Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción. In vitro Production of Transgenic Bovine Embryos using Intracitoplasmic Sperm Injection (ICSI) and Restriction Enzymes

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas. Genetic engineering and reprogrammed organisms represent the new biotechnological frontiers which will make possible to generate animals with precise genetic modifications for agricultural and biomedical applications. Current methods used to generate genetically modified large animals, lay behind those used in laboratory animals, specially the mouse. Therefore, we seek to develop and optimize protocols to produce transgenic bovine embryos through the use of a non-viral vector. The strategy involves the simultaneous presence inside the cell of a restriction enzyme (I-SceI) and a transgene (carrying cassettes for a fluorescent protein -ZsGreen1- and neomycin phosphotransferase) flanked by restriction sites for the endonuclease. We plan to develop an alternative approach to generate transgenic bovine embryos by coinjecting the transgene flanked by I-SceI restriction sites plus the enzyme I-SceI along with the spermatozoon during the technique known as intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Embryos will be cultured in vitro and inspected daily with a fluorescence microscope to characterize transgene expression. Embryos that reach the blastocyst stage and express the transgene will be surgically transfer to the uterus of a synchronized ewe. After 7 days, the embryos will be flushed out the ovine uterus and transported to the laboratory to determine the number of integration sites and transgene copies by Southern blot. We anticipate that results from this research will set the stage for the development of efficient strategies to achieve precise genetic modifications in large domestic animals for future biotechnological applications.

Producción in vitro de Embriones Bovinos Transgénicos mediante Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) con Enzimas de Restricción

La ingeniería genética y la reprogramación de organismos vivos representan las nuevas fronteras biotecnológicas que permitirán generar animales con modificaciones precisas en sus genomas para un sinnúmero de aplicaciones biomédicas y agropecuarias. Las técnicas para inducir modificaciones génicas intencionales en animales, especialmente en especies mayores de interés agropecuario, se encuentran rezagadas si se compara con los avances significativos que se han producido en el área de la transgénesis de roedores de laboratorio, especialmente el ratón. Es así que, el presente proyecto persigue desarrollar y optimizar protocolos para generar embriones bovinos transgénicos para aplicaciones biotecnológicas. La estrategia propuesta, se basa en conseguir la presencia simultánea en el interior celular de una enzima de restricción (I-SceI) más un transgén (formado por casetes de expresión de una proteína fluorescente -ZsGreen1- y neomicina fosfotransferasa). Específicamente, proyectamos estudiar una vía alternativa para generar embriones bovinos transgénicos mediante la incorporación del transgén (casetes ZsGreen1 y neo) flanqueado por sitios I-SceI más la enzima I-SceI al interior del ovocito junto con el espermatozoide durante la técnica conocida como inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Los embriones así generados se cultivarán in vitro, inspeccionándolos diariamente para detectar la emisión de fluorescencia, indicativa de la expresión de la proteína ZsGreen1. Los embriones que alcancen el estado de blastocisto y expresen el transgén se transferirán quirúrgicamente al útero de ovejas sincronizadas y se mantendrán durante 7 días. Al cabo de este período, los embriones se recolectarán quirúrgicamente del útero ovino y se transportarán al laboratorio para determinar el número de sitios de integración y número de copias del transgén mediante el análisis de su ADN por Southern blot. Se prevé que los resultados de esta investigación permitirán sentar las bases para el desarrollo de métodos eficientes para obtener modificaciones precisas en el genoma de los animales domésticos para futuras aplicaciones biotecnológicas.

Identificación de genotipos de aislamientos de Trypanosoma cruzi mediante análisis de ADN

El estudio mediante zimogramas electroforéticos de extractos de Trypanozoma cruzi /i> aislados de humanos, animales domésticos y selváticos y de vectores procedentes de toda el área endémica de Argentina, permitió reconocer la existencia de 12 zimodemos (z) o "cepas isoenzimáticas". De los zimodemos aislados de hospederos humanos, sólo dos Z1 y Z12 se encuentran con gran frecuencia y tienen amplia distribución geográfica. Se ha observado una correlación significativa entre el zimodemo del parásito infectante y el cuadro clínico. El compromiso cardíaco es significativamente mayor en pacientes con Z12 que en aquellos con Z1. Por esta razón, la tipificación de la cepa infectante puede ser útil con fines pronósticos. Sin embargo, la metodología utilizada para la determinación del zimodemo es muy laboriosa e insume mucho tiempo, lo que reduce las posibilidades de aplicación clínica. Dada la similitud del agrupamiento obtenido por el análisis de los zimodemos y del ADNk, los problemas de la caracterización isoenzimática de aislamientos pueden ser evitados mediante estudio del ADN del parásito. (...) Objetivo general Identificación de zimodemos de Trypanosoma cruzi mediante análisis de ADN. Objetivos específicos a) Aislamientos de T. cruzi de pacientes chagásicos crónicos con diferentes cuadros clínicos serán caracterizados utilizando isoenzimas como marcadores genéticos. b) Se establecerá la relación entre la sintomatología observada en cada caso y el zimodemo al cual pertenecen los parásitos aislados. c) A partir del ADN aislado se procederá a: 1. Amplificación de segmentos de ADN al azar dando lugar a fragmentos de ADN que permitan identificar los diferentes zimodemos. 2. Hibridización con sondas de ADN, lo que permitiría identificar el zimodemo al que pertenecen los parásitos de dicho aislamiento. 3. Amplificar, mediante PCR, la región HVRm de T. cruzi directamente en muestras biológicas y proceder a su tipificación con sondas específicas.

Análisis de componentes del sistema inmune innato en la infección VIH/SIDA: Apoptosis y expresión de moléculas y receptores en Polimorfonucleares Neutrófilos

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) afecta principalmente a la respuesta inmune específica causando una pérdida progresiva de los linfocitos T CD4+. Este virus también puede afectar a células del sistema inmune innato, como los Polimorfonucleares Neutrófilos (PMN). Los objetivos propuestos para esta etapa del proyecto son: a) investigar el efecto de la infección por VIH sobre la apoptosis de PMN, b) analizar la expresión de moléculas y receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos en estas células y c) evaluar el impacto de la terapia antirretroviral sobre la apoptosis y expresión de moléculas y receptores en PMN. Se incluirán individuos en distintos estadios de la infección con o sin tratamiento antirretroviral y se determinarán parámetros hematológicos, inmunológicos y virológicos a fin de correlacionar el nivel de apoptosis y expresión de moléculas y receptores con el nivel de linfocitos T CD4+ y carga viral. La importancia de los PMN en el control de la infección por el VIH es actualmente un área de mucho interés, ya pueden ejercer un efecto anti-VIH directo, y al mismo tiempo, ser blancos de la infección viral. Comprender los aspectos claves en la cascada de la apoptosis de estas células podría en un futuro aportar posibles blancos terapéuticos, que permitan restaurar la función de los PMN durante la infección VIH/SIDA.

Análisis y optimización del radio enlace en un sistema RFID

El proyecto tiene como principal objetivo lograr mejorar el enlace entre el tag y el Reader, en un sistema RFID (Radio Frecuency IDentification). El mismo será abordado desde dos ópticas de trabajo; La primera, es lograr el mismo alcance de los sistemas actuales, reduciendo la potencia aportada por el Reader. En esta situación su principal aplicación será en los implantes en seres vivos, disminuyendo la radiación electromagnética en los mismos. La segunda, es lograr aumentar la distancia del alcance del enlace, sin aumentar la potencia del Reader.

Infecciones conjuntivales crónicas o recurrentes: Análisis de la inmunidad local y sistémica y su relación con parámetros nutricionales y de estrés

El sistema inmune del huésped dirige a los linfocitos T cooperadores o helper (Th) activados a madurar hacia linfocitos Th1 o Th 2 según el antígeno específico estimulante. Los linfocitos Th1 son responsables de estimular la respuesta inmune celular e inducir el cambio del isotipo de las inmunoglobulinas (Ig) de los linfocitos B hacia la síntesis de IgG1 e IgG3. En contraste, los linfocitos Th2 inducen respuesta humoral con cambio de isotipo de las Igs a la producción de IgE e IgG4, isotipos involucrados en la respuesta alérgica y con mínimo rol en la defensa contra microorganismos. Las inflamaciones crónicas de la mucosa ocular pueden ser causadas por alergias, infecciones, traumatismos o mixtas. En estudios previos en niños de 3 a 5 meses de edad con infecciones conjuntivales crónicas o recurrentes y asociadas a dacrioestenosis congénita hemos determinado que los procesos infecciosos inducen una respuesta hacia isotipos de Igs mediados por linfocitos Th2 (IgE e IgG4) no protectivos y asociados con alergia. En adultos, una minoría de los casos de inflamaciones conjuntivales crónicas o recurrentes se asocian con niveles elevados de IgE en lágrimas, presencia de eosinófilos en la citología conjuntival y diagnóstico clínico de alergia. Sin embargo, la mayoría de los pacientes que manifiestan esta enfermedad no tienen diagnóstico clínico de alergia pero muestran niveles bajos de IgE e IgG en lágrimas, ausencia de eosinófilos y presencia de microorganismos en sus conjuntivas. En base a estos hallazgos surge el interrogante respecto a ¿cuál es el motivo de los niveles bajos de IgE en la respuesta inmune local a estos patógenos que en forma crónica y recurrente agreden las conjuntivas de estos pacientes? Y ¿por qué la respuesta de IgG en baja concentración no los defiende? Por lo expuesto, el presente proyecto tiene como objetivo evaluar la inmunidad inespecífica sistémica y la específica de la superficie ocular de pacientes adultos con infecciones conjuntivales crónicas o recurrentes para caracterizar la respuesta de linfocitos Th1/Th2. Además, analizar el efecto del estrés y deficiencias nutricionales sobre la respuesta inmune local y sistémica. Estos estudios permitirán determinar modificaciones de la inmunidad ocular y caracterizar el perfil de la respuesta inmune. La identificación del tipo de respuesta inmune afectada permitirá la detección de pacientes con predisposición a esta patología y por ello, ayudar a prevenir y en algunos casos, a revertir este proceso recurrente; lo que constituirá un valioso aporte a programas de prevención de enfermedades oculares.

Coinfecciones virales y análisis de marcadores de autoinmunidad en individuos con infección VIH/SIDA

Las coinfecciones con otros virus han emergido como un importante problema de salud en individuos con infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) en la era de la terapia antiretroviral de alta eficacia y todos ellos propuestos como inductores de autoinmunidad. Los objetivos para esta etapa del proyecto son: Dilucidar el perfil de marcadores serológicos de autoinmunidad en pacientes con infección por VIH y coinfectados con virus de la hepatitis B (VHB) y /o virus de la hepatitis C (VHC) y desarrollar una metodología para monitorear anticuerpos contra múltiples auto-antígenos. En pacientes mono y coinfectados con VIH, VHB o VHC, con o sin tratamiento antiviral, se determinará la presencia de marcadores de autoinmunidad y su relación con la carga viral, linfocitos T-CD4+, nivel sérico de inmunoglobulinas y componentes del complemento, marcadores de daño hepático, genotipo del VHC y tratamiento antiviral. La caracterización de marcadores de autoinmunidad posibilitará identificar pacientes con mayor compromiso clínico y diferente respuesta al tratamiento antiviral. El desarrollo de una metodología para la detección simultánea de distintos auto-anticuerpos permitirá monitorear el perfil autoinmune en una sola determinación y ofrecer al equipo médico una determinación que evite la prescripción individual de cada uno de éstos auto-anticuerpos.

Infección por VIH: Análisis de subgrupos de células T y citocinas circulantes en pacientes tratados con distintas terapias antirretrovirales

Distintos factores del huésped y virales pueden determinar el curso de infección por VIH e influir la respuesta al tratamiento antirretroviral (TAR). Previamente evaluamos el impacto del VIH sobre componentes del sistema inmune y el efecto del TAR sobre la reconstitución inmunológica. El objetivo principal de esta etapa de la investigación consistirá en evaluar factores de huésped como la expresión de receptores de quimiocinas en subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y los niveles de citocinas y quimiocinias circulantes en individuos con infección por VIH durante el estadio virémico y avirémico. Además se evaluará el efecto del TAR de alta eficiencia temprano o tardío sobre estos parámetros. Si bien el TAR actual produce mejoras clínicas importantes, es improbable que erradique el virus. El conocimiento de determinantes del huésped en la infección de VIH permitirá su aplicación tanto al desarrollo de vacunas como a estrategias terapéuticas nuevas

La asistencia técnica a procesos asociativos intermunicipales y la creación de condiciones para la gobernabilidad regional: Análisis de posibilidades y limitaciones en la implementación de una estrategia de intervención

El proyecto se propone analizar posibilidades y limitaciones de una estrategia de intervención sustentada en el enfoque investigación acción participativa y encuadrada en el Subprograma de Asistencia Técnica a Proceso Asociativos Intermunicipales del Programa de Fortalecimiento Institucional de Municipios (PROFIM) de la Universidad Católica de Córdoba (UCC). La estrategia de intervención tiende a facilitar la generación de condiciones para la gobernabilidad regional a partir de la constitución, operacionalización y coordinación de nudos de acción diferenciados e interdependientes (políticos, técnicos y sociales) que posibiliten la acción colectiva a nivel regional. Así cada componente de la red tiene su propia lógica interna y una lógica de vinculación con el resto. La articulación permite la circulación y maximización de recursos para la gestión de políticas públicas regionales. La estrategia se implementa en tres casos, que parten de condiciones estructurales diferentes y que determinan particularidades del proceso, en sus efectos y resultados. El análisis de las posibilidades y limitaciones de la implementación de la estrategia de intervención se realizará a partir de dos dimensiones: por un lado, la de las condiciones objetivas en las cuales se desarrolla (condiciones económicas, sociales, políticas e institucionales, locales y regionales) y, por otro, la de las condiciones subjetivas, es decir, de las percepciones y representaciones de los diferentes actores involucrados en ella. Ambas dimensiones serán tenidas en cuenta en relación con seis ejes temáticos, definidos a partir de supuestos que sustentan la estrategia de intervención: asistencia técnica, estrategia de intervención, capacidades endógenas, redes sociales, acción colectiva y gobernabilidad regional. La concreción del proyecto pretende generar conocimiento válido para promover acciones eficaces y eficientes en relación con la estrategia de intervención analizada, así como construir conceptos y formular hipótesis susceptibles de ser extendidas al universo más amplio de la asistencia técnica.

Democracia Deliberativa en Córdoba: análisis de los alcances y limitaciones de algunas experiencias participativas, contribuciones para su factibilidad

En el debate académico y social los críticos de la democracia deliberativa coinciden en sostener la imposibilidad de realización de este ideal, fundamentando dicha afirmación en hechos sociales relevantes como el pluralismo, la desigualdad, la complejidad, poderosas instituciones y una esfera pública polarizada en extremo. En atención a las mencionadas críticas algunos autores han destacado que la viabilidad de una forma deliberativa de democracia depende de la creación de condiciones sociales y arreglos institucionales que propicien el uso público de la razón. La deliberación es pública en la medida en que estos arreglos permitan el diálogo abierto entre ciudadanos capaces de formular juicios informados y razonados en torno a las formas de resolver situaciones problemáticas. La factibilidad y eficacia de la deliberación pública reside, a su vez, en la posibilidad de sostener no sólo un diálogo abierto y continuo entre ciudadanos, sino también de éstos con las instituciones políticas. En esta discusión se inserta el presente proyecto con el fin de estudiar los problemas de justificación e institucionalización, como así también los obstáculos y constreñimientos empíricos con los que se enfrenta la democracia deliberativa. Para ello se toman diversas experiencias en la Provincia de Córdoba: El Acta de Compromiso Público de la Ciudad de Córdoba, Los Observatorios de Servicios Públicos de la Asociación Civil el Ágora, Concertación en Espacios Locales de la Asociación Civil el Ágora y las Juntas de Participación Vecinal de la Municipalidad de Córdoba. Todos estos procesos se caracterizan por constituir iniciativas que procuran la creación, fortalecimiento e institucionalización de espacios de participación ciudadana y de interacción dialógica de los ciudadanos entre sí y de éstos con el estado. Estos espacios son espacios situados y, en cuanto tales, implican contingencias devenidas de las particularidades territoriales, temáticas y de los diferentes horizontes temporales sobre los que se proponen actuar. El proyecto se propone analizar los alcances y dificultades (políticas, sociales, organizativas, informacionales) que se presentan en estas experiencias deliberativas, atendiendo tanto a los requisitos de factibilidad de las propias experiencias como a la necesidad de fortalecer los planteamientos teóricos de la teoría de la deliberación pública a partir de la consideración de los problemas empíricos con los que la misma se enfrenta. Se prevé el desarrollo e implementación de indicadores de seguimiento y monitoreo de las experiencias que den cuenta de las dimensiones y presupuestos de la democracia deliberativa, la construcción de modelos procedimentales y tecnologías comunicativas que contribuyan a la factibilidad de los presupuestos comunicativos y la contribución al desarrollo de proposiciones teóricas vinculadas con la preocupación académica referida a los procesos deliberativos y participativos en las sociedades contemporáneas.