Mecanismos neurobiologicos involucrados en la sensibilizacion emocional inducida por abstinencia a drogas de abuso y estrés. Neurobiological mechanisms involved in emotional sensitization induced by withdrawal from drugs of abuse and stress.

El objetivo principal de este proyecto es estudiar los mecanismos neurobiológicos involucrados en el proceso de sensibilización emocional inducido por la abstinencia a drogas de abuso o por la exposición a un estímulo estresante de caracteristicas incontrolables. El modelo animal de sensibilización a utilizar en este proyecto es la facilitación en la formación de memoria de miedo producida por dichos tratamientos. Nuestra hipótesis sugiere que este proceso es el resultado de un mecanismo desinhibitorio de las interneuronas GABAérgicas del complejo basolateral de la amigdala. Por lo tanto se proponen los siguientes experimentos: 1) El estudio del curso temporal del efecto facilitador sobre la formación de una nueva memoria de miedo luego de la abstinencia a drogas o la exposición a un estímulo estresante (inmovilización). 2) La evaluación de la liberación"in vivo" de dopamina del complejo basolateral de la amigdala durante la adquisición y la expresión de la memoria de miedo en animales previamente expuestos a la abstinencia o al estres. 3) El estudio de la infusión local de antagonistas de receptores dopaminérgicos en el complejo basolateral de la amígdala (BLA) o en el nucleo central de la amígdala (CeA) antes del estrés sobre la adquisición y la expresión de una memoria de miedo. 4) La determinación de la actividad de ERK 1/2 y CREB en el complejo basolateral de la amigdala o en el nucleo central de la amígdala durante la adquisición y la expresión de una memoria de miedo en animales abstinentes o estresados. 5)El estudio de la infusión local de inhibidores de la MEK 1/2 en el complejo basolateral de la amigdala o en el nucleo central de la amígdala antes del estrés sobre la adquisición y la expresión de una memoria de miedo. La facilitación para generar memorias de miedo podría ser un componente crítico del síndrome de abstinencia al etanol responsable de las altas tasas de recurrencia asociadas con el alcoholismo. Por lo tanto se investigará el efecto de la evocación de la memoria de miedo sobre la autoadministración de etanol utilizando un paradigma de libre elección entre agua y soluciones de concentración creciente de etanol en animales en abstinencia al etanol. Con el objeto de investigar si las propiedades reforzantes del etanol están involucradas en el potencial aumento de la ingesta de etanol inducido por la evocación de una memoria de miedo, se evaluará el efecto reforzante de etanol utilizando el paradigma de preferencia por un contexto asociado al etanol.

Influencia de aines sobre marcadores de osteoartrosis. Antiinflammatory drugs influence on osteoarthritis markers.

La osteoartritis es una enfermedad crónica y degenerativa del cartílago articular con elevada prevalencia en pacientes mayores de 60. En su etiología confluyen alteraciones mecánicas y bioquímicas del sistema músculo-esquelético que provocan disbalance entre síntesis y degradación condral., con deterioro y pérdida tisular. El cartílago articular es un tejido paucicelular. Sus escasos condrocitos se dispersan en una matriz moduladora bioquímica y morfológica. La homeostasis osteocondral resume acciones estimulantes, inhibidoras y reguladoras de citokinas e interleukinas Son péptídos liberados por las membranas celulares al líquido sinovial, que difunden hacia el cartílago en tanto órgano blanco. Importante avance en la fisiopatología de la inflamación fue el descubrimiento del rol del óxido nítrico (ON) derivado metabólico de la arginina por acción de las ON-Sintasas (ONS). Estimula la producción de colagenasas (MMP-1), que intensifican la resorción de proteoglicanos En OA también aumenta el factor de necrosis tumoral TNFa, rápidamente activado por su enzima convertidora TACE. Objetivo Evaluar efectos de antiinflamatorios sobre cultivo de cartílago articular de pacientes con osteoartritis y cuantificar in vitro producción de MMPs, relación NO2/NO3. IL6 y TNFa. Material y métodos: En sobrenadante de los cultivos se determinarán por espectrofotometría niveles de NO-2 y NO-3 (Griess et al, 1992) y usando ELISA doble sándwich la actividad de colagenasa (MMP-1), IL-6 y TNF-a, contrastadas con anticuerpos monoclonales .Los parámetros obtenidos con y sin agregado de fármacos, se correlacionarán con la microscopía óptica.

Regulación de la actividad funcional tiroidea e interacción con mediadores de la respuesta inmune. Regulation of thyroid functional activity and interaction with mediators of immune response.

TEMA I. MECANISMOS NO CLÁSICOS EN EL CONTROL DE LA BIOSÍNTESIS DE HORMONAS TIROIDEAS. El objetivo general de este aspecto del proyecto es el estudio de los mecanismos bioquímicos y moleculares que regulan la hormonogénesis tiroidea en diferentes condiciones funcionales. En proyectos anteriores hemos demostrado que la endotoxina bacteriana lipopolisacárido (LPS) y el oxido nítrico (NO) inducen modificaciones en la biosíntesis de hormonas tiroideas. En base a estos resultados se propone investigar el mecanismo responsable de la estimulación de la captación de ioduro y la expresión de NIS ejercida por LPS y los factores que regulan la producción de NO en la célula tiroidea. Por otra parte se investigarán posibles factores hormonales reguladores de la absorción de ioduro a nivel intestinal y su relación con el eje hipófiso-tiroideo, así como los mecanismos involucrados en la expresión de NIS en enterocitos. Como extensión con aplicación clínica y en base a la experiencia del grupo en el estudio de proteínas que participan en la biosíntesis hormonal tiroidea, se realizará una pesquisa de posibles mutaciones en el transportador de ioduro en pacientes con Hipotiroidismo congénito.TEMA II. ESTUDIO DEL EFECTO DE LAS HORMONAS TIROIDEAS EN LA INICIACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE EN RATÓN. INTERACCIÓN CON GLUCOCORTICOIDES. En nuestro grupo demostramos recientemente un efecto novel de las hormonas tiroideas sobre la maduración/función de células presentadoras de antígenos especializadas: células dendríticas (DC), derivadas de médula ósea de ratón. En este proyecto se propone: 1) profundizar el mecanismo molecular involucrado en el efecto de triiodotironina (T3) sobre DC: rol del receptor de T3-señalamiento intracelular; capacidad de DC tratadas con T3 de estimular la citotoxicidad antígeno-específica; estrategia de vacunación en el tratamiento antitumoral. Por su parte, también previamente demostramos la característica de los glucocorticoides (GC) de interaccionar con el mecanismo de acción de las hormonas tiroideas en la expresión final de los efectos T3-específicos. Considerando el uso terapéutico de los GC en diversos estados clínico-patológicos inmunes, se propone: 2) Estudio del efecto de dexametasona (GC de síntesis) sobre el mecanismo de acción de T3 a nivel de DC.

Mecanismos apoptóticos desencadenados por vitamina D y drogas que deplecionan glutatión en células de cáncer de mama. Apoptotic mechanisms triggered by vitamin D and glutathione depleting drugs in breast cancer cells.

El cáncer de mama es una de las neoplasias más frecuentes de nuestro medio. El calcitriol y sus análogos son una alternativa nueva al uso convencional de antiestrógenos como quimioterapia. Sin embargo, los efectos hipercalcemiantes, secundarios a su aplicación, constituyen una limitación para su uso. Este proyecto está orientado al conocimiento de las bases moleculares antiproliferativas del uso del calcitriol en forma conjunta con drogas que deplecionan glutatión (GSH) tales como menadiona (MEN) y DL-butionina-S,R-sulfoximina (BSO). La hipótesis que se sostiene es que MEN y BSO, al disminuir el contenido de GSH, generan estrés oxidativo el cual puede potenciar el efecto antineoplásico del calcitriol, permitiendo lograr un mayor efecto antiproliferativo con dosis menores del secoesteroide, evitándose los efectos hipercalcemiantes. El objetivo general de este proyecto es dilucidar los mecanismos moleculares de apoptosis desencadenados por calcitriol (D) y/o drogas que deplecionan GSH (MEN o BSO) sobre las células de cáncer de mama MCF-7 en cultivo. Para ello, se tratarán células MCF-7 con concentraciones variables de D (en ausencia y presencia de MEN ó BSO) a diferentes tiempos. Se medirá proliferación celular mediante las técnicas de incorpororación de bromodeoxiuridina y de violeta de cristal. Se analizará el ciclo celular por medio de técnicas de citometría de flujo. Se determinará la participación tanto de la vía intrínseca como de la vía extrínseca de apoptosis. El contenido de GSH y la medición de las actividades del sistema antioxidante se llevará a cabo con técnicas espectrofotométricas. La expresión proteica de diversas caspasas se analizará por Western blots y la expresión génica por transcriptasa reversa-reacción en cadena de la polimerasa. Además, se desarrollarán artificialmente tumores de mama en ratas y se aplicará el tratamiento combinado midiéndose el efecto antitumoral mediante análisis histológicos. Se espera que el tratamiento combinado inhiba la proliferación de las células MCF-7, a través de incremento en la producción de especies reactivas derivadas del oxígeno involucrando la participación de las principales vías apoptóticas, extrínseca e intrínseca. En consecuencia, habría desrregulación de la función mitocondrial. Las defensas antioxidantes podrían estar alteradas. De ocurrir así, el tamaño de los tumores de mama desarrollados experimentalmente y tratados con el tratamiento combinado, estaría disminuido. La importancia de este estudio consiste en la exploración de una nueva estrategia terapéutica para el tratamiento de cáncer de mama.

Mecanismo de interacción, calcio dependiente, entre Calcineurina y PERK, involucrado en el Estrés de Retículo Endoplásmico. Ca2+ -dependent mechanism of interaction between Calcineurin and PERK involved in Endoplasmic Reticulum Stress.

El Estrés de Retículo Endoplásmico (RE) es inducido por la acumulación de proteínas sin plegar en el lumen de la organela. Esto se puede observar en diversas situaciones fisio-patológicas como durante una infección viral o en proceso isquémico. Además, contribuye a la base molecular de numerosas enfermedades ya sea índole metabólico (Fibrosis quística o Diabetes Miellitus) o neurodegenerativas como mal de Alzheimer o Parkinson (Mutat Res, 2005, 569). Para restablecer la homeostasis en la organela se activa una señal de transducción (UPR), cuya respuesta inmediata es la atenuación de la síntesis de proteína debido a la fosforilación de subunidad alpha del factor eucariótico de iniciación de translación (eIF2α) vía PERK. Esta es una proteína de membrana de RE que detecta estrés. Bajo condiciones normales, PERK está inactiva debido a la asociación de su dominio luminar con la chaperona BIP (Nat Cell Biol, 2000, 2: 326). Frente a una situación de estrés, la chaperona se disocia causando desinhibición. Recientemente, (Plos One 5: e11925) se observó, bajo condiciones de estrés, un aumento de Ca2+ citosólico y un rápido incremento de la expresión de calcineurina (CN), una fosfatasa citosólica dependiente de calcio, heterodimérica formada por una subunidad catalítica (CN-A) y una regulatoria (CN-B). Además, CN interacciona, sin intermediarios, con el dominio citosólico de PERK favoreciendo su trans-autofosforilación. Resultados preliminares indican que, astrocitos CNAβ-/- exhibieron, en condiciones basales, un mayor número de células muertas y de niveles de eIF2α fosforilado que los astrocitos CNAα-/-. Hipótesis: CNAβ/B interacciona con PERK cuando el Ca2+ citosólico esta incrementado luego de haberse inducido Estrés de RE, lo cual promueve dimerización y auto-fosforilación de la quinasa, acentuándose así la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteínas. Esta activación citosólica de PERK colaboraría con la ya descrita, desinhibición luminal llevada cabo por BIP. Cuando el Ca2+ citosólico retorna a los niveles basales, PERK fosforila a CN, reduciendo su afinidad de unión y disociándose el complejo CN/PERK. Objetivo general: Definir las condiciones por las cuales CN interacciona con PERK y regula la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteína. Objetivos específicos: I-Estudiar la diferencia de afinidades y dependencia de Ca2+, de las dos isoformas de CN (α y β) en su asociación con PERK. Además verificar la posible participación de la subunidad B de CN en esta interacción. II-Determinar si la auto-fosforilación de PERK es diferencialmente regulada por las dos isoformas de CN. III-Discernir la relación del estado de fosforilación de CN con su unión a PERK. IV-Determinar efectos fisiológicos de la interacción de CN-PERK durante la respuesta de Estrés de RE. Para llevar a cabo este proyecto se realizarán experimentos de biología molecular, interacción proteína-proteína, ensayos de fosforilación in vitro y un perfil de polisoma con astrocitos CNAβ-/- , CNA-/- y astrocitos controles. Se espera encontrar una mayor afinidad de unión a PERK de la isoforma β de CN y en condiciones donde la concentración de Ca2+ sea del orden micromolar e imite niveles del ión durante un estrés. Con respecto al estado de fosforilación de CN, debido a los resultados preliminares, donde solo se la encontró fosforilada en condiciones basales, se piensa que CN podría interactuar con mayor afinidad con PERK cuando CN se encuentre desfosforilada. Por último, se espera encontrar un aumento de eIF2α fosforilado y una acentuación de la atenuación de la síntesis de proteína como consecuencia de la mayor activación de PERK por su asociación con la isoforma β de CN en astrocitos donde el Estrés de RE se indujo por privación de oxigeno y glucosa. Estos experimentos permitirán avanzar en el estudio de una nueva función citoprotectora de CN recientemente descrita por nuestro grupo de trabajo y sus implicancias en un modelo de isquemia. The accumulation of unfolded proteins into the Endoplasmic Reticulum (ER) activates a signal transduction cascade called Unfolding Protein Response (UPR), which attempts to restore homeostasis in the organelle. (PKR)-like-ER kinase (PERK) is an early stress response transmembrane protein that is generally inactive due to its association with the chaperone BIP. During ER stress, BIP is tritrated by the unfolded protein, leading PERK activation and phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha (eIF2alpha), which attenuates protein síntesis. If ER damage is too great and homeostasis is not restored within a certain period of time, an apoptotic response is elicited. We recently demonstrated a cytosolic Ca2+ increase in Xenopus oocytes after induce ER stress. Moreover, calcineurin A/B, a an heterotrimeric Ca2+ dependent phosphatases (CN-A/B), associates with PERK increasing its auto-phosphorylation and significantly enhancing cell viability. Preliminary results suggest that, CN-Aβ-/- knockout astrocytes exhibit a significant higher eIF2α phosphorylated level compared to CN-Aα-/- astrocytes. Our working hypothesis establishes that: CN binds to PERK when cytosolic Ca2+ is initially increased by ER stress, promoting dimerization and autophosphorylation, which leads to phosphorylation of elF2α and subsequently attenuation of protein translation. When cytosolic Ca2+ returns to resting levels, PERK phosphorylates CN, reducing its binding affinity so that the CN/PERK complex dissociates. The goal of this project is to determine the conditions by which CN binding to PERK attenuates protein translation during the ER stress response and subsequently, to determine how the interaction of CN with PERK is terminated when stress is removed. To perform this project is planed to do molecular biology experiments, pull down assays, in vitro phosphorylations and assess overall mRNA translation efficiency doing a polisome profile.

Problemáticas de la interacción discursiva en la enseñanza y el aprendizaje de las Ciencias Naturales. Aportes didácticos. Interaction discoursive issues in teaching and learning Natural Sciences. Didactic contributions

Las didácticas específicas de las ciencias naturales revelan diferentes problemáticas en su enseñanza y aprendizaje en los diferentes niveles del sistema educativo. En particular, en las clases de ciencias la interacción discursiva docente alumnos adquiere relevancia, ya que el proceso de comunicación del conocimiento es uno de los pilares didácticos, junto a la trasposición del mismo. Especificamente, en este proyecto nos abocamos a aquellas intervenciones de docentes y alumnos que se relacionan con la construcción del conocimiento biológico y químico. El proyecto se enmarca en una actual linea de trabajo que indaga sobre las dificultades en los abordajes del conocimiento científico en las aulas, las características del discurso entre docentes y alumnos, las habilidades y dificultades en la comprensión de los enunciados de problemas y las características de los textos que se utilizan en las clases. Se focaliza este estudio en casos que intentan dar respuesta a tres temáticas, agrupadas en un conjunto de situaciones de investigación relacionadas con la interacción discursiva docente-alumno, retomando el rol del docente al hablar, guiar o diseñar las situaciones de referencia para el aprendizaje de los alumnos. Los casos son: 1- En cuanto a las concepciones sobre diversidad biológica en estudiantes de escuela secundaria y en textos académicos, atendemos a cómo la escuela presenta los contenidos ecológicos como un conjunto de dogmas y conceptos estáticos. Además suelen simplificarse conceptualmente y presentarse poco actualizados. Es por ello que se planea estudiar las concepciones y actitudes de los alumnos de secundaria sobre la biodiversidad, cómo estas dificultan su comprensión y los textos usados en relación a la promoción de la transposición didáctica. 2- En relación a cómo se elabora el patrón temático del tema célula en clases de Biología, se analizarán las diferentes estrategias de significados y de desarrollo temático, que se emplean en la comunicación aulica. Se intentará establecer si hay cambios en el desarrollo temático a medida que se avanza en la escolaridad. Esto es porque se puede apreciar que muchos de los problemas de aprendizaje del alumnado se deben a un desconocimiento tanto del patrón temático como del patrón estructural de la ciencia, siendo preciso evocar los patrones temáticos que se quieren utilizar, para construir un conocimiento compartido. 3-Finalmente, en los enunciados de problemas de Química, se analizarán las dificultades de comprensión lectora de alumnos de Ingeniería. Los docentes frecuentemente atribuyen los problemas a deficiencias en la instrucción recibida, sin considerarse los conocimientos previos del alumno, los obstáculos conceptuales originados en el tema, las deficiencias en la habilidad lectora, el tipo textual predominante en la consigna, el formato en el que se escribió la consigna y los factores personales, etc., siendo que la comprensión del enunciado de una consigna de trabajo condiciona fuertemente la posibilidad de su resolución. Los tres casos utilizarán metodologías cualitaritas que incluyan análisis de contenido en discursos orales y escritos. Los datos se registrarán desde observación no participante, registro etnográfico y con grabaciones de audio. Se espera contribuir al conocimiento, realizando aportes a la formación docente en tanto las estrategias discursivas que se emplean en el aula, en forma oral y en la escrita, conocer concepciones que dificultan o favoren la construcción del conocimiento científico, entre otras. Los productos de estos estudios estarán integrados por nuevos desarrollos para la formación docente, publicaciones científicas de impacto nacional e internacional, presentaciones a congresos, materiales didácticos y divulgativos, dictado de seminarios y/o cursos, redacción de informes a las escuelas intervinientes.. The specific Natural Sciences didactics show different problems in teaching and learning along the school system. In particular, the discourse used to communicate knowledge in Science lessons becomes important. With this project we will focus on the teachers and students actions regarding the construction of biological and chemical knowledge. This project attempts to answer these issues and brings together a range of research situations related to teacher-student interaction, through discourse, taking up the role of the teacher to speak, to plan and to guide student learning. We will study the ideas and attitudes of high school students about biodiversity that make difficult its understanding and the textbooks used in relation to promotion of the didactic transposition. In addition, regarding how the thematic pattern in biology classes is costructed, it will be analyzed the different meaning and thematic development strategies that are used in communication. We will attempt to establish whether there are any changes in the thematic development throughout high school education. Finally, we will analyze the reading comprehension problems in engineering students. Teachers frequently attribute these issues to deficiencies in prior education, without considering the students background, the conceptual obstacles arising in the field, the format in which the prompt is written, personal factors, etc., keeping in mind that the outcome of an activity is strictly dependant con the prompt understanding. We expect to make contributions to the teacher education in both the discourse strategies used in the classroom, orally and in writing, to learn about the conceptions that hinder or favor the knowledge construction, among others. The products of this study will be national and international impact scientific publications, conference presentations, popular science publications, seminars courses and reports to the schools involeved.