Vacunación en la Enfermedad de Chagas experimental: estudio de mediadores involucrados en la protección en ratones y aplicación de la vacuna en perros. Vaccination in experimental Chagas'disease: study of intermediates involved in the protection of mice and application of the vaccine in dogs.

La Enfermedad de Chagas es una de las principales endemias de América Latina donde existen cerca de 18 millones de infectados y 90 millones en riesgo. Entre el 25 y el 30 por ciento desarrolla patología cardíaca o digestiva en el período crónico. Se ha postulado que mecanismos autoinmunes, sumados a la acción directa del parásito, podrían estar involucrados en la patogenia de la enfermedad. El desarrollo de vacunas tradicionales en Enfermedad de Chagas es una meta difícil de alcanzar, por lo cual parece más factible abordar estrategias basadas en la inmunomodulación, para disminuir la carga parasitaria, minimizar las acciones deletéreas en el periodo agudo y prevenir el desarrollo de patología en la etapa crónica. Para ello es necesario avanzar en el conocimiento de los mecanismos involucrados en la protección y en la patogenia. Si se acepta la hipótesis autoinmune, una estrategia de vacunación con un tripanosoma antigénicamente similar al T. cruzi pero no patógeno podría evitar posibles mecanismos autoagresivos. En nuestro Laboratorio se ha empleado un modelo de vacunación en ratones utilizando como inmunógeno el Trypanosoma rangeli, no patógeno en humanos. Los ratones vacunados, infectados con T. cruzi, mostraron buena respuesta inmune celular y humoral, bajas parasitemias, ausencia de lesiones histológicas, y sobrevida cercana al 100 por ciento. Los controles no vacunados tuvieron una elevada mortalidad. Debido al ciclo biológico del parásito, la defensa efectiva contra el T. cruzi requiere una potente respuesta de anticuerpos contra las formas extracelulares y una eficaz respuesta celular contra los amastigotes intracelulares. En el modelo desarrollado en nuestro laboratorio la protección se asocia con un adecuado equilibrio entre respuesta TH1 y TH2, con leve predominio TH1, disminución de citoquinas (Ck) proinflamatorias e incremento de receptores solubles de Ck. El esquema de inmunización demostró asimismo su eficacia en cobayos y en perros mantenidos en el Laboratorio. Hipótesis de trabajo: - La vacunación con T. rangeli desencadena mecanismos inmunomodulatorios que protegen de la infección con T. cruzi, entre los cuales se encuentran eventos que actúan tempranamente en el sitio de inoculación y en los que están involucradas células y moléculas del sistema inmune innato. - La vacunación a perros constituye una nueva herramienta en la lucha contra la Enfermedad de Chagas. Objetivos: i) profundizar el estudio tendiente a dilucidar los mecanismos involucrados en la resistencia inducida por la inmunización con T. rangeli en ratones; ii) estudiar el efecto que tiene el estrés físico de los ratones sobre la eficacia de la vacunación y iii) analizar la inmunogenicidad de la vacuna en perros de zonas endémicas para Enfermedad de Chagas. Material y metodos: Los ratones y perros serán vacunados con tres dosis de epimastigotes de T. rangeli, fijados con glutaraldehido y los controles solo recibirán PBS. Los ratones seran desafiados con T. cruzi. Se estudiará en liquido peritoneal: a) poblaciones celulares por Citometria de flujo; b) cuantificación de los distintos tipos de inmunoglobulinas, de citoquinas y sus receptores solubles, por ELISA, c) ON y arginasa, por técnicas colorimetricas; d) est.udio de la interacción macrófago-parásito y de receptores celulares por Inmunofluorescencia. e) En perros, se realizarán estudios parasitológicos (xenodiagnostico) y serológicos en vacunados y controles, 12 y 24 meses post vacunación. Resultados esperados e importancia del proyecto: se espera conocer los principales eventos tempranos que participan en la eliminación de los parásitos en los animales vacunados, el efecto del stress sobre la vacunación y asimismo, la inmunogenicidad de la vacuna en perros de campo. Todo ello permitirá obtener información sobre la eficacia de la vacunación experimental y podría aportar una herramienta adicional contra la Enfermedad de Chagas, interfiriendo en la cadena epidemiológica en áreas endémicas.

Procesos adaptativos y dimensiones del comportamiento biosocial en cazadores recolectores del SW de la provincia de La Pampa.

Resumen del proyecto: Este resumen se incluirá en la base de datos de la Biblioteca Digital del Ministerio, por lo que se debe elaborar el mismo sobre la base de la siguiente estructura y completar todos los campos que se indican a continuación: identificación y caracterización del problema objeto del estudio, hipótesis, planteo de objetivos, materiales y métodos a utilizar, resultados esperados, importancia del proyecto (extensión del campo 4000 caracteres). Proyecto diseñado para aportar al conocimiento de los procesos adaptativos y la dinámica biosocial de las sociedades del pasado prehistórico argentino. Propone analizar y evaluar el potencial documental de los restos bioarqueológicos con fehaciente asociación contextual para posibilitar la realización de inferencias sobre procesos biosociales de naturaleza adaptativa o no adaptativa. Está centrado en el análisis osteológico y biocultural de materiales esqueletales (aproximadamente cien individuos) correspondientes a poblaciones aborígenes prehistóricas del actual territorio de la provincia de La Pampa (Médano Petroquímica, Departamento Puelén). Entre otros muchos aspectos, la importancia de estos materiales reside en que son asignables a sociedades con economía cazadora-recolectora y cuya cronología corresponde al Holoceno tardío final (Entierros datados en 393 ± 41 cal AP AMS.), una época particularmente interesante por la dinámica sucesión de eventos socioculturales y poblacionales que la caracterizan. La evidencia recuperada da cuenta de prácticas funerarias complejas que consisten en la realización de enterratorios colectivos, indirectos, secundarios, y presencia de eventos de violencia y/o tensión social. Los métodos y técnicas consisten en la descripción e identificación basados en observación y registro de marcadores esqueléticos conforme a prácticas estándares de nuestro laboratorio: Planillas de observación y registro durante excavaciones de la Archaeological Summer Field School (ASFS) de la Universidad de Chicago y planillas de los “Standards” de Buikstra y Ubelaker, modificadas y adaptadas por nuestro grupo de trabajo, entre otros). Los datos obtenidos serán empleados para graficación (estadística descriptiva) y también se realizará sobre ellos análisis multivariados y estadística no paramétrica (etapa inferencial). Se tendrán en cuenta aspectos descriptivos y analíticos vinculados con el reconocimiento de la edad y el sexo, hábitos dietarios (marcadores morfológicos y químicos de hueso y dientes), economía de subsistencia, patrones de diferenciación social, exploración de eventuales relaciones de parentesco, roles vinculados con el sexo, el uso del cuerpo, dieta, salud y enfermedad, en relación con la economía de subsistencia, etc. (Buikstra y Beck 2006, Larsen, 1997, White y Folkens 2000). Dado la naturaleza y complejidad de los hallazgos, caracterizados por la conformación de entierros colectivos secundarios e indirectos, un capítulo de interés lo constituye el análisis de las dimensiones sociales del comportamiento mortuorio y la discusión de los indicadores de violencia y/o tensión social asociados a los hallazgos (O´Shea 1984, Rakita et al. 2005, entre otros). Dado el hecho de que se cuenta con la disponibilidad de materiales adecuados para este tipo de estudios, la información relevante y los datos a analizar serán obtenidos mediante la aplicación de métodos y técnicas bioarqueológicas específicas antes mencionados, con la finalidad de observar y discutir tendencias y proponer modelos de interpretación sujetos a ulterior validación, particularmente toda vez que se cuente con una mayor representación numérica y casuística tanto a nivel de individuos como de sitios bioarqueológicos excavados. El proyecto se enmarca en la firma de un Convenio Específico de Trabajo entre la UNRC y el Gobierno de La Pampa. Palabras clave: Ingrese hasta 5 palabras clave, distintas de las utilizadas en el título del proyecto y que describan la naturaleza del objeto de estudio. bioarqueología economía cazadora-recolectora adaptación biosocial comportamiento mortuorio Violencia y tensión social. Abstract: Resumen del proyecto en inglés (extensión del campo 2000 caracteres). This project has been designed to improve the knoledge on adaptive processes and biosocial dynamics among aborigine past societies in Argentina. This research is focused on the analysis and evaluation of documentary potential of bioarchaeological skeletal remains with reliable contextual associations. It is specifically centered in the osteological as well as cultural analysis of more than one hundred skeletons from native prehistoric populations from a prehistoric collective burial site in La Pampa province. (Médano Petroquímica, Departamento Puelén). Among other aspects, the importance of the materials to be analyzed lies in the fact that they correspond to a subsistence economy based on hunting and gathering, and have been chronologically assigned to Late Holocene times (burials dated 393 ± 41 cal AP AMS), a period denoting particular interest due to the dynamic succession of sociocultural events that characterized it. Evidence so far recovered accounts for complex funerary practices consisting of indirect, secondary collective burials, as well as the presence of events of violence and/o social tension. Methods and techniques consist in the description and identification based on the observation, and recording of skeletal markers, according to laboratory as well as field work standards: The University of Chicago Archaeological Summer Field School (ASFS) forms, and the “Standards” forms from Buikstra y Ubelaker (1994), modified and adapted by our research team, among others. Data obtained shall be used for graphic (descriptive statistics) as well as multivariate analyses and non parametric statistics (inferential stage). Descriptive as well as analytical aspects such as those related to age and sex determination, feeding habits (morphological as well as chemical markers of bones and teeth), subsistence economy, patterns of social differentiation, kinship patterns, sex-linked roles, body use, diet, health and disease, all of them in close relationship with the hunter-gatherer subsistence economy (Buikstra y Beck 2006, Larsen, 1997, White y Folkens 2000). Given the nature and complexity of the burial disposals, characterized by complex collective burials, a core chapter of our interest is that of social dimensions of mortuary behavior as well as the discussion and interpretation of markers of violence and/or social tension. Given the amount of evidence gathered so far, relevant information as well as data to be analyzed will be obtained by specific bioarchaeological methods and techniques, trying to observe and discuss possible trends as well as to formulate interpretive models to be verified or rejected with the arrival of new, reliable data both at individual level as well as at the archaeological sites to be excavated. This project has been particularly considered in a bilateral agreement between UNRC and the Government of La Pampa Province.

PARTICIPACIÓN DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO EN LA RESPUESTA DE CARDIOMIOCITOS DURANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON TRYPANOSOMA CRUZI. Characterization of the cardiac innate immune response during Trypanosoma cruzi experimental infection.

La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, constituye la principal miocarditis infecciosa a nivel mundial. Crecientes evidencias revelan que la respuesta inmune innata tendría un rol determinante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. La inmunidad innata es la primera línea de defensa, no específica, preprogramada para combatir agentes infecciosos. Este sistema censa la presencia de antígenos extraños a través de los receptores tipo toll (TLR) produciendo citoquinas y activando mecanismos microbicidas. Sin embargo, los TLRs también se hayan distribuidos en las células parenquimales no inmunes, jugando un importante rol tanto en la defensa como en la homeostasis de cada tejido. Durante la etapa aguda de la infección, el T. cruzi invade y se replica dentro de una amplia variedad de células y tejidos. Pero posteriormente, los parásitos son efectivamente eliminados de la mayoría de los tejidos persistiendo durante toda la vida en las células del músculo cardíaco y esquelético de los pacientes infectados. Debido a que el mantenimiento de la célula cardíaca infectada es crítica para la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos que participan en la sobrevida de los cardiomiocitos están siendo foco de nuestro estudio. Hemos demostrado, que la infección ejerce efectos antiapoptóticos sobre células cardíacas aisladas. Nuestra hipótesis es que la inmunidad innata cardíaca estaría involucrada en el mantenimiento de la sobrevida de los miocitos así como en la defensa contra el parásito. Objetivo general: determinar la participación de la respuesta inmune innata cardíaca en el desarrollo de la enfermedad de Chagas experimental murina. Objetivos específicos: 1) Analizar el compromiso de TLRs en la respuesta anti-apoptótica y de autofagia de cardiomiocitos aislados de ratones salvajes y de ratones deficientes en TLR4, TLR2 y en MyD88, molécula adaptadora de la señalización por TLRs, sometidos a la infección con el parásito. 2) Determinar la importancia de la actividad cisteín proteasa parasitaria en el grado de infectividad y la sobrevida de cultivos primarios de ratones salvajes infectados con parásitos transgénicos que poseen disminuída o nula actividad cisteín proteasa. 3) Establecer la cinética de expresión de TLR2/TLR6, TLR4 y TLR9, factores antiapoptóticos (Bcl-2, Bcl-xL, etc.), daño cardíaco y la carga parasitaria en el tejido cardíaco de ratones infectados salvajes y/o deficientes antes mencionados. Materiales y Métodos: Los animales serán infectados i.p. con 5x103 parásitos y se determinará la cinética de expresión de los mediadores mencionados por western blot e inmunofluorescencia, la carga parasitaria será determinada por qRT-PCR. Como controles se procesarán animales inyectados con solución salina. En cultivos primarios de cardiomiocitos de ratones neonatos salvajes y deficientes infectados se estudiará la carga parasitaria, la activación de los mecanismos microbicidas (producción de óxido nítrico, metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, ciclooxigenasa, etc.), producción de citoquinas y expresión de moléculas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, etc.). Se explorará la tasa de apoptosis en cultivos deprivados de suero. La autofagia se analizará por microscopia electrónica. Cultivos controles serán mantenidos en medio o tratados con ligandos de los diferentes TLRs. Resultados preliminares sugieren que tanto TLR2 como Bcl-2 se incrementan en tejido cardíaco infectado. Esto nos lleva a profundizar en los mecanismos observados en cultivos y estudiarlos en un modelo in vivo, analizando la posible importancia que tiene la inmunidad innata cardíaca en el control del establecimiento de la infección. La comprensión de los mecanismos que mantienen la sobrevida de los cardiomiocitos y su respuesta a la infección es importante ya que el conocimiento de las bases moleculares es fundamental para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. Chagas disease is endemic in Central and South America and causes the most common myocarditis worldwide. We have previously reported that the cardiotrophic parasite Trypanosoma cruzi, its etiological agent, protects cardiomyocytes against apoptosis induced by growth factor deprivation activating the PI3K/Akt and MEK1/ERK signaling pathways. Recent studies have shown that local innate immunity plays a key role in initiating and coordinating homeostatic as well as defense responses in the heart. One of the mechanisms by which the innate immune system senses the presence of foreign antigens is through TLRs. The stimulation of these receptors leads to the activation and nuclear translocation of NF-kB transcription factor and the production of cytokines. Proinflammatory cytokines, in turn, appear to play a central role in the orchestration and timing of the intrinsic cardiac stress response providing, under different situations, instantaneous anti-apoptotic cytoprotective signals, which allow tissue repair and/or remodeling. The aim of the present project is to study the cardiomyocyte innate immune responses to T. cruzi infection and its role in target cell protection from apoptosis. Specific objectives: 1) Study the mechanism triggered by TLR in the anti-apoptotic response and parasite load of infected cardiomyocyte primary cultures from wild type and mice deficient in TLR2, TLR4 or MyD88. 2) Determine the effect of parasite cisteín protease activity on primary cultures from wild type mice. 3) Determine the TLR signaling-involvement in parasite load and survival indicators in deficient mice. Preliminary results showed us that cardiac-TLR2 may be involved in the anti-apoptotic effect elicited by the parasite and prompted us to establish the mechanisms triggered by the innate immunity that mediate parasite persistence within the host cell.