Preservación de la información génica en bacterias; mecanismos y modulación molecular. Preservation of the genetic information in bacteria; mechanisms and molecular modulation.

El objetivo general del presente proyecto es contribuir a la caracterización genética y bioquímica molecular de mecanismos involucrados en el mantenimiento de la información génica, a través del estudio de sistemas fisiológicos involucrados en la prevención, reparación y tolerancia de mutaciones. Dichos sistemas se encuentran evolutivamente conservados y ampliamente distribuidos en los seres vivos. La importancia de los mismos se refleja en el hecho que su deficiencia genera en humanos, enfermedades genéticas, apoptosis y cáncer; y en especies procariotas, células denominadas "hipermutadoras". En los últimos años el estudio de la hipermutabilidad en bacterias ha cobrado gran interés ya que se le atribuye importancia en procesos infectivos y en aspectos básicos relacionados a evolución. Nuestro modelo de estudio son las bacterias Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, siendo esta última especie no solo modelo de estudio sino también especie de referencia. P. aeruginosa es una bacteria ambiental gram negativa, e importante patógeno oportunista de humanos. Específicamente nos proponemos estudiar en P. aeruginosa algunos aspectos particulares del Sistema de Reparación de Bases Apareadas Incorrectamente (Mismatch Repair System, MRS), del Sistema de Prevención/Reparación de Lesiones Oxidativas generadas a través de 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxo-dG ó GO) y el papel de las ADN Polimerasas de baja fidelidad en la modulación de la tasa de mutación. Asimismo estamos interesados en estudiar en cepas de E. coli deficientes en el sistema Dam, la existencia de subpoblaciones de alta estabilidad genética debido a la eliminación de posibles mutantes por incremento de la expresión de los otros componentes del MRS. Metodológicamente la caracterización bioquímica de factores proteicos se llevará a cabo utilizando proteínas recombinantes purificadas, análisis de interacción proteína-proteína y proteína-ADN mediante electroforesis en geles y resonancia plasmónica de superficie (Biacore), mutagenésis dirigida in vitro, y estudios de complementación en cepas mutantes específicas. Aspectos fenotípicos y de regulación génica en cultivos de biofilm y células en suspensión serán estudiados mediante la construcción de cepas mutantes, fusiones transcripcionales, PCR en tiempo real, western blot y microscopia de fluorescencia confocal.

Diseño y desarrollo de superficies modificadas. Aplicaciones ambientales, biomédicas y farmacéuticas. Design and development of modified surfaces. Environmental, biomedical and pharmaceutical applications.

El objetivo general de este proyecto de investigación es diseñar, desarrollar y optimizar superficies con propiedades especificas para ser utilizadas como sensores y biosensores, materiales biocompatibles, columnas para separaciones por electroforesis capilar, matrices para la liberación controlada de fármacos y sorbentes para remediación ambiental. Para concretar este objetivo, se propone específicamente modificar superficies o particulas apuntando a optimizar un sistema concreto relevante en aplicaciones farmaceuticas, ambientales o biomedicas: 1. Modificacion de arcillas naturales o sinteticas para desarrollar matrices portadoras de farmacos o sorbentes para remediacion ambiental:1.1 Estudiar ilitas modificadas con Fe(III) para maximizar las propiedades adsortivas frente a aniones contaminantes como arsenico. 1.2 Sintetizar LDH de Al y Mg modificados con compuestos de interés farmacéutico para diseñar sistemas de liberación controlada.2. Modificación de canales de chips y electrodos para optimizar la separación, detección y cuantificación de compuestos farmacéutico: 2.1 Diseñar y construir microchips para la separación por EC de compuestos de base fenólica.2.2 Evaluar polímeros que mejoren la respuesta y/o estabilidad de electrodos de Carbono para ser usados como detectores amperométrico de compuestos de base fenólica en sistemas FIA y miniaturizados de análisis integrados.3. Modificación de superficies sólidas con biomoléculas para el desarrollo y optimización de superficies de bio-reconocimiento:3.1 Evaluar el comportamiento de superficies de titanio modificadas con TiO2 y depósitos inorgánicos frente a la interacción con proteínas plasmáticas (PP) para el análisis de la biocompatibilidad superficial.3.2 Diseñar y desarrollar superficies biofuncionales para el reconocimiento especifico de D-aminoácidos, anticuerpos en pacientes chagásicos y simple hebra de ADN. Las técnicas que se emplearán para llevar a cabo el proyecto dependen del tipo de sistema de estudio. En particular los estudios correspondientes al objetivo 1 se realizarán mediante análisis químicos, térmico, DXR, SEM, IR, BET así como mediante titulaciones ácido-base potenciométricas, movilidades electroforéticas, cinética e isotermas de adsorción.En general para desarrollar el objetivo 2 se utilizarán técnicas electroquímicas clásicas para la caracterización de los electrodos, los que luego se utilizarán como detectores en un sistema FIA amperométrico, mientras que los microchips se emplearán en electroforesis capilar para la separación de diferentes compuestos de interés farmacéutico.Finalmente, el objetivo 3 se llevará a cabo por un lado modificando electrodos de titanio con distintos depósitos (electroquímicas, sol-gel, térmicas) de TiO2 e hidroxiapatita y evaluando la interacción con proteínas plasmáticas para analizar la biocompatibilidad de los materiales preparados. Por otro lado, se estudiará el proceso de adsorción-desorción de D-aminoácido oxidasa, antígenos del T. Cruzi y ADN de simple hebra para optmizar la capacidad de bio-reconocimiento superficial de D-aminoácidos, anticuerpos de chagásicos y de cadena complementaria de ADN. Para concretar este objetivo se utilizarán técnicas electroquímicas, espectroscópicas y microscopias.Debido al carácter multidisciplinario del presente proyecto de investigación, su ejecución se llevara a cabo a través de la colaboración de investigadores pertenecientes a distintas áreas de la Química y permitirá continuar con la formación de recursos humanos mediante la realización de tesis doctorales y estadías postdoctorales.

Mecanismos Celulares y Moleculares que regulan la Secreción, Proliferación y Muerte de Células Lactotropas. Cellular and molecular mechanisms that regulate secretion, proliferation and death of lactotroph cells.

El presente proyecto está dirigido a estudiar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la regulación de la población de lactotropas, como resultado del balance entre los procesos de proliferación y muerte celular correlacionados con la secreción de prolactina. Dentro de las vías de transducción de señales involucradas se determinará la activación de las diferentes isoformas de PKC utilizando inhibidores específicos y la participación de la vía MAPK-ERK1/2 en cultivos primarios adenohipofisarios y en la línea tumoral GH3B6. Además, se completará la caracterización morfológica y bioquímica de los diferentes procesos de muerte celular inducidos por bromocriptina en modelos de regresión de prolactinomas. Se incorporan al presente proyecto nuevas líneas de investigación dirigidas a estudiar la participación de receptores estrogénicos nucleares y de membrana sobre la actividad secretoria y proliferativa de células lactotropas. Se fija como objetivo la identificación de los mismos y su translocación intracelular en respuesta a estímulos específicos. Estas investigaciones se realizarán en cultivo primario de adenohipófisis, a nivel de microscopía electrónica y confocal. La participación de las isoformas alfa y beta de receptores estrogénicos intracelulares y de membrana en los efectos del estradiol sobre la proliferación y secreción de PRL se determinará mediante el uso de agonistas y antagonistas específicos en cultivo primario de adenohipófisis y de la línea GH3B6. Un tema de actualidad es el estudio de vías de señalización involucradas en las acciones del estrógeno en interacción con neuropéptidos o factores de crecimiento, estableciendo la interacción entre los receptores de membrana, además de posibles "crosstalk" entre diferentes rutas de transducción de señales. Como aporte a este tópico se propone estudiar los efectos genómicos y no genómicos del estradiol en interacción con TRH o FGF-2, modulando la actividad secretoria y proliferativa de las células lactotropas. Los datos obtenidos podrán contribuir al conocimiento de nuevas estrategias utilizadas para disminuir el crecimiento de tumores, inhibiendo moléculas claves como receptores de estrógenos, factores de crecimiento y algunas involucradas en las vías de señalización.