Aprendizaje durante la ontogenia temprana: Estudio de la participación del sistema opioide en la modulación de aprendizajes mediados por el etanol. LEARNING AND EARLY ONTOGENY: ANALYSIS OF THE INVOLVEMENT OF OPIOID SYSTEM IN FETAL AND INFANTILE ETHANOL-MEDIATED EXPERIENCIES.

Este plan de trabajos es continuidad de una línea de investigación centrada en evaluar los mecanismos responsables de la adquisición, expresión y persistencia de experiencias con el etanol. A partir de ello, indagar acerca de los efectos de esta experiencia sobre comportamientos de búsqueda y autoadministración de etanol en neonatos e infantes de rata. Se pretende analizar la participación del sistema opiáceo en los mecanismos implicados en una memoria fetal y/o infantil, generada como consecuencia de la exposición etílica. En una primera etapa, nos proponemos establecer de qué manera experiencias prenatales con la droga modulan el patrón de auto-administración de alcohol y otros reforzadores, como sacarosa. En este primer bloque de experimentos realizaremos manipulaciones fetales para determinar con mayor grado de especificidad la posible acción del sistema opiáceo en los mecanismos de adquisición de una memoria etílica prenatal. Se realizarán administraciones de etanol y el antagonista opiáceo, directamente a nivel fetal, y se evaluará esta experiencia en un paradigma de condicionamiento neonatal positivo, mediado por la droga. De acuerdo a la evidencia previa, esperamos que la exposición prenatal con la droga facilite la expresión de conductas de consumo y búsqueda del etanol o hacia las claves que señalizan al psicotrópico, tanto durante la infancia como en el neonato. A su vez, cuando la droga es presentada bajo los efectos de un antagonista opiáceo esperamos que estas conductas muestren un perfil similar a las desplegadas por sujetos controles. El segundo bloque de experimentos ha sido ideado con el objeto de indagar acerca de la posible participación del sistema opiáceo en la modulación de los aspectos reforzantes de la droga, a través de un esquema de auto-administración etílica infantil. Se utilizará un paradigma de condicionamiento instrumental adaptado para ratas infantes que consta de dos instancias, una de adquisición de la conducta instrumental (DPs 14-17) en la cual los animales reciben un pulso de refuerzo, como consecuencia de la ejecución de la conducta operante. En una segunda fase se analiza el patrón de búsqueda del reforzador ya que se registra la respuesta instrumental, sin que ocurra el refuerzo por la misma. Para analizar la participación del sistema opiáceo, durante la fase de adquisición de la conducta operante (DPs 16 y 17) los animales serán re-expuestos a mínimas cantidades del reforzador, bajo los efectos de un antagonista opiáceo, momentos previos al ensayo instrumental correspondiente para cada uno de estos días (Exp. 3). Esperamos que el bloqueo del sistema opiáceo, durante esta re-exposición al etanol, sea suficiente para disminuir el patrón de respuesta instrumental hacia el refuerzo etílico. Un último experimento incorporará un tercer evento de re-exposición al etanol -bajo los efectos del antagonista- previo al ensayo de extinción de la conducta instrumental (DP 18). Este nuevo evento tiene por objeto analizar la participación de este sistema neurobiológico en los mecanismos de búsqueda de etanol. Si el sistema opiáceo participa en la modulación de patrones tanto de búsqueda como consumatorios del reforzamiento por etanol, se espera que la re-exposición a la droga bajo los efectos del antagonista, inhiba estas respuestas tanto durante la sesión de adquisición, como de extinción de la conducta operante. Este proyecto intenta profundizar en el conocimiento de los mecanismos que regulan reconocimiento, aceptación, búsqueda y consumo de etanol, como consecuencia de experiencias tempranas con la droga. A su vez, es importante identificar y estudiar los sistemas neurobiológicos involucrados en estos mecanismos. Es por ello que se intenta determinar el rol que ejerce el sistema opiáceo en la adquisición de estas experiencias etílicas a nivel fetal e infantil, que se conoce promueven la búsqueda y el consumo de la droga. Our work is directed to analyze the involvement of the opioid system in the generation of pre- and early postnatal ethanol-related memories. As a first step, maternal manipulations with ethanol will be done. Infants will be evaluated in a paradigm of infantile self-administration of different reinforcers (ethanol, sucrose or water), employing a model of operant conditioning adapted to infant rats. A second experiment will be conducted in order to analyze if a central administration of ethanol, directly to the fetus, modifies subsequent patterns of neonatal conditioned responses to an artificial nipple, mediated by ethanol reinforcing effects. Fetal presentation of ethanol will be accompanied with the injection of an opioid antagonist in order to analyze the involvement of this system in acquisition processes of a fetal ethanol-mediated memory. A second set of studies will be conducted to analyze appetitive and consummatory behaviors in an infant model of ethanol self-administration. Involvement of opioid system in the acquisition or expression of this experience will be also inquired. Infant rats (PDs14-17) have to display a target behavior (nose-poke) to gain access to 5% sucrose or 3.75% ethanol. On PD18 an extinction session will be included. At PDs16-17, 6-hr before training, pups will be re-exposed to ethanol under opioid antagonism effects (naloxone). In a follow up experiment, a re-exposure trial will be included at PD18. Prior extinction, pups will receive naloxone and will be re-exposed to ethanol. We aim to observe if opioid system is modulating etha¬nol reinforcing effects, in terms of both appetitive and consummatory behaviors.

PARTICIPACIÓN DEL RECONOCIMIENTO INMUNE INNATO EN LA RESPUESTA DE CARDIOMIOCITOS DURANTE LA INFECCIÓN EXPERIMENTAL CON TRYPANOSOMA CRUZI. Characterization of the cardiac innate immune response during Trypanosoma cruzi experimental infection.

La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, constituye la principal miocarditis infecciosa a nivel mundial. Crecientes evidencias revelan que la respuesta inmune innata tendría un rol determinante en la fisiopatología de las enfermedades cardiovasculares. La inmunidad innata es la primera línea de defensa, no específica, preprogramada para combatir agentes infecciosos. Este sistema censa la presencia de antígenos extraños a través de los receptores tipo toll (TLR) produciendo citoquinas y activando mecanismos microbicidas. Sin embargo, los TLRs también se hayan distribuidos en las células parenquimales no inmunes, jugando un importante rol tanto en la defensa como en la homeostasis de cada tejido. Durante la etapa aguda de la infección, el T. cruzi invade y se replica dentro de una amplia variedad de células y tejidos. Pero posteriormente, los parásitos son efectivamente eliminados de la mayoría de los tejidos persistiendo durante toda la vida en las células del músculo cardíaco y esquelético de los pacientes infectados. Debido a que el mantenimiento de la célula cardíaca infectada es crítica para la patogénesis de la enfermedad, los mecanismos que participan en la sobrevida de los cardiomiocitos están siendo foco de nuestro estudio. Hemos demostrado, que la infección ejerce efectos antiapoptóticos sobre células cardíacas aisladas. Nuestra hipótesis es que la inmunidad innata cardíaca estaría involucrada en el mantenimiento de la sobrevida de los miocitos así como en la defensa contra el parásito. Objetivo general: determinar la participación de la respuesta inmune innata cardíaca en el desarrollo de la enfermedad de Chagas experimental murina. Objetivos específicos: 1) Analizar el compromiso de TLRs en la respuesta anti-apoptótica y de autofagia de cardiomiocitos aislados de ratones salvajes y de ratones deficientes en TLR4, TLR2 y en MyD88, molécula adaptadora de la señalización por TLRs, sometidos a la infección con el parásito. 2) Determinar la importancia de la actividad cisteín proteasa parasitaria en el grado de infectividad y la sobrevida de cultivos primarios de ratones salvajes infectados con parásitos transgénicos que poseen disminuída o nula actividad cisteín proteasa. 3) Establecer la cinética de expresión de TLR2/TLR6, TLR4 y TLR9, factores antiapoptóticos (Bcl-2, Bcl-xL, etc.), daño cardíaco y la carga parasitaria en el tejido cardíaco de ratones infectados salvajes y/o deficientes antes mencionados. Materiales y Métodos: Los animales serán infectados i.p. con 5x103 parásitos y se determinará la cinética de expresión de los mediadores mencionados por western blot e inmunofluorescencia, la carga parasitaria será determinada por qRT-PCR. Como controles se procesarán animales inyectados con solución salina. En cultivos primarios de cardiomiocitos de ratones neonatos salvajes y deficientes infectados se estudiará la carga parasitaria, la activación de los mecanismos microbicidas (producción de óxido nítrico, metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, ciclooxigenasa, etc.), producción de citoquinas y expresión de moléculas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-xL, Bax, etc.). Se explorará la tasa de apoptosis en cultivos deprivados de suero. La autofagia se analizará por microscopia electrónica. Cultivos controles serán mantenidos en medio o tratados con ligandos de los diferentes TLRs. Resultados preliminares sugieren que tanto TLR2 como Bcl-2 se incrementan en tejido cardíaco infectado. Esto nos lleva a profundizar en los mecanismos observados en cultivos y estudiarlos en un modelo in vivo, analizando la posible importancia que tiene la inmunidad innata cardíaca en el control del establecimiento de la infección. La comprensión de los mecanismos que mantienen la sobrevida de los cardiomiocitos y su respuesta a la infección es importante ya que el conocimiento de las bases moleculares es fundamental para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos. Chagas disease is endemic in Central and South America and causes the most common myocarditis worldwide. We have previously reported that the cardiotrophic parasite Trypanosoma cruzi, its etiological agent, protects cardiomyocytes against apoptosis induced by growth factor deprivation activating the PI3K/Akt and MEK1/ERK signaling pathways. Recent studies have shown that local innate immunity plays a key role in initiating and coordinating homeostatic as well as defense responses in the heart. One of the mechanisms by which the innate immune system senses the presence of foreign antigens is through TLRs. The stimulation of these receptors leads to the activation and nuclear translocation of NF-kB transcription factor and the production of cytokines. Proinflammatory cytokines, in turn, appear to play a central role in the orchestration and timing of the intrinsic cardiac stress response providing, under different situations, instantaneous anti-apoptotic cytoprotective signals, which allow tissue repair and/or remodeling. The aim of the present project is to study the cardiomyocyte innate immune responses to T. cruzi infection and its role in target cell protection from apoptosis. Specific objectives: 1) Study the mechanism triggered by TLR in the anti-apoptotic response and parasite load of infected cardiomyocyte primary cultures from wild type and mice deficient in TLR2, TLR4 or MyD88. 2) Determine the effect of parasite cisteín protease activity on primary cultures from wild type mice. 3) Determine the TLR signaling-involvement in parasite load and survival indicators in deficient mice. Preliminary results showed us that cardiac-TLR2 may be involved in the anti-apoptotic effect elicited by the parasite and prompted us to establish the mechanisms triggered by the innate immunity that mediate parasite persistence within the host cell.

Dispersión agrícola y cambio social en las Sierras de Córdoba (ca. 1000 a C.- 1600 d C.) Agricultural spread and social change in Córdoba Hills (ca. 1000 b C- 1600 a D.)

El proceso cultural en las Sierras de Córdoba fue habitualmente concebido como marginal con respecto al Noroeste Argentino. Tras el establecimiento del esquema básico de la secuencia prehispánica, a mediados del siglo pasado, se definió una etapa agroalfarera de cronología tardía, que continuaba a una extensa etapa precerámica cuyos límites se aproximaban a la transición Pleistoceno-Holoceno. Se hacía referencia, de este modo, al advenimiento de un modo de vida agrícola y aldeano, que reemplazaba a otro basado en la caza y recolección. Dicha transformación, alternativamente atribuida a la población cazadora local o a una migración de grupos agricultores desde regiones vecinas, se habría consumado hacia 1500 AP, fijando uno de los límites de la dispersión de la agricultura andina. Es necesario destacar la extremada escasez y el carácter indirecto de las evidencias arqueológicas utilizadas para sustentar la ocurrencia de tal proceso. Asimismo, la vigencia de supuestos que han comenzado a mostrar inconsistencias con los resultados de las recientes investigaciones. Entre ellos, principalmente, el que asume que la introducción de la agricultura dio paso a una transformación radical de las sociedades prehispánicas, constituyendo un hito fundamental en su devenir histórico, el comienzo de una nueva etapa. Nuestros últimos estudios en el sector central de las Sierras de Córdoba apuntaron, entre otros objetivos, a reconocer indicadores arqueológicos directos de producción agrícola, así como de la manipulación y consumo de plantas cultivadas. Los primeros resultados nos permiten vislumbrar un escenario complejo que desafía los modelos vigentes. El consumo de maíz, por ejemplo, parece haber antecedido por muchos siglos a la adopción de prácticas agrícolas. El acceso a este cultígeno, sumado a otros elementos, indicaría cambios entre los cazadores-recolectores serranos, promovidos por su integración en redes macrorregionales que los vincularon con sociedades agricultoras de la vertiente oriental andina y quizás del Chaco Santiagueño, por lo menos desde 2500 AP. En definitiva, la agricultura no parece haber sido adoptada rápidamente ni provocado transformaciones profundas e inmediatas en la organización de los grupos prehispánicos. Se ha observado, por el contrario, la incorporación gradual de distintas innovaciones que incluso permiten relacionar la manipulación y más tarde el cultivo de plantas domesticadas, con procesos de intensificación productiva de mayor escala temporal. Uno de nuestros objetivos en este proyecto consiste, básicamente, en profundizar las investigaciones en curso a fin de ampliar el cuerpo de datos con el cual analizar y discutir el problema de la dispersión agrícola en la región. Ello implica el tratamiento de diferentes líneas de evidencia, en particular: 1) la distribución regional de sitios arqueológicos y las modalidades de ocupación de las tierras cultivables; 2) la búsqueda de superficies de cultivo en sitios estratificados; y 3) estudios arqueobotánicos, polínicos y de isótopos estables. Se entiende que no le corresponde a la arqueología asumir apriorísticamente el significado histórico de la introducción de la agricultura, sino establecerlo en cada caso puntual a través de la investigación concreta. Nuestro segundo objetivo consiste, por lo tanto, en delinear los cambios (económicos, tecnológicos, políticos, sociales) que acompañaron al proceso de dispersión agrícola. Ello implica el tratamiento de diferentes problemas, entre otros: 1) las prácticas de apropiación de los recursos silvestres; 2) la continuidad y cambio tecnológico; 3) la movilidad y la articulación microambiental; y 4) los aspectos políticos y sociales ligados a prácticas como la molienda grupal y la producción del arte rupestre. The radical chage of societies from hunter-gatherers to farmers in 1500 BP was considered a milestone whitin the cultural process of pre-hispanic societies in Cordoba Hill. But there is a shortage of archaeological remains to support this change and there are weak hypotheses of absolute transformations. During the last years, our studies carried out on the central area of Cordoba Hill have tried to recognize direct archaeological signs of agriculture production as well as the handling and consumption of crops. The first results show a complex set that challenges the current theoretical models. For example, the corn was probably eatten prior to its adoption for farm practices. Our first main consists in increasing a corpus of data about the spread of agriculture in Cordoba region that we have been researching for the last years. These researches involve different lines of evidence: 1-regional location of archaeological sites and kinds of occupation on cultivable lands; 2-the search for plots at archaeological sites; 3-archaeobotanical, pollen and stable isotopes studies. Our second main consists in outlining changes within the spread of agriculture. It implies to considering different problems: 1-the practices to gatherer wild resources; 2-the continuity and changes of technologies; 3-the mobility and the articulation on the micro-environment; 4-political and social aspects in connection with activities such as groupal grinding and rock art productions.

Mecanismo de interacción, calcio dependiente, entre Calcineurina y PERK, involucrado en el Estrés de Retículo Endoplásmico. Ca2+ -dependent mechanism of interaction between Calcineurin and PERK involved in Endoplasmic Reticulum Stress.

El Estrés de Retículo Endoplásmico (RE) es inducido por la acumulación de proteínas sin plegar en el lumen de la organela. Esto se puede observar en diversas situaciones fisio-patológicas como durante una infección viral o en proceso isquémico. Además, contribuye a la base molecular de numerosas enfermedades ya sea índole metabólico (Fibrosis quística o Diabetes Miellitus) o neurodegenerativas como mal de Alzheimer o Parkinson (Mutat Res, 2005, 569). Para restablecer la homeostasis en la organela se activa una señal de transducción (UPR), cuya respuesta inmediata es la atenuación de la síntesis de proteína debido a la fosforilación de subunidad alpha del factor eucariótico de iniciación de translación (eIF2α) vía PERK. Esta es una proteína de membrana de RE que detecta estrés. Bajo condiciones normales, PERK está inactiva debido a la asociación de su dominio luminar con la chaperona BIP (Nat Cell Biol, 2000, 2: 326). Frente a una situación de estrés, la chaperona se disocia causando desinhibición. Recientemente, (Plos One 5: e11925) se observó, bajo condiciones de estrés, un aumento de Ca2+ citosólico y un rápido incremento de la expresión de calcineurina (CN), una fosfatasa citosólica dependiente de calcio, heterodimérica formada por una subunidad catalítica (CN-A) y una regulatoria (CN-B). Además, CN interacciona, sin intermediarios, con el dominio citosólico de PERK favoreciendo su trans-autofosforilación. Resultados preliminares indican que, astrocitos CNAβ-/- exhibieron, en condiciones basales, un mayor número de células muertas y de niveles de eIF2α fosforilado que los astrocitos CNAα-/-. Hipótesis: CNAβ/B interacciona con PERK cuando el Ca2+ citosólico esta incrementado luego de haberse inducido Estrés de RE, lo cual promueve dimerización y auto-fosforilación de la quinasa, acentuándose así la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteínas. Esta activación citosólica de PERK colaboraría con la ya descrita, desinhibición luminal llevada cabo por BIP. Cuando el Ca2+ citosólico retorna a los niveles basales, PERK fosforila a CN, reduciendo su afinidad de unión y disociándose el complejo CN/PERK. Objetivo general: Definir las condiciones por las cuales CN interacciona con PERK y regula la fosforilación de eIF2α e inhibición de la síntesis de proteína. Objetivos específicos: I-Estudiar la diferencia de afinidades y dependencia de Ca2+, de las dos isoformas de CN (α y β) en su asociación con PERK. Además verificar la posible participación de la subunidad B de CN en esta interacción. II-Determinar si la auto-fosforilación de PERK es diferencialmente regulada por las dos isoformas de CN. III-Discernir la relación del estado de fosforilación de CN con su unión a PERK. IV-Determinar efectos fisiológicos de la interacción de CN-PERK durante la respuesta de Estrés de RE. Para llevar a cabo este proyecto se realizarán experimentos de biología molecular, interacción proteína-proteína, ensayos de fosforilación in vitro y un perfil de polisoma con astrocitos CNAβ-/- , CNA-/- y astrocitos controles. Se espera encontrar una mayor afinidad de unión a PERK de la isoforma β de CN y en condiciones donde la concentración de Ca2+ sea del orden micromolar e imite niveles del ión durante un estrés. Con respecto al estado de fosforilación de CN, debido a los resultados preliminares, donde solo se la encontró fosforilada en condiciones basales, se piensa que CN podría interactuar con mayor afinidad con PERK cuando CN se encuentre desfosforilada. Por último, se espera encontrar un aumento de eIF2α fosforilado y una acentuación de la atenuación de la síntesis de proteína como consecuencia de la mayor activación de PERK por su asociación con la isoforma β de CN en astrocitos donde el Estrés de RE se indujo por privación de oxigeno y glucosa. Estos experimentos permitirán avanzar en el estudio de una nueva función citoprotectora de CN recientemente descrita por nuestro grupo de trabajo y sus implicancias en un modelo de isquemia. The accumulation of unfolded proteins into the Endoplasmic Reticulum (ER) activates a signal transduction cascade called Unfolding Protein Response (UPR), which attempts to restore homeostasis in the organelle. (PKR)-like-ER kinase (PERK) is an early stress response transmembrane protein that is generally inactive due to its association with the chaperone BIP. During ER stress, BIP is tritrated by the unfolded protein, leading PERK activation and phosphorylation of eukaryotic initiation factor-2 alpha (eIF2alpha), which attenuates protein síntesis. If ER damage is too great and homeostasis is not restored within a certain period of time, an apoptotic response is elicited. We recently demonstrated a cytosolic Ca2+ increase in Xenopus oocytes after induce ER stress. Moreover, calcineurin A/B, a an heterotrimeric Ca2+ dependent phosphatases (CN-A/B), associates with PERK increasing its auto-phosphorylation and significantly enhancing cell viability. Preliminary results suggest that, CN-Aβ-/- knockout astrocytes exhibit a significant higher eIF2α phosphorylated level compared to CN-Aα-/- astrocytes. Our working hypothesis establishes that: CN binds to PERK when cytosolic Ca2+ is initially increased by ER stress, promoting dimerization and autophosphorylation, which leads to phosphorylation of elF2α and subsequently attenuation of protein translation. When cytosolic Ca2+ returns to resting levels, PERK phosphorylates CN, reducing its binding affinity so that the CN/PERK complex dissociates. The goal of this project is to determine the conditions by which CN binding to PERK attenuates protein translation during the ER stress response and subsequently, to determine how the interaction of CN with PERK is terminated when stress is removed. To perform this project is planed to do molecular biology experiments, pull down assays, in vitro phosphorylations and assess overall mRNA translation efficiency doing a polisome profile.

Caracterización funcional de zeb1 en células en diferenciación y metastásicas. Functional characterization of zeb1 in differentiating and metastatic cells

IDENTIFICACIÓN ZEB1 (Zinc Finger E-box Binding Homeobox) es un factor de transcripción funcionalmente asociado con la diferenciación de células como miocitos, neuronas, células de sostén y linfocitos T, además de estar involucrado en la Transición Epitelial-Mesenquimatosa (EMT) de los tumores sólidos epiteliales. Aún no se ha revelado en profundidad la participación de ZEB1 en los procesos de proliferación y diferenciación en los que participa. Estamos interesados en los mecanismos de regulación de ZEB1 y los factores que intervienen en los procesos de diferenciación y transformación celular. HIPÓTESIS 1. Las vías de señalamiento regulan el estado de fosforilación y la función de ZEB1 en la célula normal, el cual se desregularía en la célula neoplásica llevando a cambios en la función normal de ZEB1 y consecuentemente a metástasis. 2. IGF-1 es la señal que, en asociación con el supresor de tumores CCN6, juega un rol causal en la regulación de ZEB1 y esto a su vez en la metástasis del cáncer de mama. OBJETIVO GENERAL: establecer el rol funcional de ZEB1, su interrelación con otros factores y su regulación en los procesos de diferenciación y transformación celular. OBJETIVOS ESPECIFICOS (incluye Materiales y Métodos) 1. Estudiar la participación de vías de señalización sobre la función biológica de ZEB1 en células normales y neoplásicas. Analizaremos la participación de señales intracelulares en la fosforilación de ZEB1 por experimentos de ganancia/pérdida de función de la vía (por uso de inhibidores farmacologicos, mutantes silenciadoras y siRNAs), lo cual sera evaluado en EMSAs, ChIP, transfecciones, inmunofluoresc, etc. 2. Estudiar el rol de IGF-1 y CCN6 sobre la expresión y el estado de fosforilación de ZEB1 en tumores mamarios benignos, no invasivos e invasivos y metastatizantes. A) Se estudiará la expresión y localización subcelular de ZEB1 en líneas celulares de cáncer mamario y en xenotransplantes de ratón con variada expresión de CCN6. B) Investigar la relevancia de la fosforilación de ZEB1 mediada por IGF-1 en el EMT por experimentos con ganancia/pérdida de función. RESULTADOS ESPERADOS Esperamos poder delinear la/s vía/s de señalización intracelular que fosforilan ZEB1 y así conocer sobre la regulación del mismo. Podremos establecer algunas bases para entender la biología básica del cáncer de mama e identificar blancos terapéuticos. IMPORTANCIA Un amplio conocimiento de los factores de transcripción y sus vías de señalamiento es necesario para el desarrollo tanto de pruebas diagnósticas como para la identificación de nuevos blancos terapéuticos para neoplasias. De modo que resulta de gran importancia clínica determinar el rol de ZEB1, sus proteínas y vías reguladoras en el proceso de oncogénesis. El desarrollo del proyecto prevé la formación de dos tesistas. Se continuaran colaboraciones con dos grupos extranjeros y se iniciara una tercera. ZEB1 (Zinc Finger E-box Binding Homeobox) is a transcription factor involved in cell differentiation and Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) of epithelial tumors. We are interested in the study of mechanisms of regulation (pre and post transcriptional). S.A.1. To investigate post translational mechanisms of ZEB1 regulation in normal and cancer cells. We will analyze the involvement of intracellular signals in phosphorylation of ZEB1 by gain- and lost-of-function experiments. S.A.2. A) To determine the role of IGF-1 signaling and CCN6 in regulating the expression of hypo- and hyperphosphorylated forms of ZEB1 in benign and malignant breast cell lines and in xenograft mouse models by overexpressing and inhibiting CCN6 in breast cancer cells. B) To investigate the relevance of CCN6-mediated ZEB1 phosphorylation to EMT, breast cancer invasion and metastasis. The role of CCN6 on ZEB1 phosphorylation and regulation of E-cadherin, induction of EMT, invasion and metastasis of breast cells will be investigated using gain- and loss-of-function experiments.

Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la inmunosupresión observada durante la infección con Trypanosoma cruzi: Rol de la vía PD-1/PD1-L y E3 ubiquitina ligasas. Molecular mechanismns involved in the immunosupression during Tryapanosoma cruzi infection. Role of PD1-PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases.

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, un problema de salud importante en América Latina, así como también en América Central, ya que causa infección crónica afectando a millones de personas [1]. Durante esta enfermedad se han descripto varias alteraciones de la respuesta inmune, entre ellas una severa inmunosupresión durante la etapa aguda de la infección, tanto en humanos como en ratones. Células T provenientes de ratones infectados activadas in vitro, muestran reducción en la respuesta proliferativa a mitógenos, característica de un estado de inmunosupresión [2-4]. La falla del sistema inmune durante estadios tempranos de la infección probablemente colabore con la diseminación y el establecimiento del parásito. Un gran número de estudios se han focalizado en la identificación de mecanismos moleculares responsables del fenómeno de inmunosupresión, entre los mecanismos citados se ha demostrado presencia de células supresoras [5-9], factores inmunosupresores presentes en el parásito [2, 3, 10-13], producción excesiva de óxido nítrico [14], disminuida producción de IL-2 y reducida expresión del receptor de IL2 en células de bazo de animales infectados [9, 15-17]. Muchos de estos mecanismos han sido exhaustivamente investigados, sin embargo no está del todo claro si existen mecanismos adicionales involucrados en la inmunosupresión de la célula T. Adicionalmente, en los últimos años nuevas moléculas que median la regulación negativa de la célula T, entre las cuales están PD-1/PD1-L [18], arginasa [19] y E3 ubiquitina ligasas [20-22], han sido reportadas durante inmunosupresión en diversas infecciones. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is parasite causing chronic infections in human and other mammalian species. There is an important immunosupresion during the acute phase of the infection that contribute to the dissemination and installation of the parasite. Several studies have been focused on identifying the mechanisms involved in the immunosupresion; however it is not clear if there are additional mechanisms implicated. In addition, during the last years new molecules involved in the negative T cell regulation such as PD-1/PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases (E3-Ub-Lig) have been reported. It has been demonstrated, that E3-Ub-Lig control the amount and localization of intracellular signal mediators, limiting T cell activation. Moreover, these mechanisms mediate the immunosupresion observed during several infections leading to the persistence of the pathogen in the host. In this project the role of E3-Ub-Lig on the T cell immunosupresion and hipo-response mechanisms observed during T. cruzi infection will be studied. On the other hand, it has been reported that some pathogens release proteins with E3-Ub-Lig activity modifying the ubiquitination process to promote their survival and replication in the host. Recently, a protein with E3-Ub-Lig activity was identified in T. cruzi, however its target molecule has not been discovered yet. Therefore, one of the aims of this project consists on studying different potential target molecules for this novel E3-Ub-Lig. In addition, during the last years, important progress has been done about the biological rol of PD-1/PD1-L pathway on the regulation of the immune response in several infections. However, it is not well known how PD-1/PD1-L pathway transduces signals at intracelular level to block T cell response. Because of this, it is interesting to study if there is any relation between the PD-1/PD1-L pathway and E3-Ub-Lig on the mechanism of T cell immunosupression during T. cruzi infection.

EFECTOS DE LA MELATONINA EXÓGENA Y LA SUBNUTRICIÓN SOBRE EL DESARROLLO EMBRIONARIO TEMPRANO EN OVINOS DURANTE EL ANESTRO ESTACIONAL

Debido a que la subnutrición afecta la eficiencia reproductiva en las ovejas, disminuyendo las tasas de gestación y/o causando un retraso en el desarrollo embrionario; y conociendo que, la melatonina es la hormona mediadora de los efectos entre la estacionalidad y el eje reproductivo, actuando con efectos beneficiosos tanto a nivel embrionario como del tracto reproductivo, nuestra hipótesis de partida plantea que el tratamiento con melatonina exógena podría ser una herramienta útil para paliar o revertir los efectos adversos que causa la subnutrición sobre la supervivencia embrionaria en las explotaciones ovinas. El presente trabajo investigará los efectos de la melatonina exógena sobre la competencia oocitaria y la viabilidad embrionaria (tanto in vivo como in vitro), así como también sobre la población de receptores esteroideos en el endometrio, en ovejas subnutridas durante el anestro estacional. El experimento se realizará en Río Cuarto (33º 08’S, 64º 20’O), utilizando 30 ovejas adultas Corriedale. Durante el anestro, la mitad de ellas serán implantadas con melatonina. Luego de 45 días, las ovejas serán asignadas a una de dos dietas con diferentes niveles energéticos: dieta control (C) y dieta baja (B). De esta forma se establecerán 4 grupos de acuerdo a su nivel nutricional y a la presencia o no del implante de melatonina en un diseño factorial 2x2, con todos los grupos balanceados por peso y condición corporal. El día del inicio del consumo de las dietas experimentales, se sincronizarán los celos de todas las ovejas (progestágeno+eCG), luego de lo cual se cubrirán todas las ovejas en celo. Desde los 15 días previos a la sincronización de celos y hasta la ovulación, se realizarán ecografías ováricas diariamente, para evaluar la dinámica de la población folicular y luteal. Cada 3 días, se obtendrán muestras de sangre de todas las ovejas para determinar los niveles plasmáticos de metabolitos y hormonas. El día 5 tras el celo, se procederá a la recuperación de los embriones por laparotomía ventral y lavado uterino. Inmediatamente después se realizará una ovariohisterectomía en cada una de las ovejas. Los ovarios serán procesados para la obtención y maduración de ovocitos, y su posterior fecundación in vitro. Además se obtendrán muestras de útero para realizar el estudio de la población de receptores esteroideos y la expresión de los mismos en el tejido por inmunohistoquímica. No existe mucha información en la literatura respecto a los efectos combinados del tratamiento con melatonina y del plano de alimentación sobre los parámetros reproductivos. No obstante, en la especie ovina y en el hemisferio norte, se han descrito algunos aspectos realmente interesantes en la mejora de la eficiencia reproductiva, particularmente en situaciones en las que está disminuida, por lo cual seria importante evaluar y caracterizar los efectos del uso de la melatonina exógena sobre la viabilidad embrionaria en Argentina.

Mecanismos epigenéticos involucrados en regulación génica específica durante los procesos de diferenciación del protozoario intestinal giardia lamblia.

Se define como epigenética al área de la genética que estudia todos aquellos cambios heredables que no se encuentran determinados en la secuencia primaria del ADN (Albert y col., 2002). Los cambios epigenéticos son variados; los más conocidos son la metilación de bases nitrogenadas (que no existe en Giardia; Prucca y col., 2008), las modificaciones post-traduccionales de histonas y los Complejos de Remodelación de Cromatina. En los últimos años se ha avanzado en el estudio de la regulación de la expresión de genes mediante estos procesos. El mecanismo de ARNi está íntimamente relacionado con la modificaciones post-traduccionales de histonas; regulando la estructura de cromatina y permitiendo que los complejos primarios de transcripción de genes puedan o no expresar la información. Nuestra hipótesis de trabajo se basa en que cambios epigenéticos están involucrados en la regulación génica específica durante los procesos de adaptación y diferenciación de Giardia. Para responder la misma se plantean los siguientes objetivos específicos: 1. Identificar modificaciones de histonas y su relación con los procesos de diferenciación celular en Giardia. 2. Caracterizar enzimas involucradas en las modificaciones post-traduccionales de histonas. 3. Determinar qué tipo de modificaciones participan en la activación o silenciamiento de la expresión de genes específicos. 4. Manipular al parásito para aumentar o disminuir las modificaciones epigenéticas que pueden estar involucradas en los procesos de diferenciación a quiste o en la variación antigénica para una mayor comprensión de los mecanismos moleculares involucrados. 5. Determinar el estado redox de Giardia durante el enquistamiento y la variación antigénica. 6. Participación de ARN-helicasas en los Complejos Remodeladores de Cromatina.

Evaluación de STAT3, COX-2 Y P53 y su papel en la progresión de la inflamación crónica del epitelio bucal.

Durante el proceso oncogénico se desencadenan un sinfín de alteraciones moleculares producto de las características genéticas interindividuales y la exposición a carcinógenos ambientales. Aquellas células “transformadas” son capaces de establecer nuevos vínculos con el entorno, desarrollarse e invadir nuevos tejidos. El proceso inflamatorio es un factor indiscutible en el desarrollo y la progresión tumoral. En un ambiente de inflamación crónica, el daño tisular permanente y la liberación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno generan daños en el material genético y en enzimas de reparación, como ocurre con p53. Además, recientemente se pudo observar que NFkB induce la expresión de citoquinas proinflamatorias (IL-6, TNFa), chemoquinas (IL-8), moléculas de adhesión (MMP), COX2 (ciclooxigenasa-2) e iNOS (Óxido Nítrico Sintasa), generándose un mecanismo de retroalimentación positiva. De estas moléculas, la expresión de COX-2 podría ser una de las promotoras del desarrollo tumoral. STAT3 pertenece a una familia de factores de transcripción latente en el citoplasma y sería indispensable para la activación de numerosas proteínas oncogénicas y en el control de la respuesta del sistema inmune. Más aún, al regular negativamente a p53 sería la responsable de desencadenar el desarrollo tumoral en ausencia de mutaciones de p53. Se realizará un estudio de casos y controles, con el objetivo de conocer qué ocurre con la expresión de COX-2 y STAT3 y evaluar la presencia de las mutaciones de p53 como moléculas clave en el inicio de la transformación tumoral. La población en estudio estará comprendida por tres grupos: pacientes con procesos inflamatorios persistentes en lesiones potencialmente malignas (casos de estudio); pacientes con procesos inflamatorios persistentes en lesiones no potencialmente malignas (control 1) y pacientes con diagnóstico de cáncer bucal (control 2). Se purificarán los ácidos nucleicos de las muestras de biopsia bucal obtenidas de manera rutinaria para confirmar el diagnóstico estomatológico y se analizarán mutaciones de p53 mediante PCR y niveles de expresión de COX2 y STAT3 por PCR semicuantitativa.

Auditoría basada en riesgos. Modelo integrado de cuantificación del riesgo combinado en procesos de auditoría de estados financieros.

La auditoría es el proceso que agrega un grado razonable de seguridad en relación a que la información contenida en los estados financieros se encuentra libre de incorrecciones materiales respecto del marco de información utilizado en su elaboración. Los procesos de auditoría de estados financieros incorporan el siguiente modelo de riesgos: Ra = Ri x Rfc x Rfd Donde: Ra = Riesgo de auditoría, (posibilidad que el auditor arribe a una conclusión equivocada tras la realización de la auditoría), Ri = Riesgo inherente (posibilidad que la información a ser exteriorizada en los estados financieros contenga incorrecciones materiales en si mismas), Rfd = Riesgo de falta de control (posibilidad que información con incorrecciones materiales en si misma no sea prevenida, detectada o corregida por el sistema de control interno), Rfd = Riesgo de falta de detección (posibilidad que información con icorrecciones materiales no prevenida, detectada o corregida por el sistema de control interno, tampoco lo sea por los procedimientos que emplea el auditor), A partir de la referida formulación matemática el auditor de estados financieros puede obtener una medida objetivo del riesgo de falta de detección a partir de: a) La definición de un nivel aceptable de riesgo de auditoría y b) la valoración del riesgo combinado que es producto del riesgo inherente y del riesgo de falta de control. Podemos expresar lo anterior mediante la expresión: Rfdo = Raa / (Ri x Rfc) Donde: Rfdo = Riesgo de falta de detección objetivo, Raa = Riesgo de auditoría aceptable, Ri = Riesgo inherente, Rfc = Riesgo de falta de control, La obtención de una medida objetivo de riesgo de falta de detección constituye en un factor determinante a la hora de planificar y ejecutar una auditoría de estados financieros ya que incide: a) en la determinación del nivel de significación, b) en la selección de los procedimientos de auditoría alternativos con idénticos propósitos, c) en la determinación del alcance y oportunidad de los referidos procedimientos. El objetivo del presente proyecto es el desarrollo de un modelo integrado de cuantificación del riesgo inherente y del riesgo de falta de control – riesgo combinado – con vistas a lograr medidas del riesgo de falta de detección objetivo que puedan actuar como ejes conductores en los procesos de auditoría de estados financieros.

Análisis de componentes de la inmunidad innata en infecciones virales: implicancias en la patogénesis.

El estudio de células del sistema inmune innato en infecciones virales se ha centrado principalmente en las células dendríticas y las células NK. Los objetivos de este proyecto de investigación son evaluar el nivel de apoptosis de neutrófilos y las vías de activación de muerte celular en la infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) y caracterizar la respuesta inmune inducida en monocitos/macrófagos infectados in vitro con el Encefalitis San Luis virus (ESLV). En individuos con infección por VIH se evaluará la apoptosis (anexina y citomorfología), la expresión de moléculas de adhesión y de receptor Toll-like (TLR) en neutrófilos. Además, se determinará la concentración sérica de citocinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias y de moléculas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas. La infección por ESLV será realizada en una línea celular mieloide en la que se detectaran los antígenos virales a distintos días post-infección viral (inmunofluorescencia y citometría de flujo). Además, se determinará la expresión de antígenos de superficie y TLR. En sobrenadantes de cultivos de monocitos infectados con diferentes genotipos de ESLV a distintos días post-infección serán cuantificada la concentración de citocinas y determinada la apoptosis de monocito/macrófagos infectados (anexina y citomorfología). Este proyecto posibilitará una mayor comprensión de la regulación de la apoptosis en la infección por VIH, conocimiento que podrá ser de utilidad para avanzar en investigaciones futuras para el entendimiento de los mecanismos y la regulación de la apoptosis de componentes del sistema inmune innato. En la infección por ESLV el conocimiento de las características de la activación del macrófago cuando es infectado por este virus, los inmunomoduladores liberados y el impacto de la infección sobre la apoptosis de ésta célula podrían orientar hacia posibles blancos para el diseño futuro de estrategias terapéuticas o profilácticas contra esta infección.

Estudio de los factores infección con trypanosoma cruzi y nutrición sobre receptores innatos tipo toll y scavenger, adipocinas y otros mediadores de inflamación asociados a la obesidad en modelos experimentales.

En el modelo experimental in vivo en ratones C57BL/6 wild type tratados con streptozotocina y alimentados con una dieta grasa/fructosa se inducirá obesidad (IR) y DM2, con el propósito de: 1-Investigar la influencia de la infección con Trypanosoma cruzi como un potencial factor sinérgico pro-aterogénico. Se evaluará a distintos tiempos post infección, el tejido adiposo visceral y las repercusiones en aorta y corazón principalmente, por estudios histopatológicos. En plasma, se determinará el perfil de lípidos, lipoproteínas y otros parámetros metabólicos: glucosa e insulina, estos últimos para calcular el índice HOMA-IR, que refleje el grado de insulino- resistencia. Asimismo, se evaluarán ácidos grasos libres y proteínas de fase aguda circulantes como respuesta al proceso inflamatorio. 2- Evaluar la expresión de receptores tipo Toll (TLR 2, 4 y 9) y scavenger clase B (CD36) en el tejido adiposo visceral y aorta principalmente e identificar los tipos celulares que participan en las lesiones vasculares (macrófagos -M-, granulocitos y linfocitos T). 3- Determinar las citocinas inflamatorias: TNF, IL1-, IL12, IL18, IFN e IL6 y la quimiocina atractante de monocitos (CCL2; MCP-1) y adipocinas (leptina, resistina y adiponectina) en plasma y otros mediadores inflamatorios como óxido nítrico, especies reactivas del oxígeno (ROS) y metaloproteasas (MMPs) en tejido adiposo visceral y aorta. Se cuantificarán además las moléculas de adhesión intercelular ICAM-1 y VCAM-1, involucradas en otros modelos de obesidad e insulino-resistencia. En el modelo in vitro 1- Investigar la influencia de la infección con T. cruzi y ácidos grasos saturados y monoinsaturado (C18, oleico) y el efecto de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) oxidadas y agregadas frente a LDL nativas (control) en una línea celular de adipositos. Se estudiará la expresión basal y post-estímulo de los receptores innatos tipo Toll y CD 36. 2- Cuantificar las adipocinas pro- inflamatorias (leptina, resistina y MCP-1)y adiponectina (antiinflamatoria) en el sobrenadante de cultivos frente a los estímulos propuestos y la expresión de las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1.