Regulación transcripcional y relación entre estructura y función de proteínas relacionadas con el metabolismo de colina en Pseudomonas aeruginosa. Transcriptional regulation and relationship between structure and function of proteins related with the choline metabolism in Pseudomonas aeruginosa.

El objetivo general de este proyecto es dilucidar los mecanismos de acción a nivel molecular de enzimas y proteínas involucradas en el metabolismo de colina en Pseudomonas aeruginosa, con énfasis en la identificación de residuos aminoacídicos críticos y regulación de la expresión de los genes en estudio. Los objetivos específicos que se palntean involucran abordajes bioquímicos y moleculares y serán llevados a cabo mediante técnicas de biología molecular y bioquímica (mutación sitio-dirigida, deleción génica, expresión y purificación de proteínas, fusión transcripcional a genes reporteros, etc). Planteo de hipótesis: las proteínas que se inducen por colina (fosforilcolina fosfatasa (PchP), fosfolipasa C (PlcH), acetilcolinestera (AchE), proteínas periplásmicas unidoras de colina (PUch) podrían compartir: a) una organización génica y responder a la regulación por proteínas regulatorias o a factores ambientales de manera similar; b) residuos aminoacídicos conservados que intervengan en la unión o interacción con diferentes ligandos, principalmente, colina. Para ello, se plantean los siguientes Objetivos Específicos: 1) identificar las zonas promotoras de los genes que codifican para PchP, PlcH, AchE y PUch, a fin de localizar posibles sitios de unión a proteínas reguladoras y los factores ambientales que afectan la actividad promotora. 2) determinar en las proteínas mencionadas los residuos aminoacídicos de importancia involucrados en la catálisis y en la interacción con ligandos, principalmente en la unión a compuestos de alquilamonio; 3) Se iniciarán estudios que demuestren la relación entre la inducción por colina de varios factores de patogenicidad la virulencia del microorganismo, empleando mutantes simples o múltiples en estos factores y como modelo de patogenicidad el nematodo C. elegans. A partir de los resultados obtenidos se pretende tener un conocimiento profundo sobre la regulación molecular y bioquímica de varias enzimas comprometidas en la patología que produce P. aeruginosa. Esto más el conocimiento de la fisiología de este microorganismo abre el camino para la búsqueda de posibles blancos de acción de drogas. Por otro lado, se espera tener un conocimiento integral sobre la regulación de la expresión de las actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo de colina y la respuesta de P. aeruginosa ante la presencia de compuestos de alquilamonio utilizados como nutrientes. Se espera conocer el papel que desempeña cada uno de los sitios de unión a los diferentes ligandos para el funcionamiento y control de las enzimas mencionadas y explicar el comportamiento diferencial de las enzimas frente a distintos sustratos y otros ligandos. El conocimiento de los sitios de unión a compuestos de alquilamonio permitirá encontrar esos dominios en diferentes proteínas del género Pseudomonas y otras bacterias Gram negativas. Desde el punto de vista evolutivo, se podrá comparar la similitud de los sitios de unión a colina entre proteínas de organismos eucariotas con procariotas (ej. PUch de bacterias Gram positivas, transportadores de colina, proteína C reactiva, AchE de eucariotas contra las encontradas en bacterias del género Pseudomonas, fosfolipasas A, C o D, etc.). Este proyecto permitirá concretar al menos dos tesis doctorales (Sanchez, Otero) más varios trabajos finales de grado (tesinas) que son y serán realizados por alumnos de la carrera de Microbiología en la UNRC. Les permitirá a los doctorandos y a los alumnos de grado adquirir una formación bastante integral ya que utilizarán herramientas de la fisiología general bacteriana, de la bioquímica clásica, de la biología molecular y de la bioinformática.