2 resultados para Ca2 Release
em Cor-Ciencia - Acuerdo de Bibliotecas Universitarias de Córdoba (ABUC), Argentina
Resumo:
El objetivo general del proyecto es estudiar el efecto de la progesterona y de algunas protenas del plasma seminal sobre la actividad del Ca2+ en diferentes procesos fisiolgicos que ocurren en el espermatozoide, los cuales estn estrechamente relacionados con la capacidad fertilizante de esta clula. La progesterona, principal esteroide secretado por las clulas del cumulus oophorus, ejerce su efecto a travs de un receptor no-genmico provocando aumento en el calcio intracelular de los espermatozoides y, consecuentemente, promoviendo la capacitacin, la respuesta quimiotctica y la exocitosis acrosomal. Pese a estas observaciones, los mecanismos a travs de los cuales la progesterona estimula fenmenos tan diversos en el espermatozoide son an desconocidos. Tampoco se conoce con exactitud el papel funcional y los mecanismos de accin de algunas protenas del plasma seminal que interaccionan y se unen a los espermatozoides, con alta especificidad, durante la eyaculacin. Por lo tanto, resulta altamente interesante profundizar los estudios sobre las propiedades funcionales de las protenas caltrin (calcium transport inhibitor) y -microseminoprotein (MSP) del plasma seminal de mamferos, las cuales responden a las caractersticas mencionadas. Los estudios hasta ahora realizados han dado cuenta de que caltrin inhibe la incorporacin de Ca2+ extracelular, previene la exocitosis acrosomal espontnea y promueve la unin espermatozoide-zona pelcida. Tambin hay datos preliminares que sugieren un efecto inhibitorio sobre la movilidad hiperactivada de los espermatozoides. Respecto a MSP, slo se sabe que inhibe la exocitosis acrosomal espontnea y que su contenido, en el plasma seminal, guarda una relacin inversa con la fertilidad. Por todo lo expuesto, se propone estudiar los mecanismos de accin de la progesterona y las protenas caltrin y MSP sobre los procesos fisiolgicos antes indicados. Para ello, se estudiarn las variaciones de Ca2+ intracelular en espermatozoides individuales sometidos a diferentes tratamientos (gradientes de progesterona, capacitacin en presencia y ausencia de caltrin y/o MSP, etc.), usando video microscopa de fluorescencia y anlisis computarizado de imgenes. Tambin se examinar la influencia de estas molculas sobre la interaccin de gametas y la fertilizacin.
Resumo:
El Estrs de Retculo Endoplsmico (RE) es inducido por la acumulacin de protenas sin plegar en el lumen de la organela. Esto se puede observar en diversas situaciones fisio-patolgicas como durante una infeccin viral o en proceso isqumico. Adems, contribuye a la base molecular de numerosas enfermedades ya sea ndole metablico (Fibrosis qustica o Diabetes Miellitus) o neurodegenerativas como mal de Alzheimer o Parkinson (Mutat Res, 2005, 569). Para restablecer la homeostasis en la organela se activa una seal de transduccin (UPR), cuya respuesta inmediata es la atenuacin de la sntesis de protena debido a la fosforilacin de subunidad alpha del factor eucaritico de iniciacin de translacin (eIF2) va PERK. Esta es una protena de membrana de RE que detecta estrs. Bajo condiciones normales, PERK est inactiva debido a la asociacin de su dominio luminar con la chaperona BIP (Nat Cell Biol, 2000, 2: 326). Frente a una situacin de estrs, la chaperona se disocia causando desinhibicin. Recientemente, (Plos One 5: e11925) se observ, bajo condiciones de estrs, un aumento de Ca2+ citoslico y un rpido incremento de la expresin de calcineurina (CN), una fosfatasa citoslica dependiente de calcio, heterodimrica formada por una subunidad cataltica (CN-A) y una regulatoria (CN-B). Adems, CN interacciona, sin intermediarios, con el dominio citoslico de PERK favoreciendo su trans-autofosforilacin. Resultados preliminares indican que, astrocitos CNA-/- exhibieron, en condiciones basales, un mayor nmero de clulas muertas y de niveles de eIF2 fosforilado que los astrocitos CNA-/-. Hiptesis: CNA/B interacciona con PERK cuando el Ca2+ citoslico esta incrementado luego de haberse inducido Estrs de RE, lo cual promueve dimerizacin y auto-fosforilacin de la quinasa, acentundose as la fosforilacin de eIF2 e inhibicin de la sntesis de protenas. Esta activacin citoslica de PERK colaborara con la ya descrita, desinhibicin luminal llevada cabo por BIP. Cuando el Ca2+ citoslico retorna a los niveles basales, PERK fosforila a CN, reduciendo su afinidad de unin y disocindose el complejo CN/PERK. Objetivo general: Definir las condiciones por las cuales CN interacciona con PERK y regula la fosforilacin de eIF2 e inhibicin de la sntesis de protena. Objetivos especficos: I-Estudiar la diferencia de afinidades y dependencia de Ca2+, de las dos isoformas de CN ( y ) en su asociacin con PERK. Adems verificar la posible participacin de la subunidad B de CN en esta interaccin. II-Determinar si la auto-fosforilacin de PERK es diferencialmente regulada por las dos isoformas de CN. III-Discernir la relacin del estado de fosforilacin de CN con su unin a PERK. IV-Determinar efectos fisiolgicos de la interaccin de CN-PERK durante la respuesta de Estrs de RE. Para llevar a cabo este proyecto se realizarn experimentos de biologa molecular, interaccin protena-protena, ensayos de fosforilacin in vitro y un perfil de polisoma con astrocitos CNA-/- , CNA-/- y astrocitos controles. Se espera encontrar una mayor afinidad de unin a PERK de la isoforma de CN y en condiciones donde la concentracin de Ca2+ sea del orden micromolar e imite niveles del in durante un estrs. Con respecto al estado de fosforilacin de CN, debido a los resultados preliminares, donde solo se la encontr fosforilada en condiciones basales, se piensa que CN podra interactuar con mayor afinidad con PERK cuando CN se encuentre desfosforilada. Por ltimo, se espera encontrar un aumento de eIF2 fosforilado y una acentuacin de la atenuacin de la sntesis de protena como consecuencia de la mayor activacin de PERK por su asociacin con la isoforma de CN en astrocitos donde el Estrs de RE se indujo por privacin de oxigeno y glucosa. Estos experimentos permitirn avanzar en el estudio de una nueva funcin citoprotectora de CN recientemente descrita por nuestro grupo de trabajo y sus implicancias en un modelo de isquemia. The accumulation of unfolded proteins into the Endoplasmic Reticulum (ER) activates a signal transduction cascade called Unfolding Protein Response (UPR), which attempts to restore homeostasis in the organelle. (PKR)-like-ER kinase (PERK) is an early stress response transmembrane protein that is generally inactive due to its association with the chaperone BIP. During ER stress, BIP is tritrated by the unfolded protein, leading PERK activation and phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha (eIF2alpha), which attenuates protein sntesis. If ER damage is too great and homeostasis is not restored within a certain period of time, an apoptotic response is elicited. We recently demonstrated a cytosolic Ca2+ increase in Xenopus oocytes after induce ER stress. Moreover, calcineurin A/B, a an heterotrimeric Ca2+ dependent phosphatases (CN-A/B), associates with PERK increasing its auto-phosphorylation and significantly enhancing cell viability. Preliminary results suggest that, CN-A-/- knockout astrocytes exhibit a significant higher eIF2 phosphorylated level compared to CN-A-/- astrocytes. Our working hypothesis establishes that: CN binds to PERK when cytosolic Ca2+ is initially increased by ER stress, promoting dimerization and autophosphorylation, which leads to phosphorylation of elF2 and subsequently attenuation of protein translation. When cytosolic Ca2+ returns to resting levels, PERK phosphorylates CN, reducing its binding affinity so that the CN/PERK complex dissociates. The goal of this project is to determine the conditions by which CN binding to PERK attenuates protein translation during the ER stress response and subsequently, to determine how the interaction of CN with PERK is terminated when stress is removed. To perform this project is planed to do molecular biology experiments, pull down assays, in vitro phosphorylations and assess overall mRNA translation efficiency doing a polisome profile.
