. El rol funcional de la ligasa ser�� analizado en l��neas celulares y en cultivos primarios de c��lulas neuronales y no neuronales. Por ��ltimo, otro aspecto en estudio est�� relacionado al reciente hallazgo en nuestro laboratorio, de que la tubulina hidrof��bica de membrana no es, como se ven��a sosteniendo desde hac��a varios a��os, una prote��na integral de membrana sino una prote��na perif��rica. De acuerdo a nuestros resultados esta prote��na contiene una alta proporci��n de la isoespecie acetilada. Aparentemente nuestros resultados indican que la prote��na hidrof��bica proviene de microt��bulos que interaccionan con membranas. Nuestro objetivo es establecer si el car��cter hidrof��bico constituye una propiedad intr��nseca de la tubulina (que parece poco probable) o a la interacci��n con un componente de membrana. Los objetivos generales correspondientes al presente proyecto comprenden: a) Estudios acerca del rol que cumplen las MAPs en el mecanismo de la degeneraci��n neurofibrilar en la Enfermedad de Alzheimer. b) Estudios moleculares acerca de la reacci��n de tirosinaci��n/detirosinaci��n de la tubulina: Rol funcional de la tubulina tirosina ligasa. c) Estudios acerca de las propiedades de la tubulina de membrana.

Aspectos moleculares del desarrollo de biofilms, la colonizaci��n de la planta y la emisi��n de compuestos org��nicos vol��tiles en bacterias rizosf��ricas. Molecular aspects of biofilm development, plant colonization and microbial volatile organic emission in rhizospheric bacteria.

Las bacterias que habitan la rizosfera y que poseen la capacidad de provocar un efecto positivo sobre las plantas son denominadas en su conjunto como Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR). Estas bacterias han desarrollado diferentes estrategias para adaptarse a diversas condiciones ambientales. La capacidad para responder a variaciones en la disponibilidad nutricional permite la persistencia de la bacteria en el suelo y mejora sus posibilidades para colonizar la planta hospedadora. En la naturaleza, a menudo las bacterias se encuentran en estructuras de comunidades de microorganismos interconectados denominados biofilms, con un estilo de vida diferente al de la vida en forma planct��nica. La formaci��n del biofilm podr��a representar una estrategia de supervivencia de la rizobacteria a condiciones adversas del suelo. Por Microscop��a Confocal de Barrido L��ser (CLSM), hemos observado que Rhizobium leguminosarum desarrolla un biofilm caracter��stico sobre una superficie abi��tica. Hemos identificado algunos de los factores genéticos que influyen en su formaci��n. El presente proyecto propone avanzar en el conocimiento de los factores ambientales y genéticos que influyen sobre la capacidad de las rizobacterias para formar biofilms y su impacto en la interacci��n con las plantas. A trav��s de enfoques genéticos (mutacionales y de expresi��n g��nica) y an��lisis por CLSM nos proponemos acercarnos a un modelo de los factores de superficie, extracelulares y regulatorios propios de la bacteria que influyen en las propiedades de adhesi��n y la formaci��n de biofilms. Por ��ltimo, se intentar�� correlacionar la emisi��n de compuestos org��nicos vol��tiles por las bacterias rizosf��ricas con ciertos aspectos de la promoci��n del crecimiento de las plantas.

Citogen��tica y filogenia en especies silvestres y cultivadas de aj��es (Capsicum - Solanaceae)

En Capsicum se han realizado an��lisis citogenéticos mediante diversas t��cnicas que han contribuido a caracterizar un n��mero importante de especies y a establecer relaciones entre las mismas. No obstante los progresos realizados a la fecha en este aspecto, todav��a quedan grupos con l��mites a��n discutidos y otros poco conocidos. A trav��s de este proyecto se propone ampliar los estudios de citogen��tica y biolog��a molecular en el g��nero con diversos objetivos. En forma general, acrecentar el conocimiento de la organizaci��n gen��mica, las relaciones filogen��ticas y la evoluci��n cromos��mica en Capsicum. Respecto a los taxones cultivados, se intentar�� esclarecer si los tres miembros del complejo C. annuum (C. annuum, C. chinense, C. frutescens) constituyen especies diferentes o se trata de taxones co-espec��ficos. En cuanto a las especies silvestres, se obtendr�� informaci��n citogen��tica de C. geminifolium, C. lanceolatum y C. lycianthoides, a fin de caracterizarlas y determinar su validez taxon��mica. As�� mismo, considerando estas especies y otras menos conocidas como C. coccineum, C. cornutum, C. dimorphum y C. mirabile, se intentar�� definir relaciones interespec��ficas y clados infragen��ricos. Este estudio comprender�� aspectos tales como an��lisis cromos��mico con m��todos de bandeos (de fluorescencia y AgNOR), mapeo de secuencias del DNA (genes ribos��micos) mediante hibridaci��n in situ fluorescente (FISH), an��lisis estructural de la heterocromatina, evaluaci��n de la variabilidad intra - e interespec��fica usando marcadores moleculares ���microsat��lites���, an��lisis filogen��tico utilizando marcadores nucleares y cloroplastidiales. La informaci��n obtenida puede, adem��s, ser una herramienta b��sica aplicable al mejoramiento gen��tico de las especies cultivadas (variedades de aj��es y pimientos comerciales) y a la conservaci��n de los recursos genéticos silvestres.

Investigaci��n de defectos genéticos en el sistema de la fosforilasa hep��tica en pacientes argentinos. Definici��n nosol��gica mediante una estrategia de an��lisis molecular. Investigation of genetic defects in the hepatic phosphorylase system in Argentinean patients. Nosological definition by molecular analysis strategy.

Las Enfermedades de Atesoramiento de Gluc��geno (EAGs) tambi��n llamadas Glucogenosis comprenden un grupo de entidades causadas por una deficiencia enzim��tica espec��fica relacionada con la v��a de s��ntesis o degradaci��n de esta macromol��cula. La heterogeneidad fenot��pica de los pacientes afectados dificulta la identificaci��n de las diferentes variantes de EAG y por ende la correcta definici��n nosol��gica. En el Centro de Estudio de las Metabolopat��as Cong��nitas, CEMECO, se fueron definiendo los diferentes tipos de Glucogenosis a trav��s de una estrategia multidisciplinaria que integra distintos niveles de investigaci��n cl��nica y complementaria, laboratorio metab��lico especializado, enzim��tico, histomorfol��gico y de an��lisis molecular. Sin embargo, en algunos enfermos, entre los que se encuentran aquellos con defectos en el sistema de la fosforilasa hep��tica (EAG-VI y EAG-IX), la exacta definici��n nosol��gica a��n no est�� resulta. La EAG-VI se refiere a un defecto en la fosforilasa hep��tica, enzima codificada por el gen PYGL, mientras que la EAG-IX es causada por un defecto gen��tico en una de las subunidades de la fosforilasa b quinasa hep��tica codicadas por los genes PHKA2, PHKB y PHKG2, respectivamente. El objetivo del presente trabajo es propender a la definici��n nosol��gica de pacientes con defectos en el sistema de la fosforilasa mediante una estrategia de an��lisis molecular investigando los genes PYGL, PHKA2, PHKB y PHKG2. Los pacientes incluidos en este estudio deber��n ser compatibles de padecer una EAG-VI o EAG-IX sobre la base de s��ntomas cl��nicos y hallazgos bioqu��micos. La metodolog��a incluir�� la determinaci��n de la enzima fosforilasa b quinasa en gl��bulos rojos y dentro del an��lisis molecular la extracci��n de DNA gen��mico a partir de sangre entera para la amplificaci��n por PCR de los exones m��s las uniones exon/intron de los genes PHKG2 y PYGL y la extracci��n de RNA total y obtenci��n de cDNA para posterior amplificaci��n de los cDNA PHKA2 y PHKB. Todos los fragmentos amplificados ser��n sometidos a an��lisis de secuencia de nucle��tidos. Resultados esperados. Este trabajo, primero en Argentina, permitir�� establecer las bases moleculares de los defectos del sistema de la fosforilasa hep��tica (EAG-VI y EAG-IX). El poder lograr este nivel de investigaci��n traer�� aparejado, una oferta integrativa en el vasto cap��tulo de las glucogenosis hep��ticas, con extraordinaria significaci��n en la pr��ctica asistencial para el manejo, pron��stico y correspondiente asesoramiento gen��tico. Hepatic glycogen storage diseases (GSDs) are a group of disorders produced by a deficiency in a specific protein involved in the metabolism of glycogen causing different types of GSDs. Phenotypic heterogeneity of affected patients difficult to identify the different GSD variants and therefore the correct definition of the disease. In the ���Centro de Estudio de las Metabolopat��as Cong��nitas���, CEMECO, were defined the different GSD types by a protocol which included complex gradual levels of clinical, biochemical, enzymatic and morphological investigation. However, in some patients, like those one with defects in the hepatic phosphorylase system (GSD-VI and GSD-IX) the exact definition of the disease has not yet been resolved. The GSD-VI is produced by a defect in the PYGL gen that encode the liver phosphorylase, while the GSD-IX is caused by a genetic defect in one of the Phosphorylase b kinase subunits, encoded by the PHKA2, PHKB and PHKG2 genes, respectively. The aim of the present study is to define the phosphorylase system defects in argentinian patients through a molecular strategy that involve the investigation of PYGL, PHKA2, PHKB and PHKG2 genes. Patients included in the present study must be compatible with a GSD-VI or GSD-IX on the bases of clinical symptoms and biochemical findings. The phosphorylase b kinase activity will be assay on in blood red cells. The molecular study will include genomic DNA extraction for the amplification of PHKG2 and PYGL genes and the total RNA extraction for amplification of the PHKA2 and PHKB cDNA by PCR. All PCR-amplified fragments will be subjected to direct nucleotide sequencing. This work, first in Argentina, will make possible to establish the molecular basis of the defects on the hepatic phosphorylase system (GSD-VI and GSD IX). To achieve this level of research will entail advance in the study of the hepatic glycogen storage disease, with extraordinary significance in the treatment, prognosis and the genetic counselling.

Dispersi��n agr��cola y cambio social en las Sierras de C��rdoba (ca. 1000 a C.- 1600 d C.) Agricultural spread and social change in C��rdoba Hills (ca. 1000 b C- 1600 a D.)

El proceso cultural en las Sierras de C��rdoba fue habitualmente concebido como marginal con respecto al Noroeste Argentino. Tras el establecimiento del esquema b��sico de la secuencia prehisp��nica, a mediados del siglo pasado, se defini�� una etapa agroalfarera de cronolog��a tard��a, que continuaba a una extensa etapa precer��mica cuyos l��mites se aproximaban a la transici��n Pleistoceno-Holoceno. Se hac��a referencia, de este modo, al advenimiento de un modo de vida agr��cola y aldeano, que reemplazaba a otro basado en la caza y recolecci��n. Dicha transformaci��n, alternativamente atribuida a la poblaci��n cazadora local o a una migraci��n de grupos agricultores desde regiones vecinas, se habr��a consumado hacia 1500 AP, fijando uno de los l��mites de la dispersi��n de la agricultura andina. Es necesario destacar la extremada escasez y el car��cter indirecto de las evidencias arqueol��gicas utilizadas para sustentar la ocurrencia de tal proceso. Asimismo, la vigencia de supuestos que han comenzado a mostrar inconsistencias con los resultados de las recientes investigaciones. Entre ellos, principalmente, el que asume que la introducci��n de la agricultura dio paso a una transformaci��n radical de las sociedades prehisp��nicas, constituyendo un hito fundamental en su devenir hist��rico, el comienzo de una nueva etapa. Nuestros ��ltimos estudios en el sector central de las Sierras de C��rdoba apuntaron, entre otros objetivos, a reconocer indicadores arqueol��gicos directos de producci��n agr��cola, as�� como de la manipulaci��n y consumo de plantas cultivadas. Los primeros resultados nos permiten vislumbrar un escenario complejo que desaf��a los modelos vigentes. El consumo de ma��z, por ejemplo, parece haber antecedido por muchos siglos a la adopci��n de pr��cticas agr��colas. El acceso a este cult��geno, sumado a otros elementos, indicar��a cambios entre los cazadores-recolectores serranos, promovidos por su integraci��n en redes macrorregionales que los vincularon con sociedades agricultoras de la vertiente oriental andina y quiz��s del Chaco Santiague��o, por lo menos desde 2500 AP. En definitiva, la agricultura no parece haber sido adoptada r��pidamente ni provocado transformaciones profundas e inmediatas en la organizaci��n de los grupos prehisp��nicos. Se ha observado, por el contrario, la incorporaci��n gradual de distintas innovaciones que incluso permiten relacionar la manipulaci��n y m��s tarde el cultivo de plantas domesticadas, con procesos de intensificaci��n productiva de mayor escala temporal. Uno de nuestros objetivos en este proyecto consiste, b��sicamente, en profundizar las investigaciones en curso a fin de ampliar el cuerpo de datos con el cual analizar y discutir el problema de la dispersi��n agr��cola en la regi��n. Ello implica el tratamiento de diferentes l��neas de evidencia, en particular: 1) la distribuci��n regional de sitios arqueol��gicos y las modalidades de ocupaci��n de las tierras cultivables; 2) la b��squeda de superficies de cultivo en sitios estratificados; y 3) estudios arqueobot��nicos, pol��nicos y de is��topos estables. Se entiende que no le corresponde a la arqueolog��a asumir aprior��sticamente el significado hist��rico de la introducci��n de la agricultura, sino establecerlo en cada caso puntual a trav��s de la investigaci��n concreta. Nuestro segundo objetivo consiste, por lo tanto, en delinear los cambios (econ��micos, tecnol��gicos, pol��ticos, sociales) que acompa��aron al proceso de dispersi��n agr��cola. Ello implica el tratamiento de diferentes problemas, entre otros: 1) las pr��cticas de apropiaci��n de los recursos silvestres; 2) la continuidad y cambio tecnol��gico; 3) la movilidad y la articulaci��n microambiental; y 4) los aspectos pol��ticos y sociales ligados a pr��cticas como la molienda grupal y la producci��n del arte rupestre. The radical chage of societies from hunter-gatherers to farmers in 1500 BP was considered a milestone whitin the cultural process of pre-hispanic societies in Cordoba Hill. But there is a shortage of archaeological remains to support this change and there are weak hypotheses of absolute transformations. During the last years, our studies carried out on the central area of Cordoba Hill have tried to recognize direct archaeological signs of agriculture production as well as the handling and consumption of crops. The first results show a complex set that challenges the current theoretical models. For example, the corn was probably eatten prior to its adoption for farm practices. Our first main consists in increasing a corpus of data about the spread of agriculture in Cordoba region that we have been researching for the last years. These researches involve different lines of evidence: 1-regional location of archaeological sites and kinds of occupation on cultivable lands; 2-the search for plots at archaeological sites; 3-archaeobotanical, pollen and stable isotopes studies. Our second main consists in outlining changes within the spread of agriculture. It implies to considering different problems: 1-the practices to gatherer wild resources; 2-the continuity and changes of technologies; 3-the mobility and the articulation on the micro-environment; 4-political and social aspects in connection with activities such as groupal grinding and rock art productions.