Efecto de las Fenotiazinas sobre la vitalidad del Trypanosoma cruzi

La Enfermedad de Chagas, causada por el Tripanosoma cruzi es una parasitosis ampliamente difundida en los países latinoamericanos, constituyendo una patología con un intrincado problema bioecológico y político social. Dado que existen sólo dos drogas tripanocidas aprobadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) efectivas durante la fase aguda de la enfermedad (Nifrutimox, Benznidasol) y con un alto nivel de toxicidad, es que resulta de imperiosa necesidad la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos que presenten menores riesgos y mayores beneficios para el paciente, así como para la quimioprofilaxis de la sangre a transfundir en zonas alejadas de centros de salud de complejidad. Hemos demostrado que algunas fenotiazinas, derivados tricíclicos y usados en la clínica psiquiátrica resultan letales sobre tripomastigotes y epimastigotes de T. cruzi, cepa Tulahuen, produciendo disrupción de membrana celular con liberación del contenido citoplasmático o disrupción de la mitocondria del parásito con la consiguiente alteración en la producción de ATP y la posterior muerte del mismo. Los ensayos "in vivo" han revelado ausencia o disminución de la parasitemia con importante sobrevida de los ratones infectados. El presente plan de trabajo tiene como objetivos: Continuar con los estudios de los efectos de derivados fenotiazínicos (Tioridazina) e iniciar el de otros compuestos (Propanolol), sobre la vitalidad del T. cruzi en diseños "in vitro" e "in vivo". El conocimiento de los mecanismos de acción de los compuestos señalados sobre la biología y composición química del parásito, así como sobre el huésped facilitará el hallazgo de potenciales agentes terapéuticos para la Enfermedad de Chagas experimental.

EPIDEMIOLOGÍA GENÉTICA DEL HUÉSPED HUMANO ASOCIADA A LAS DIFERENTES PRESENTACIONES PATOLÓGICAS DE LA ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR CHAGÁSICA

La enfermedad de Chagas (EC), es una infección parasitaria, causada por el parásito protozoarío Trypanosoma cruzi (T. cruzi), que afecta a millones de personas en América del Sur y Central. Después de la entrada en el huésped vertebrado, el parásito es capaz de infectar una amplia variedad de células. La fase inicial de la infección es llamada fase aguda y es caracterizada por alta parasitemia y parasitismo tisular. A continuación de la fase aguda, el paciente entra en una fase de curso clínico variable, ya que puede presentarse con ausencia de síntomas hasta severos daños cardíacos y gastrointestinales que pueden aparecen muchos años después de la primoinfección. La severidad y prevalencia de las diferentes formas clínicas de la EC varían entre diferentes regiones, las causas de la heterogeneidad epidemiológica y clínica entre los pacientes no están completamente dilucidadas. Es muy probable que, en estos diferentes fenotipos participen tanto la variabilidad genética del parásito como la del individuo infectado. La influencia de las características genéticas del parásito sobre las diversas manifestaciones clínicas ha sido abordada por distintos autores. Podemos especular que, las formas clínicas de la EC, pueden ser el producto de la combinación, de la composición genética del parasito y la del paciente. En la actualidad, pocos grupos estudian la participación de los factores genéticos de los pacientes chagásicos en el desarrollo de la EC. Las observaciones muestran gran disparidad de resultados, posiblemente debido a que los estudios comprenden un número pequeño de individuos y diferentes métodos utilizados para el análisis y clasificación de la patología. Polimorfismos genéticos de marcadores uniparentales: ADNmt (linaje materno) y cromosoma Y (herencia paterna), han demostrado gran utilidad para explorar tanto la variabilidad como las relaciones genéticas y son utilizados ya sea, para estudios de linaje o para investigar la asociación de diferentes haplogrupos con la susceptibilidad a desarrollar enfermedades. El objetivo de este proyecto es identificar una posible asociación entre determinados haplogrupos del ADNmt y del cromosoma Y (CY) con las diferentes presentaciones clínicas de la EC, a fin de detectar marcadores genéticos que contribuyan a describir el fenotipo del paciente chagásico cardiópata. Este trabajo se realizará con pacientes de un área endémica de la provincia de Córdoba (Dpto Cruz del Eje), no emparentados que posean serología positiva para dos o más pruebas de EC y con un seguimiento clínico completo durante varios años que permite clasificarlos en dos grandes grupos: I. Pacientes crónicos con patología cardíaca demostrada, (sintomáticos S). II. Pacientes crónicos sin patología cardiaca demostrada (asintomáticos A). Se analizará la seropositividad a T. cruzi en familias de áreas rurales y urbanas asociada a los grupos S y A. Se describirán los haplogrupos más frecuentes del ADNmt mediante la amplificación y secuenciación de los segmentos hipervariables de la región control. Las secuencias obtenidas serán alineadas y comparadas con las secuencias de Referencias de Cambridge. Se amplificarán 17 loci de secuencias cortas repetidas en tamden (Y-STR). Para el análisis de polimorfismo del CY. A fin de establecer, si existe una relación entre los haplogrupos del ADNmt y del CY en los grupos de las pacientes. Se analizará estaditicamente con que magnitud contribuyen los factores de riesgos clásicos para enfermedades cardiovasculares y el perfil genético del huésped a la variabilidad de la presentación de la EC. El diseño del proyecto es transversal y cuenta con la aprobación del comité de Bioética del Hospital Nacional de Clínicas UNC, y está de acuerdo con la declaración de Helsinski. Todos los pacientes firmaran el consentimiento informado. El material obtenido de cada paciente será utilizado exclusivamente para la determinación de los polimorfismos presentes

Compromiso del metabolismo del hierro en pacientes con enfermedad renal asociada a la infección por VIH

En la infección por VIH, se ha descripto un espectro de enfermedades renales, tales como: falla renal aguda y falla renal crónica debida a glomeruloesclerosis, enfermedad por complejos inmunes y microangiopatía trombótica. La enfermedad renal pueden ser consecuencia de la infección directa de los riñones por el VIH, de coinfecciones o neoplasias o de toxicidad de medicamentos utilizados en el tratamiento de la infección y sus complicaciones. La enfermedad renal asociada a la infección por VIH potencialmente puede exacerbar alteraciones en el metabolismo del hierro que son detectados en individuos con infección pero sin enfermedad renal. El presente proyecto de investigación tiene por objeto principal evaluar parámetros del metabolismo del hierro en pacientes con enfermedad renal asociada a la infección por VIH e identificar marcadores de predicción de enfermedad renal en individuos con infección por VIH. Para ello, se estudiarán individuos en distintos estadíos clínicos e inmunológicos de la infección por VIH en quienes se evaluarán parámetros virológicos, inmunológicos, hematológicos, de función renal y proteínas de fase aguda. Si bien, la incidencia de enfermedad renal ha disminuido debido al uso de la terapia antiretroviral, la prevalencia de enfermedad renal crónica se mantiene elevada. Debido a la mayor expectativa de vida que ha supuesto el tratamiento antiretrovial, transformando a la infección por VIH en una enfermedad crónica, se estima un incremento de enfermedad renal en esta población en las próximas décadas.

Estudios de la Glicoproteina asociada al embarazo

El período de gestación en el humano está asociado con el aumento en la concentración sérica de un grupo de proteínas, consideradas en un principio como específicas del embarazo. Entre éstas, la glicoproteína asociada al embarazo es, cuantitativamente una de las más importantes. Aislada en 1959, ha sido identificada como una proteína inhibidora de proteasas que por su similitud estructural, físico-química y antigénica con Macroglobulina forma con ésta el par de a macroglobulinas análogo al encontrado en otras especies. (...) Recientemente se observó que la M es capaz de formar complejo con el t-PA, igualmente en nuestro laboratorio existen evidencias preliminares de la formación de complejos entre PAG-tPA. Es posible que este fenómeno constituya un mecanismo alternativo de control de procesos proteolíticos, aunque son necesarios estudios básicos y clínicos. (...) Por otra parte, no existen evidencias claras que puedan explicar las diferencias de unión entre el receptor y los complejos M y PAG-proteasas y en cuanto a que compartan el mismo receptor celular. Esto último está avalado por el hecho de que los dominios de reconocimiento del receptor de cada complejo es antigénicamente diferente. (...) Sin embargo, las evidencias son limitadas siendo necesarios estudios con purificada identificando las proteasas involucradas y los intermediarios de las vías de transducción. Objetivos Generales y Específicos: Se pretende conocer algún rol funcional de M mediante estudios de: a) La formación y caracterización de complejos con t-PA y otras serino proteasas; b) Purificación y caracterización de un receptor de PAG-proteinasa, en membranas celulares e identificación de señales de transducción por interacción de los complejos enzima-inhibidor con receptores de monocitos/macrófagos, y c) Su comportamiento como proteína de fase aguda en la pancreatitis aguda.

Regulación de la respuesta inmune

El proyecto se subdividirá en varios subproyectos tendientes a continuar con el análisis de los mecanismos que regulan la respuesta autoinmune y de los mecanismos efectores que conducen al daño tisular en los órganos blanco. Durante el primer año se caracterizarán células presentadoras de antígeno involucradas en la supresión o potenciación de la respuesta autoinmune y se estudiará la inducción de la respuesta autoinmune utilizando GA-liposomas como adyuvante. Se caracterizarán fenotípica y funcionalmente las células de exudado peritoneal (CP) involucradas en la captación y/o presentación del autoantígeno asociado a liposomas. Se estudiará además los efectos del estrés sobre la inmunidad innata, ya que ésta es la base de la defensa de los microorganismos multucelulares y es el resultado de la actividad de diversas células (macrófagos, neutrófilos, natural killer), proteínas séricas (sistema del complemento, proteínas de la fase aguda) y citoquinas. Por otra parte se identificarán el o los autoantígenos responsables de la autoinmunidad debido a que los anticuerpos autoinmunes no cumplen los requisitos para rastrear la librería de cDNA de próstata porque no reconocen proteínas desnaturalizadas; se prevé purificar por inmunoafinidad la proteína autoantigénica y obtener con ella un antisuero heterólogo que sirva para dichos fines. Por otra parte se trabajará con células mononucleares de bazo totales (CmbT) y con células peritoneales (CP) obtenidas de ratas Wistar normales. Se obtendrán a partir de ellas por adherencia a distintos soportes poblacionales enriquecidas en linfocitos T, linfocitos B y macrófagos. En estas poblaciones se evaluará la presencia de la lectina S-lac utilizando técnicas inmunoquímicas e inmunocitoquímicas así como los estímulos que regulan su modulación.

Efecto de la infección con trypanosoma cruzi y nutrición sobre receptores de la inmunidad innata, adipocinas y otros mediadores de inflamación asociados a la obesidad en modelos experimentales.

Este proyecto pretende dilucidar el efecto de infección con Trypanosoma cruzi y dieta hipergrasa/fructosa en la génesis de obesidad e insulino-resistencia y su impacto sobre la aterosclerosis. Esto se abordará en modelos de obesidad in vivo e in vitro, estudiando receptores de inmunidad innata, citocinas/quimiocina, adipocinas y mediadores inflamatorios que participarían en la patogénesis de este proceso, focalizando en tejido graso visceral y adipositos en cultivo celular. Esta investigación avanzaría en el conocimiento de la patogénesis inflamatoria de ateroesclerosis y aportaría bases para sustentar nuevas estrategias terapéuticas destinadas a minimizar las complicaciones cardiovasculares de la obesidad y sus co-morbilidades, entre ellas, la aterosclerosis, una enfermedad devastadora. En el modelo in vivo en ratones machos C57BL/6 salvajes tratados con streptozotocina y alimentados con una dieta hipergrasa/fructosa se inducirá obesidad (IR) y DM2, para: 1- Investigar la influencia de la infección con Trypanosoma cruzi como un potencial factor sinérgico pro-aterogénico. Se evaluará a distintos tiempos post infección, tejido adiposo visceral y repercusiones en aorta y corazón, por histopatología. Se determinará el perfil de lípidos, lipoproteínas y parámetros metabólicos: glucosa/insulina e índice HOMA-IR. Asimismo, se evaluarán ácidos grasos libres y proteínas de fase aguda circulantes como respuesta al proceso inflamatorio. 2- Evaluar la expresión de receptores tipo Toll y scavenger (CD36) en el tejido adiposo visceral y aorta principalmente e identificar los tipos celulares que participan en las lesiones. 3- Determinar las citocinas inflamatorias: TNFalfa, IL1beta, IL12 e IL6 y la quimiocina atractante de monocitos y adipocinas (leptina y adiponectina) en plasma y mediadores inflamatorios:óxido nítrico, especies reactivas del oxígeno y metaloproteasas en adipositos viscerales y aorta. Se cuantificarán moléculas de adhesión intercelular ICAM-1 y VCAM-1. In vitro proponemos: 1- Investigar la influencia de infección con T. cruzi y ácidos grasos saturados/ monoinsaturado y el efecto de LDL oxidadas/agregadas frente a LDL nativas en una línea celular de adipositos. Se estudiará la expresión basal y post-estímulo de receptores innatos tipo Toll y CD 36. 2- Cuantificar adipocinas pro- inflamatorias y antiinflamatorias en sobrenadantes de cultivos frente a estímulos propuestos y la expresión de ICAM-1 y VCAM-1.

Comportamiento de biomarcadores inflamatorios asociados al estrés oxidativo en patologías con componentes vasculares: modelos experimentales

a hiperfibrinogenemia sería un marcador precoz de aterogénesis activando la vía fisiopatológica del oxido nítrico (NO) y L- citrulina en la pared vascular, dicho evento sería un fenómeno temprano y de gran relevancia durante la disfunción endotelial, reflejo del estrés oxidativo (EO) y disminución de las defensas antioxidantes (SOD), repercutiendo sobre la histomorfología vascular y la morfofuncionalidad mitocondrial blanco final de la lesión isquemia aterogénica. El presente proyecto propone estudiar el Síndrome Metabólico y la ateroesclerosis subclínica de acuerdo a parámetros clínicos y bioquímicos en un modelo experimental . El estudio del modelo experimental permitirá explicar los probables mecanismos fisiopatológicos involucrados. Además, se plantea analizar la relación entre los biomarcadores inflamatorios y el estrés oxidativo con el síndrome metabólico asociado a insulinoresistencia para determinar su participación en la aterogénesis. Por otra parte, por el papel preponderante de la inflamación en la generación de la disfunción endotelial y la relación existente entre marcadores inflamatorios y reactantes de fase aguda, como el fibrinógeno, con la aterosclerosis y otras vasculopatías nos proponemos comparar en ratas, un modelo de inflamación vascular en el que se producen lesiones aterogénicas, con un modelo de cefalea por activación trigeminal estudiando el comportamiento del fibrinógeno plasmático (biomarcador de inflamación), ON y L-Citrulina (marcadores de estrés oxidativo), la repuesta antioxidante natural (superóxido dismutasa (SOD)), lesiones aterogénicas y los posibles cambios histopatológicos tanto trigeminales como en vasos de lla neocorteza cerebral y morfofuncionales mitocondriales en ganglios trigéminos

Estudio de los factores infección con trypanosoma cruzi y nutrición sobre receptores innatos tipo toll y scavenger, adipocinas y otros mediadores de inflamación asociados a la obesidad en modelos experimentales.

En el modelo experimental in vivo en ratones C57BL/6 wild type tratados con streptozotocina y alimentados con una dieta grasa/fructosa se inducirá obesidad (IR) y DM2, con el propósito de: 1-Investigar la influencia de la infección con Trypanosoma cruzi como un potencial factor sinérgico pro-aterogénico. Se evaluará a distintos tiempos post infección, el tejido adiposo visceral y las repercusiones en aorta y corazón principalmente, por estudios histopatológicos. En plasma, se determinará el perfil de lípidos, lipoproteínas y otros parámetros metabólicos: glucosa e insulina, estos últimos para calcular el índice HOMA-IR, que refleje el grado de insulino- resistencia. Asimismo, se evaluarán ácidos grasos libres y proteínas de fase aguda circulantes como respuesta al proceso inflamatorio. 2- Evaluar la expresión de receptores tipo Toll (TLR 2, 4 y 9) y scavenger clase B (CD36) en el tejido adiposo visceral y aorta principalmente e identificar los tipos celulares que participan en las lesiones vasculares (macrófagos -M-, granulocitos y linfocitos T). 3- Determinar las citocinas inflamatorias: TNF, IL1-, IL12, IL18, IFN e IL6 y la quimiocina atractante de monocitos (CCL2; MCP-1) y adipocinas (leptina, resistina y adiponectina) en plasma y otros mediadores inflamatorios como óxido nítrico, especies reactivas del oxígeno (ROS) y metaloproteasas (MMPs) en tejido adiposo visceral y aorta. Se cuantificarán además las moléculas de adhesión intercelular ICAM-1 y VCAM-1, involucradas en otros modelos de obesidad e insulino-resistencia. En el modelo in vitro 1- Investigar la influencia de la infección con T. cruzi y ácidos grasos saturados y monoinsaturado (C18, oleico) y el efecto de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas y agregadas frente a LDL nativas (control) en una línea celular de adipositos. Se estudiará la expresión basal y post-estímulo de los receptores innatos tipo Toll y CD 36. 2- Cuantificar las adipocinas pro- inflamatorias (leptina, resistina y MCP-1)y adiponectina (antiinflamatoria) en el sobrenadante de cultivos frente a los estímulos propuestos y la expresión de las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1.