Interacciones Transitorias de Proteínas Solubles con Membranas Lipídicas. Transient interactions of soluble proteins with lipid membranes.

La transferencia de proteínas solubles a la interfase de la membrana lipídica es un paso clave en varios procesos celulares. Esta traslocación resulta en un importante cambio en el ambiente de la proteína con consecuencias sobre su conformación, estabilidad y actividad biológica. En este proyecto estudiamos las condiciones que determinan la unión a la membrana, particularmente el balance entre interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, y los factores que determinan la conformación, estabilidad y dinámica de la proteína en interfaces. Particularmente, estudiaremos la interacción con membranas de la proteína transportadora de ácido cólico de hígado de ave L-BABP, la proteína beta-2 glicoproteína humana y la proteína asociada a microtúbulos SL21. Hemos encontrado que el estado de fase del lípido determina la conformación y estabilidad de L-BABP unida periféricamente. En este proyecto estudiaremos la naturaleza de las interacciones que determinan esta dependencia. beta-2 glicoproteína humana se une a membranas aniónicas e induce cambios estructurales en el lípido cuando ocurre la transición al estado desplegado de la proteína. El proyecto contempla estudiar comparativamente las interacciones del estado nativo y parcialmente desplegado de beta-2 glicoproteína con membranas. Estudiaremos los cambios conformacionales de proteínas y lípidos utilizando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de emisión de fluorescencia y espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Utilizaremos calorimetría diferencial de barrido (DSC) para estudios de estabilidad y espectroscopia de fosforescencia para estudiar dinámica rotacional de proteínas en la membrana.

Caracterización de Compuestos Bioactivos Microencapsulados en Biopolímeros para su Aplicación en la Preservación de Alimentos y en la Formulación de Productos Nutracéuticos.

La exposición a la luz, al aire, a elevadas temperaturas y el almacenamiento prolongado produce alteraciones nutricionales y organolépticas en alimentos. Las modificaciones nutricionales pueden ser causadas por especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales producen oxidación de proteínas, lípidos, vitaminas, etc. Mientras que las alteraciones organolépticas involucran pérdidas del flavor por la generación de compuesto volátil off-flavor, debido principalmente al desarrollo de microorganismos y a oxidaciones. Compuestos bioactivos (CB) tales como carotenoides (Car) y flavonoides (Fl) cumplen relevantes funciones biológicas, entre las que se pueden destacar la capacidad antioxidante, antimicrobiana y antitumoral, entre otras. El propósito de este proyecto es el estudio de propiedades biológicas en particular capacidad antioxidante y antimicrobiana de CB como Car y Fl microencapsulados en biopolímeros para determinar el efecto de los mismos sobre las alteraciones nutricionales y organolépticas en alimentos durante el almacenamiento. Los CB serán microencapsulados por secado por aspersión spray drying, atrapamiento en liposomas o múltiple emulsificación evaporación de solvente, utilizando goma arábica, lecitina o quitosano como materiales de pared. Se estudiará la capacidad de los compuestos bioactivos y de los materiales de pared para desactivar ROS por espectroscopia de absorción UV-Vis. Se determinará la actividad antimicrobiana de los mismos frente a microorganismos especialmente psicrotrofos, por difusión en discos sobre placa de agar previamente inoculadas, por curvas de crecimiento y por ensayos de viabilidad. Posteriormente se analizarán las alteraciones nutricionales y organolépticas en muestras de leche en condiciones de iluminación y temperatura que simulen las de almacenamiento. Para tal fin, se evaluará la estabilidad de proteínas y vitaminas, por electroforesis capilar, la formación de compuestos volátiles se determinará por cromatografía de gases y el desarrollo de microorganismos por recuento estándar en placa. Finalmente se evaluará el efecto de la adición de carotenoides y flavonoides microencapsulados sobre la degradación de proteínas y vitaminas, la formación de off-flavor y el desarrollo de microorganismos durante el almacenamiento de leche. Con este proyecto se pretende determinar tanto la capacidad antioxidante como antimicrobiana de carotenoides y flavonoides puros y microencapsulados, así como de los biopolímeros usado para la microencapsulación y su potencial aplicación como conservantes en leche en la formulación de productos nutracéuticos.

Desarrollo de sistemas nano/micro-particulados con aplicación en la fotodegradación selectiva de contaminantes orgánicos en solución. Development of nano / micro-particles systems with application to selective photodegradation of organic pollutants in solution.

IDENTIFICACIÓN DEL PROBLEMA DE ESTUDIO. Las sustancias orgánicas solubles en agua no biodegradables tales como ciertos herbicidas, colorantes industriales y metabolitos de fármacos de uso masivo son una de las principales fuentes de contaminación en aguas subterráneas de zonas agrícolas y en efluentes industriales y domésticos. Las reacciones fotocatalizadas por irradiación UV-visible y sensitizadores orgánicos e inorgánicos son uno de los métodos más económicos y convenientes para la descomposición de contaminantes en subproductos inocuos y/o biodegradables. En muchas aplicaciones es deseable un alto grado de especificidad, efectividad y velocidad de degradación de un dado agente contaminante que se encuentra presente en una mezcla compleja de sustancias orgánicas en solución. En particular son altamente deseables sistemas nano/micro -particulados que formen suspensiones acuosas estables debido a que estas permiten una fácil aplicación y una eficaz acción descontaminante en grandes volúmenes de fluidos. HIPÓTESIS Y PLANTEO DE LOS OBJETIVOS. El objetivo general de este proyecto es desarrollar sistemas nano/micro particulados formados por polímeros de impresión molecular (PIMs) y foto-sensibilizadores (FS). Un PIMs es un polímero especialmente sintetizado para que sea capaz de reconocer específicamente un analito (molécula plantilla) determinado. La actividad de unión específica de los PIMs en conjunto con la capacidad fotocatalizadora de los sensibilizadores pueden ser usadas para lograr la fotodescomposición específica de moléculas “plantilla” (en este caso un dado contaminante) en soluciones conteniendo mezclas complejas de sustancias orgánicas. MATERIALES Y MÉTODOS A UTILIZAR. Se utilizaran técnicas de polimerización en mini-emulsión para sintetizar los sistemas nano/micro PIM-FS para buscar la degradación de ciertos compuestos de interés. Para caracterizar eficiencias, mecanismos y especificidad de foto-degradación en dichos sistemas se utilizan diversas técnicas espectroscópicas (estacionarias y resueltas en el tiempo) y de cromatografía (HPLC y GC). Así mismo, para medir directamente distribuciones de afinidades de unión y eficiencia de foto-degradación se utilizaran técnicas de fluorescencia de molécula/partícula individual. Estas determinaciones permitirán obtener resultados importantes al momento de analizar los factores que afectan la eficiencia de foto-degradación (nano/micro escala), tales como cantidad y ubicación de foto- sensibilizadores en las matrices poliméricas y eficiencia de unión de la plantilla y los productos de degradación al PIM. RESULTADOS ESPERADOS. Los estudios propuestos apuntan a un mejor entendimiento de procesos foto-iniciados en entornos nano/micro-particulados para aplicar dichos conocimientos al diseño de sistemas optimizados para la foto-destrucción selectiva de contaminantes acuosos de relevancia social; tales como herbicidas, residuos industriales, metabolitos de fármacos de uso masivo, etc. IMPORTANCIA DEL PROYECTO. Los sistemas nano/micro-particulados PIM-FS que se propone desarrollar en este proyecto se presentan como candidatos ideales para tratamientos específicos de efluentes industriales y domésticos en los cuales se desea lograr la degradación selectiva de compuestos orgánicos. Los conocimientos adquiridos serán indispensables para construir una plataforma versátil de sistemas foto-catalíticos específicos para la degradación de diversos contaminantes orgánicos de interés social. En lo referente a la formación de recursos humanos, el proyecto propuesto contribuirá en forma directa a la formación de 3 estudiantes de postgrado y 2 estudiantes de grado. En las capacidades institucionales se contribuirá al acondicionamiento del Laboratorio para Microscopía Óptica Avanzada (LMOA) en el Dpto. de Química de la UNRC y al montaje de un sistema de microscopio de fluorescencia que permitirá la aplicación de técnicas avanzadas de espectroscopia de fluorescencia de molecula individual. Water-soluble organic molecules such as certain non-biodegradable herbicides, industrial dyes and metabolites of widespread use drugs are a major source of pollution in groundwater from agricultural areas and in industrial and domestic effluents. Photo-catalytic reactions by UV-visible irradiation and organic sensitizers are one of the most economical and convenient methods for the decomposition of pollutants into harmless byproducts. In many applications it is highly desirable a high degree of specificity, effectiveness and speed of degradation of specific pollutants present in a complex mixture. In particular nano/micro-particles systems that form stable aqueous suspensions are highly desirable because they allow for easy application and effective decontamination of large volumes of fluids. Herein we propose the development of nano/micro particles composed by molecularly imprinted polymers (MIP) and photo-sensitizers (PS). The specific binding of MIP and the photo-catalytic ability of the sensitizers are used to achieve the photo-decomposition of specific "template" molecules in complex mixtures. Mini-emulsion polymerization techniques will be used to synthesize nano/micro MIP-FS systems. Spectroscopy (steady-state and time resolved) and chromatography (GC and HPLC) will be used to characterize efficiency, mechanisms and specificity of photo-degradation in these systems. In addition single molecule/particle fluorescence spectroscopy techniques will be used to directly measure distributions of binding affinities and photo-degradation efficiency in individual particles. The proposed studies point to a more detailed understanding of the factors affecting the photo-degradation efficiency in nano/micro-particles and to apply that knowledge in the design of optimized systems for photo-selective destruction of socially relevant aqueous pollutants.