Análisis molecular del virus sincitial respiratorio bovino cepa RC-98 aislado en Argentina. Molecular analisis of bovine respiratory syncytial virus RC-98 strain isolated in Argentina.

En la provincia de Córdoba, estudios serológicos demostraron una alta tasa de infección para el Virus Sincitial Respiratorio Bovino (VSRB). Paralelamente nuestro grupo de investigación aisló por primera vez en Argentina el VSRB (cepa RC-98) dando un paso importante en el reconocimiento de esta enfermedad. En los últimos años se ha incrementado la importancia de este agente debido a la intensificación de los sistemas ganaderos, impulsados y desplazados por la agriculturización. La detección viral en muestras clínicas aún es pobre por inadecuadas técnicas de laboratorio. Por estas razones es necesario optimizar otro método diagnóstico utilizado mundialmente, no desarrollado en nuestro país hasta el presente. Con el advenimiento de la biología molecular se introducen nuevas técnicas como la RT-PCR para el diagnóstico rápido del VSRB, siendo más sensible y específica que el ensayo de ELISA, Inmunofluorescencia, Inmunoperoxidasa y aislamiento viral, además permite detectar la eliminación viral por un período más prolongado en muestras clínicas. La glicoproteína G (Gp G) del VSRB es la proteína menos conservada entre los aislamientos de VSRB y es la que presenta la mayor variabilidad, tanto antigénica como genética. Por secuenciamiento de la Gp G se propusieron seis subgrupos genéticos. La importancia de esta glicoproteína esta representada en el rol que desempeña en la respuesta inmune. La generación de anticuerpos frente a esta es capaz de neutralizar la infección viral. La hipótesis de trabajo se basa en que pueden existir diferencias genómicas importantes de la cepa autóctona, respecto a cepas bovinas de referencia internacional. Se plantean como objetivos conocer las características moleculares (genómicas) de la Gp G de la cepa RC-98 para el futuro desarrollo de inmunógenos y estandarizar una técnica diagnóstica que complemente y enriquezca el diagnóstico de este virus. Se utilizará la cepa RC-98 la cuál se propagará en células MDBK. Para desarrollar la técnica de RT-PCR se extraerá el ARN viral con un kit comercial, a partir del mismo se obtendrá el ADNc y para la PCR se utilizarán 2 juegos de primers que amplifiquen un fragmento del gen de la Gp G. Una vez estandarizada la técnica se trabajará con muestras clínicas, hisopados nasales, lavados broncoalveolares y muestras pulmonares de animales necroipsiados. Al finalizar la investigación se espera conocer las características genómicas de la cepa RC-98. Se contará con una nueva herramienta diagnóstica para la detección rápida y sensible del VSRB. La misma será transferida a laboratorios de diagnostico. Adicionalmente se contará con el secuenciamiento de la Gp G, lo cuál permitirá clasificar la cepa en estudio dentro de los subgrupos genéticos. Este proyecto pretende sentar bases para investigaciones futuras ya que la técnica de PCR posibilita una nueva aproximación al estudio de la patogénesis de la infección viral y permite estudiar la epidemiología molecular de los aislamientos de campo.

Bienestar Animal: Desarrollo de un Manual de Buenas Prácticas Pecuarias (BPP) para los sistemas de producción bovina de carne de base pastoril

El objetivo del presente proyecto es evaluar las distintas causales de estrés en el bovino de abasto y, por ende, desarrollar un Manual ilustrado de Buenas Prácticas Pecuarias (BPP), referente al bienestar animal, para los establecimientos de producción bovina de carne de base pastoril que resulte de fácil transferencia y aplicación en nuestro sector productivo ganadero con la finalidad de minimizar, a través de la implementación del mismo, el impacto negativo que el inadecuado manejo de los animales en el campo, durante el transporte y en los corrales del frigorífico, tiene sobre los parámetros productivos y la calidad de la res y de la carne. Para ello se proponen realizar las siguientes actividades: 1. Determinar las principales causas de estrés en bovinos para faena que causan pérdidas cuantitativas y cualitativas en la res y la carne (carnes de corte oscuro o DFD, golpes o manchas verdes). 2. Visitar establecimientos productores de carne vacuna para la recopilación de información y de fotografías necesarias para la confección del Manual ilustrado de Buenas Prácticas Pecuarias (BPP) referido al bienestar del animal. 3. Diagramación y edición del Manual.

Estudio de parámetros de calidad de la carne

El objetivo general del trabajo es estudiar, mediante la espectrofotometría de reflectancia, los diversos factores que influyen sobre el desarrollo del color de los productos elaborados a base de carne de origen bovino y porcino. El proceso de fabricación de embutidos crudo-curados es muy antiguo. El conocimiento, basado en la metodología científica del proceso y de dichos fenómenos permitirá la estandarización del mismo y su mejora. En una primera etapa se trabajó sobre la parte magra de la pasta cárnica que se forma durante la elaboración de productos, asignando prioridad al estudio de las primeras operaciones del proceso de fabricación, en las cuales ocurren fenómenos bioquímicos y biológicos relacionados con el desarrollo del color. El trabajo se planteó mediante un diseño factorial contemplando los diferentes tratamientos que permitirán conocer el efecto individual de los factores básicos y de sus interacciones. Las determinaciones de color se realizaron por medio de espectrofotometría de reflectancia, usando el espacio de color CIELAB, el iluminante D65 y el observador 10º. Los parámetros de color serán L* (luminosidad), a* (rojo-verde) y b* (amarillo-azul), a partir de las cuales se calcularán las magnitudes psicofísicas H* (tono) y C* (croma), el cociente a*/b* y las diferencias de color (∆E*).

Estudio citogenético en rumiantes de importancia económica mediante el cultivo de linfocitos

La citogenética dispone de métodos que permiten evaluar, directa o indirectamente, anomalías cromosómicas causantes de importantes mejoras o pérdidas ganaderas en varios países que las han estudiado. Por ello, diferentes países de zootecnia avanzada dan importancia creciente a los estudios citogenéticos, planteándose en algunos la necesidad o exigencia de realizar estudios del cariotipo en reproductores que se usan en centros de inseminación artificial, como de sus ascendientes o descendientes en test de progenie o bancos de embriones. Existen numerosas anomalías cromosómicas causantes de trastornos del desarrollo, neoplasias e infertilidad en el bovino, ovino, caprino, porcino, equino y otros animales domésticos. Las pérdidas estudiadas son cuantiosas y algunas de estas anomalías se refieren a menor tasa de fertilidad y cantidad de terneros. Debido a que la evaluación citogenética involucra etapas que consumen mucho tiempo, se desarrollan procedimientos semiautomáticos que reducen los tiempos significativamente, sin afectar la seguridad y consistencia. Por tal motivo, debido a que se dispone de un analizador digital de imágenes con el software base y software para el análisis del cariotipo, se capacitarán recursos humanos, que permitan luego agilizar la obtención de resultados. En Argentina, los estudios citogenéticos en el bovino son recientes, por lo que es necesario continuarlos y extenderlos a otros animales de importancia económica, afectiva o en vías de extinción, con el objeto de protegerlos de alteraciones hereditarias que resulten negativas. En este sentido, se han dispuesto algunas acciones que propenden a reglamentar la necesidad del cariotipado en reproductores dadores de semen y los que se emplean en la transferencia de embriones. No conocemos de estudios citogenéticos a nivel nacional en camélidos andinos, ovinos, caprinos, equinos, caninos y/o aves (...) 1. Objetivos Generales: - Desarrollar recursos humanos y técnicos para realizar estudios cariotípicos (cultivo y técnicas de bandeo) en animales de importancia económica. - Capacitación en análisis digital de imágenes para realizar el análisis cromosómico. - Realizar estudios cariotípicos en reproductores con problemas de fertilidad. - Realizar estudios cariotípicos en bovinos con diagnóstico serológico de leucosis. - Realizar estudios de prevalencia de anomalías cromosómicas en toros usados en inseminación artificial. - Ofrecer servicios de registros cariotípicos para reproductores empleados en inseminación artificial, transplante de embriones, animales con tumores o trastornos del desarrollo.

Control de la función reproductiva postparto en vacas de cría

Los prolongados períodos de anestro constituyen la principal causa de infertilidad durante el puerperio en los rodeos de cría. Algunas estimaciones revelan que sólo el 50% de los vientres en edad reproductiva destetan un ternero por año, lo que se traduce en importantes pérdidas económicas para el sector de producción de carne. La duración del período anovulatorio postparto está determinada fundamentalmente por las influencias inhibitorias del amamantamiento y de la subnutrición sobre el eje hipotálamo-hipofisiario.(...) Según estimaciones del Censo Nacional Agropecuario (INDEC, 1998) existen en la Argentina aproximadamente 25 millones de vientres bovinos en edad reproductiva y las tasas promedio de destete anual no superan el 52%. Los prolongados períodos de anestro constituyen la causa primordial de esta baja tasa de procreo. El desarrollo de alternativas más eficientes para lograr la interrupción o acortamiento del anestro postparto posibilitará mejorar sustancialmente los índices mencionados. (...) Resultados recientes en nuestro laboratorio demostraron que en vacas en anestro postparto el tratamiento combinado de progesterona más estradiol 17b (E-17b) induce la emergencia sincronizada de una nueva onda folicular y altas tasas de ovulación sincronizada luego de un destete de 48h y GnRH. Objetivos generales y específicos Desarrollar y evaluar alternativas más eficientes para el control de la función reproductiva postparto en el ganado bovino para carne. Evaluar la fertilidad luego de la IAS en vacas en anestro pretratadas con progesterona más estradiol-17b y ovulación inducida con un destete de 48 h y GnRH.

Estudio de los mecanismos inmunosupresores involucrados en la cronicidad de la infección intramamaria por staphylococcus aureus en bovinos. Immunosuppressive mechanisms involved in intrammary chronic infection by staphylococcus aureus in bovine.

La producción de productos lácteos conforma un complejo productivo de larga trayectoria en Argentina, con grandes transformaciones en el sector lechero en los últimos años. La provincia de Córdoba es una de las principales áreas de producción lechera, participando del 34.5 por ciento de la producción nacional. Esta provincia cuenta con un alto número de industrias, principalmente localizadas en la cuenca de Villa María, y concentra el 35 por ciento de los establecimientos lecheros del país. La Mastitis bovina (MB) es la principal causa de pérdidas económicas para el productor y la industria láctea a nivel mundial y regional, por lo cual se plantea la necesidad de mejorar la calidad higiénica y sanitaria de la leche a través de un mayor control de la mastitis. La MB es una inflamación de la glándula mamaria (GM) asociada a una infección bacteriana. Es la enfermedad más común y de mayor incidencia en el ganado lechero, siendo la principal causa de pérdidas económicas para la industria láctea a nivel mundial. Las medidas actuales de control de MB están basadas en prácticas de higiene apropiadas, reducción de la exposición ambiental al patógeno y terapia antibiótica del ganado, las cuales no son totalmente efectivas en el control de la infección. La defensa de la GM contra los patógenos causantes de MB depende de factores anatómicos, celulares y solubles, siendo la eficiencia de esos mecanismos la que determina la resistencia a nuevas infecciones. Los mediadores inmunes innatos y adquiridos de los tejidos y secreciones de la GM actúan en forma coordinada en la protección de la glándula contra enfermedades contagiosas. Staphylococcus aureus es el agente etiológico más importante en la mastitis. Esta bacteria evade la respuesta inmune inflamatoria mediante la inducción de mecanismos inmunosupresores, llevando a la patología a un curso crónico. S. aureus además puede colonizar el tejido epitelial y formar películas bacterianas conocidas como biofilms. Así, S. aureus adquiere más resistencia a la terapia antibiótica y a la acción del sistema inmunológico determinando la persistencia de la enfermedad. Nuestra hipótesis es que una respuesta inmune desarrollada en un microambiente particular de citoquinas, quimioquinas y células, podría contribuir a la evasión del patógeno y al desarrollo de una infección crónica. El polisacárido Quitosano (Q) presenta un efecto antibacteriano e inmunoestimulante en cultivos de células inmunes de ganado bovino, un efecto protectivo en modelos murinos de mastitis y actividad anti-biofilms de distintas cepas bacterianas. Por sus propiedades intrínsecas, este polisacárido es un candidato ideal en la regulación de las respuestas inmunológicas. El objetivo de este proyecto es caracterizar el microambiente local y sistémico, las señales inducidas por el microorganismo que promueven una falla inmunológica y caracterizar el efecto de Q sobre las respuestas generadas en la GM, mediante la realización de numerosos estudios in vivo e in vitro. Las estrategias para controlar la MB por S. aureus y disminuir el impacto de esta patología en la industria láctea, podrían orientarse a la manipulación del sistema inmunológico de la GM bovina a fin de incrementar los mecanismos de defensa naturales del huésped. Los resultados que se desprendan del proyecto permitirán adquirir conocimiento para el desarrollo de nuevas estrategias de inmunointervención a fin de controlar la MB por S. aureus y disminuir el impacto de esta patología en la industria láctea. Siendo la MB una patología relevante no solo en lo que hace a status sanitario animal, línea prioritaria definida en el Plan Estratégico Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación "Bicentenario 2006-2010", sino también a las implicancias económicas de esta problemática, y dado el desarrollo de la actividad lechera en la región y en el país, los resultados obtenidos podrían tener un importante impacto socioeconómico.

Modulación de la activación de células dendríticas por antígenos de Fasciola hepatica y ligandos para receptores Toll: Potencial terapéutico en respuestas anti-inflamatorias. Fasciola hepatica antigens and TLR ligands modulate dendritic cells activation: therapeutic potential in anti-inflammatory responses.

Antecedentes: En nuestro laboratorio hemos demostrado que antígenos (Ags) de Fasciola hepatica inducen en células dendríticas murinas (CD), diferentes propiedades tolerogénicas como la incapacidad por si mismos de inducir la maduración de las células, la resistencia a la maduración por ligandos de TLR, el incremento en la producción de IDO y también la capacidad de esta estas células de dirigir la respuesta inmune hacia un perfil Th2 y T reg. Por otra parte ha sido bien documentado que CD con características tolerogénicas, ya sea inmaduras o semimaduras, son útiles para reducir respuestas inflamatorias excesivas tales como las que ocurren en enfermedades autoinmunes. Además hemos demostrado que CD tratadas con Ags del parásito en conjunto con un ligando Toll (CpG-ODN) producen altos niveles de citoquinas anti-inflamatorias (IL-10 y TGF-) bajos de citoquinas proinflamatorias (TNF, IL-6, IL-12). Hipótesis: El fenotipo semimaduro alcanzado en las CDpodría ser utilizado para reducir la inflamación en un modelo de enfermedad autoinmune en donde existe una exacerbada respuesta Th1 y Th17, ya que la producción elevada de IL-10 y TGF- podría inhibir o controlar estas respuestas de manera directa o a través de la inducción de células T regulatorias. Objetivos: En este proyecto nosotros proponemos la inmunización de animales susceptibles (ratones DBA1/j), al desarrollo de artritis inducida por colágeno (AIC) con CD tratadas con Ags de F. hepatica en conjunto con CpG-ODN para reducir los síntomas clínicos de la enfermedad. Materiales a utilizar: En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) mediante dos inmunizaciones de ratones DBA1/j con colágeno tipo II bovino y adyuvante de Freund. El modelo permitió establecer un índice clínico mediante la hinchazón en las patas de los animales. Doce días posteriores a la primera inmunización los animales serán inyectados con CD tratadas con: 1. PBS, 2.Extracto total de F.hepatica (TE) + CII, 3. CpG + CII, 4. TE+CpG+CII Se realizará la observación macroscópica diaria, a partir de los 7 días de la 2a inmunización Luego del sacrificio las articulaciones de las patas se prepararán para realizar un análisis histológico. Se detectará en suero los niveles de anticuerpos IgG1 (perfil Th2) y de IgG2a (perfil Th1) mediante la técnica de ELISA. Se detectará también el perfil de citoquinas en los nódulos drenantes por la técnica de ELISA y adicionalmente la poblaciónes celulares de células T regulatorias (Treg) CD4+CD25+Foxp3 o células Tr1. Resultados esperados: Pensamos que el tratamiento de los animales que desarrollan AIC con CD semimaduras (por el tratamiento con TE y CpG), serán capaces de migrar a los órganos linfaticos y secretar TGF-be(inductora de células T reg), IL-10 (inductoras de células Tr1), IDO inhibitoria de la respuesta de Li T y promotor de células T reg, también podría generarse una respuesta Th2 (por la presencia de antígenos del parásito), y estas respuestas aisladas o en forma sinérgica podrían inhibir las respuestas de tipo Th17 y Th1 asociadas a la patología en esta enfermedad. Importancia del proyecto: En el desarrollo de la artritis existe un aumento de la inmunidad mediada por células, asi como de la respuesta inmune humoral hacia componentes de la matriz del cartílago. El tratamiento convencional de la artritis recae en general en el uso de inmunosupresores no-específicos, los cuales poseen una variedad de efectos adversos y la inhibición de la respuesta inflamatoria no es específica. En este proyecto proponemos el uso de CD tratadas con antígenos del helminto F. hepatica y CpG ligando Tol que capacita a estas células para generar una respuesta adaptativa de tipo regulatoria, útil en la inhibición de las respuestas inflamatorias como la que ocurre durante la progresión de artritis reumatoidea en un modelo experimental en ratones. We have shown that F. hepatica Ags-treated dendritic cells (DC) together with a TLRl ligand (CpG-ODN) produce high levels of anti-inflammatory cytokines (IL-10 and TGF-Beta) and low of proinflammatory cytokines (TNF, IL-6, IL -12). Hypothesis: The semimature phenotype achieved by DC, could be used to reduce inflammation in a model of autoimmune disease. The high production of IL-10 and TGF-Beta by these cells could directly or through the induction of T reg cells inhibit the inflammatory response. Objective: In this project we propose the immunization of DBA1 / j mice, susceptible to the development of collagen-induced arthritis (CIA) with F. hepatica-treated DC in conjunction with CpG-ODN to reduce clinical signs of disease. Materials: In our laboratory, we developed the CIA model by two immunizations of DBA1 / j mice with bovine type II collagen and Freund's adjuvant. The model allowed to stablish a clinical index by swelling in the legs of animals. Twelve days after the first immunization the animals are injected with DC treated with: 1. PBS 2. F.hepatica Extract (TE) + CII, 3. CpG + CII, 4. TE + CpG + CII Macroscopic observation will take place daily from 7 days of the 2nd immunization. After sacrifice the joints of the legs will be prepared for histological analysis. Serum levels of IgG1 antibodies (Th2 profile) and IgG2a (Th1 profile) will be detected by ELISA. It will also detected the cytokine profile in draining lymph nodes by ELISA and additionally the cell populations of regulatory T cells (Treg) CD4 + CD25 + Foxp3 or Tr1 cells. Expected results: We believe that the treatment of animals that had developed CIA with DC will be able to migrate to lymphatic organs and secrete TGF-B (T reg cell-inducing), IL-10 (inducing Tr1 cells), IDO (inhibitory of T cells and inducing of T reg cells) could alone or in synergy inhibit Th17-type responses and Th1 associated with the pathology in this disease.