Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción. In vitro Production of Transgenic Bovine Embryos using Intracitoplasmic Sperm Injection (ICSI) and Restriction Enzymes

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas. Genetic engineering and reprogrammed organisms represent the new biotechnological frontiers which will make possible to generate animals with precise genetic modifications for agricultural and biomedical applications. Current methods used to generate genetically modified large animals, lay behind those used in laboratory animals, specially the mouse. Therefore, we seek to develop and optimize protocols to produce transgenic bovine embryos through the use of a non-viral vector. The strategy involves the simultaneous presence inside the cell of a restriction enzyme (I-SceI) and a transgene (carrying cassettes for a fluorescent protein -ZsGreen1- and neomycin phosphotransferase) flanked by restriction sites for the endonuclease. We plan to develop an alternative approach to generate transgenic bovine embryos by coinjecting the transgene flanked by I-SceI restriction sites plus the enzyme I-SceI along with the spermatozoon during the technique known as intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Embryos will be cultured in vitro and inspected daily with a fluorescence microscope to characterize transgene expression. Embryos that reach the blastocyst stage and express the transgene will be surgically transfer to the uterus of a synchronized ewe. After 7 days, the embryos will be flushed out the ovine uterus and transported to the laboratory to determine the number of integration sites and transgene copies by Southern blot. We anticipate that results from this research will set the stage for the development of efficient strategies to achieve precise genetic modifications in large domestic animals for future biotechnological applications.

Aspectos bioquímicos y celulares de la reproducción de los vectores de la enfermedad de Chagas: regulación e importancia fisiológica. Biochemical and cellular aspects of the reproduction of Chagas’ disease vectors: regulation and physiologycal impact

En la hipótesis de trabajo del presente proyecto se considera la importancia del metabolismo de lípidos y proteínas en los insectos hematófagos, en particular en los vectores de la enfermedad de Chagas, para afrontar exitosamente la demanda energética de la reproducción. Las hembras de estas especies pueden ingerir una comida de sangre abundante en lípidos y proteínas, los que son modificados en el intestino para su utilización y posterior almacenamiento en estructuras organizadas en el tejido ovárico, sustentando así el rápido crecimiento de los ovocitos. Estos aspectos resultan críticos para el ciclo de vida del insecto y para el mantenimiento de la cadena epidemiológica de la enfermedad. En estas especies, recientemente hemos caracterizado a nivel bioquímico y celular la interacción entre lipoproteínas y tejidos [Fruttero y col., Insect Biochem. Mol. Biol. 39: 322-331 (2009); Fruttero y col. Biocel 33 (3): 260 (2009)] y las fases del ciclo reproductivo [Aguirre y col., J. Insect Physiol. 54: 393-402 (2008)]. No obstante, los factores que participan en su regulación son aún escasamente conocidos. En este contexto, el estudio propone emplear dos especies de triatominos con el objeto de: (1) caracterizar los factores involucrados en la formación y regulación de reservas nutricionales en los ovocitos; (2) analizar los eventos que participan en la regresión del tejido ovárico: atresia folicular y mecanismos de muerte celular. (3) evaluar el impacto de productos naturales (ureasas vegetales y péptidos derivados) en el desarrollo del tejido ovárico. Para la ejecución de los objetivos se llevarán a cabo ensayos in vivo e in vitro con trazadores fluorescentes, fraccionamiento subcelular, estudios de expresión de proteínas (mRNA y proteína), estudios histo-morfológicos, ultraestructurales e inmunocitoquímicos, microscopía láser confocalizada, ensayos de actividad enzimática, ELISA, western-blot, electroforesis bidimensional, espectrometria de masas en tándem, etc. También se evaluarán los mecanismos de muerte celular (apoptosis/autofagia) mediante microscopía electrónica, detección de apoptosis in situ (TUNEL), inmunofluorescencia, etc. Los resultados obtenidos permitirán un mejor conocimiento sobre la fisiología y bioquímica de estos vectores, los que resultan indispensables en el diseño de nuevas estrategias para su control. Debido a la carencia de un tratamiento específico para la enfermedad y a la falta de métodos preventivos (vacuna), el control del vector es una de las vías más importantes para reducir la incidencia de la enfermedad. Actualmente, la situación socio-económica que sufren amplios núcleos de nuestra población propicia condiciones de vida que facilitan la reproducción de los vectores y la transmisión vectorial del parásito. El estudio permitirá además explorar aspectos bioquímicos y celulares básicos, generando conocimientos que podrían ser extensivos a otros insectos de importancia económica en la ganadería y/o agricultura. The aim of this project is to analyze the biochemical and cellular events involved in the lipid and protein metabolism in Chagas' disease vectors, and to evaluate their impact on the physiology of reproduction, particularly in the formation of nutritional resources in developing oocytes. At present, little is known about these critical aspects for the life cycle of the insect and for the epidemiology of the disease. The experimental approaches, which will be carried out using two species of triatomines, were designed: (1) to characterize factors involved in the formation and regulation of nutritional resources in developing oocytes; (2) to analyze the biochemical and cellular events that play a role during the regression of ovarian tissue, including the processes of oocyte resorption and programmed cell death. (3) to evaluate the impact of natural products (ureases from jackbean and related peptides) in the development of ovarian tissue. Methods and techniques involved in the project are: in vivo and in vitro assays with fluorescent tracers, ELISA, chemical assays, enzyme activities, western-blot; protein expression (mRNA), histological techniques, immunohistochemical and ultrastructural studies. Cell death will be analyzed by detection of apoptosis in situ (TUNEL), immunofluorescence (for autophagy), among others. The results obtained from the study will offer the opportunity to explore important aspects in the biology and physiology of Chagas' disease vectors that could be of potential utility in designing alternative strategies for the control of the insect.