Preservación de la información génica en bacterias; mecanismos y modulación molecular. Preservation of the genetic information in bacteria; mechanisms and molecular modulation.

El objetivo general del presente proyecto es contribuir a la caracterización genética y bioquímica molecular de mecanismos involucrados en el mantenimiento de la información génica, a través del estudio de sistemas fisiológicos involucrados en la prevención, reparación y tolerancia de mutaciones. Dichos sistemas se encuentran evolutivamente conservados y ampliamente distribuidos en los seres vivos. La importancia de los mismos se refleja en el hecho que su deficiencia genera en humanos, enfermedades genéticas, apoptosis y cáncer; y en especies procariotas, células denominadas "hipermutadoras". En los últimos años el estudio de la hipermutabilidad en bacterias ha cobrado gran interés ya que se le atribuye importancia en procesos infectivos y en aspectos básicos relacionados a evolución. Nuestro modelo de estudio son las bacterias Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, siendo esta última especie no solo modelo de estudio sino también especie de referencia. P. aeruginosa es una bacteria ambiental gram negativa, e importante patógeno oportunista de humanos. Específicamente nos proponemos estudiar en P. aeruginosa algunos aspectos particulares del Sistema de Reparación de Bases Apareadas Incorrectamente (Mismatch Repair System, MRS), del Sistema de Prevención/Reparación de Lesiones Oxidativas generadas a través de 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxo-dG ó GO) y el papel de las ADN Polimerasas de baja fidelidad en la modulación de la tasa de mutación. Asimismo estamos interesados en estudiar en cepas de E. coli deficientes en el sistema Dam, la existencia de subpoblaciones de alta estabilidad genética debido a la eliminación de posibles mutantes por incremento de la expresión de los otros componentes del MRS. Metodológicamente la caracterización bioquímica de factores proteicos se llevará a cabo utilizando proteínas recombinantes purificadas, análisis de interacción proteína-proteína y proteína-ADN mediante electroforesis en geles y resonancia plasmónica de superficie (Biacore), mutagenésis dirigida in vitro, y estudios de complementación en cepas mutantes específicas. Aspectos fenotípicos y de regulación génica en cultivos de biofilm y células en suspensión serán estudiados mediante la construcción de cepas mutantes, fusiones transcripcionales, PCR en tiempo real, western blot y microscopia de fluorescencia confocal.

Acciones tróficas de GABA: implicancias en la diferenciación sexual del cerebro. Trophic actions of GABA: Implications for sexual differentiation of the brain.

En el hipotálamo en desarrollo, el ácido gamma-amino butírico (GABA) produce depolarización neuronal, pudiendo incluso disparar potenciales de acción y causar la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje. Esto se debe a que la concentración intracelular de Cl- es alta respecto al medio extracelular, por lo que en reposo el potencial de equilibrio de GABA es más positivo que el potencial de membrana. A medida que el desarrollo transcurre, la concentración intracelular de Cl- disminuye y se produce un cambio en la respuesta de depolarizante (etapa excitatoria) a hiperpolarizante (etapa inhibitoria). Se ha demostrado que este cambio ocurre también en neuronas hipotalámicas in vitro. El dimorfismo sexual del cerebro de los vertebrados es consecuencia de la acción del estrógeno aromatizado a partir de andrógenos segregados por el testículo durante el "periodo crítico" del desarrollo cerebral. Evidencias previas de nuestro y otros laboratorios pusieron de manifiesto diferencias en el crecimiento y diferenciación de neuronas que no podían atribuirse a la acción hormonal, ya que ocurren antes que se inicie el brusco aumento de la secreción gonadal, alrededor del día 18 de desarrollo embrionario en la rata (E18). Además de las diferencias morfológicas, encontramos diferencias sexuales en la forma que las neuronas hipotalámicas responden a muscimol, un agonista específico del receptor GABAA. A los 9 días in vitro (9 DIV) la respuesta a muscimol fue hiperpolarizante (etapa inhibitoria) y además fue de mayor amplitud, área y duración en machos respecto a hembras. Esto nos indica que las neuronas provenientes de embriones machos son intrínsecamente diferentes a las de embriones hembra aún antes de la acción organizadora de los esteroides sexuales. En base a estas evidencias nos propusimos continuar nuestros estudios sobre la participación de GABA en la determinación de diferencias sexuales en el cerebro antes de la acción organizadora de los esteroides gonadales. Para ello, en cultivos de neuronas hipotalámicas de E16 separados por sexos, estudiaremos:- la respuesta a muscimol de las neuronas, en la etapa excitatoria (2 DIV) de la acción de GABA.- las composición de subunidades de los receptores GABAA en la etapa excitatoria/inhibitoria de la acción de GABA.- la participación de los receptores GABAA sobre el crecimiento neurítico.- la activación de la vía de las MAP quinasas por muscimol.- la participación de los receptores GABAA sobre el crecimiento axonal inducido por estradiol in vitro.Toda la metodología propuesta es de uso habitual en nuestro laboratorio e involucra herramientas de la electrofisiología y la biología celular-molecular; como patch-clamp, cultivo de neuronas hipotalámicas, Western blot, RT-PCR, entre otras. Esperamos encontrar diferencias sexuales en la amplitud, área y duración de la respuesta de las neuronas hipotalámicas al muscimol a los 2 DIV, y que éstas se deban a una diferente composición de subunidades del receptor GABAA. En cuanto a la participación del receptor GABAA en la neuritogenesis, esperamos encontrar mayor longitud neurítica en neuronas macho como así también una activación sexualmente dimórfica de la vía de las MAP quinasas. Además esperamosque la acción de un antagonista del receptor GABAA interfiera con la axogénesis inducida por estradiol in vitro, característica que muestra diferencia sexual también a favor de los machos, lo que reforzaría nuestra hipótesis. La importancia y originalidad de este proyecto reside en la evaluación de la participación del sistema GABAérgico en la determinación de características que durante el desarrollo, podrían estar involucradas en la determinación de diferencias sexuales permanentes en el cerebro adulto independientemente de la acción de los esteroides sexuales. Hasta la fecha, no ha sido evaluada la influencia de los receptores GABAA en la diferenciación sexual del cerebro antes de la acción organizadora de los esteroides gonadales.

Estrategias estadístico-computacionales avanzadas para análisis de expresión de proteínas/genes en cáncer. Advanced statistical and computational strategies for protein/gene expression analysis in cancer.

El objetivo de este proyecto, enmarcado en el área de metodología de análisis en bioingeniería-biotecnología aplicadas al estudio del cancer, es el análisis y caracterización a través modelos estadísticos con efectos mixtos y técnicas de aprendizaje automático, de perfiles de expresión de proteínas y genes de las vías metabolicas asociadas a progresión tumoral. Dicho estudio se llevará a cabo mediante la utilización de tecnologías de alto rendimiento. Las mismas permiten evaluar miles de genes/proteínas en forma simultánea, generando así una gran cantidad de datos de expresión. Se hipotetiza que para un análisis e interpretación de la información subyacente, caracterizada por su abundancia y complejidad, podría realizarse mediante técnicas estadístico-computacionales eficientes en el contexto de modelos mixtos y técnias de aprendizaje automático. Para que el análisis sea efectivo es necesario contemplar los efectos ocasionados por los diferentes factores experimentales ajenos al fenómeno biológico bajo estudio. Estos efectos pueden enmascarar la información subycente y así perder informacion relavante en el contexto de progresión tumoral. La identificación de estos efectos permitirá obtener, eficientemente, los perfiles de expresión molecular que podrían permitir el desarrollo de métodos de diagnóstico basados en ellos. Con este trabajo se espera poner a disposición de investigadores de nuestro medio, herramientas y procedimientos de análisis que maximicen la eficiencia en el uso de los recursos asignados a la masiva captura de datos genómicos/proteómicos que permitan extraer información biológica relevante pertinente al análisis, clasificación o predicción de cáncer, el diseño de tratamientos y terapias específicos y el mejoramiento de los métodos de detección como así tambien aportar al entendimieto de la progresión tumoral mediante análisis computacional intensivo.

Agentes deletéreos para Trypanosoma cruzi: Patogenia de la infección de placenta humana en la enfermedad congénita de Chagas, in vitro. Deleterious agents to Trypanosoma cruzi: Pathogenia of the human placenta infection in the congenital Chagas disease.

Trypanosoma cruzi, agente causal del Chagas, atraviesa la barrera placentaria y produce la enfermedad congénita. Objetivo general: Analizar si el T. cruzi, agente causal del Chagas, produce alteraciones trofoblásticas de las vellosidades coriónicas mediadas por óxido nítrico (principal agente deletéreo contra T. cruzi) y estrés oxidativo con variaciones que pudieran depender de la disponibiidad de L-arginine, sobre placentas en modelos in vitro de co-cultivos de explantos de vellosidades coriónicas, de sinciciotrofoblasto aislado y de células derivadas del trofoblasto de placentas humanas en interacción con distintas cepas del Trypanosoma cruzi, que pudieran dar alguna luz en la explicación de mecanismos involucrados en la infección placentaria y en algunos síndromes clínicos de la transmisión congénita del Chagas. Objetivos Específicos: a) Describir alteraciones estructurales y presencia de T. cruzi en vellosidades coriónicas de placentas humanas procedentes de co-cultivos con Trypanosoma cruzi in vitro (y sus respectivos controles), mediante técnicas histológicas y PCR analizando secuencias de ADN específicas del parásito.b) Establecer la localización y expresión proteica y la expresión transcripcional de las isoformas II y III de la Öxido Nítrico Sintasa sobre la misma población muestral de (a) mediante técnicas inmunohistoquímica, RT-PCR y semicuantificación con software adecuado. c) Analizar la susceptibilidad a la infección por el T. cruzi del citotrofoblasto (CTB) y sinciciotrofoblasto (STB) placentario aislado in vitro. d) Determinar concentraciones de óxido nítrico y estrés oxidativo del sinciciotrofoblasto (STB) aislado ante la infección por T. cruzi. e) Relacionar concentraciones de L-arginina con infección del trofoblasto aislado. f) Relacionar inhibiciones de la eNOS y de la arginasa con infección trofoblástica y óxido nítrico producido.Se emplearán métodos y técnicas de Biología celular y molecular, mediciones hormonales, enzimáticas, proteicas, parasitarias y bioquímicas en medios sobrenadantes de cultivo, de inmuno-detección de epitopes proteicos en tejidos, expresión de ARN por RT-PCR, Western blot, detección de DNA en tejidos por PCR, Cuantificaciones morfométricas. En general, el presente proyecto podría redundar en beneficios para un sector de la población de las áreas endémicas para esta enfermedad de bajos recursos económicos, sociales y culturales, mediante la obtención de datos que pudieran explicar algunos mecanismos de síndromes clínicos descriptos en esta patología y que pudieran participar en la transmisión congénita de la enfermedad de Chagas.

Aspectos moleculares del desarrollo de biofilms, la colonización de la planta y la emisión de compuestos orgánicos volátiles en bacterias rizosféricas. Molecular aspects of biofilm development, plant colonization and microbial volatile organic emission in rhizospheric bacteria.

Las bacterias que habitan la rizosfera y que poseen la capacidad de provocar un efecto positivo sobre las plantas son denominadas en su conjunto como Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR). Estas bacterias han desarrollado diferentes estrategias para adaptarse a diversas condiciones ambientales. La capacidad para responder a variaciones en la disponibilidad nutricional permite la persistencia de la bacteria en el suelo y mejora sus posibilidades para colonizar la planta hospedadora. En la naturaleza, a menudo las bacterias se encuentran en estructuras de comunidades de microorganismos interconectados denominados biofilms, con un estilo de vida diferente al de la vida en forma planctónica. La formación del biofilm podría representar una estrategia de supervivencia de la rizobacteria a condiciones adversas del suelo. Por Microscopía Confocal de Barrido Láser (CLSM), hemos observado que Rhizobium leguminosarum desarrolla un biofilm característico sobre una superficie abiótica. Hemos identificado algunos de los factores genéticos que influyen en su formación. El presente proyecto propone avanzar en el conocimiento de los factores ambientales y genéticos que influyen sobre la capacidad de las rizobacterias para formar biofilms y su impacto en la interacción con las plantas. A través de enfoques genéticos (mutacionales y de expresión génica) y análisis por CLSM nos proponemos acercarnos a un modelo de los factores de superficie, extracelulares y regulatorios propios de la bacteria que influyen en las propiedades de adhesión y la formación de biofilms. Por último, se intentará correlacionar la emisión de compuestos orgánicos volátiles por las bacterias rizosféricas con ciertos aspectos de la promoción del crecimiento de las plantas.

Fosforilación de lípidos señales disparada por ABA, NaCl y manitol en coleóptilos, raíces y células de aleurona de cebada (Hordeum vulgare). Lipid signaling phosphorylation triggered by ABA, NaCl and mannitol in coleoptile, roots and aleurone cells of barley (Hordeum vulgare).

Es bien conocido que los fosfolípidos son un conjunto de moléculas capaces de funcionar como reguladores en diversos procesos celulares. Al respecto, este proyecto tiene como objetivo dilucidar la participación de los mismos, en particular ácido fosfatídico (PA) y diacilglicerol pirofosfato (DGPP) durante el efecto antagónico de ABA en la germinación y como reguladores de la respuesta al estrés salino en la plántula. Se sabe que las plantas responden de forma rápida y adecuada a una situación de estrés modificando el patrón de fosfolípidos de sus membranas, lo cual lleva a un cambio global en las actividad de lípido quinasas, fosfatasas y a la expresión/represión de genes particulares. El desarrollo de la propuesta permitiría responder dos cuestiones básicas: conocer la relación entre fosfolípidos y ABA e indagar su participación durante la señal de estrés. La relevancia de la propuesta radica en la necesidad de ampliar el conocimiento sobre una de las causas mas importantes "estrés salino" que afecta la germinación de la semilla y luego el crecimiento y desarrollo de la plántula. En principio se evaluara a nivel morfológico, bioquímico y molecular el efecto de ABA y de fosfolípidos. Se pretende indagar sobre cambios a nivel de vacuolización en protoplastos aislados, actividad de enzimas relacionadas, pH intracelular, nivel de fosfolípidos y enzimas implicadas en su metabolismo y también efectos sobre la expresión génica. Por otro lado, se analizara los niveles de fosfolípidos y enzimas relacionadas con su metabolismo en raíces y coleoptilos de semillas que germinaron bajo condiciones de estrés. Asimismo, se identificaran los cambios morfológicos provocados por el estrés en la longitud de coleóptilos y raíces. Por ultimo como indicador de una respuesta al estrés se evaluara los cambios en los niveles de prolina. La importancia del proyecto es determinar el papel que desempeñan PA y DGPP en la germinación y durante la respuesta al estrés.

Estudios in vitro e in vivo de agentes fotosensibilizadores y su aplicación en terapia fotodinámica. In vitro and in vivo studies of photosensitizer agents and its application in photodynamic therapy.

Muchos esfuerzos se están realizando en el diseño de nuevos métodos para la eliminación de las células tumorales y así inhibir el crecimiento neoplásico. Entre los métodos no convencionales se encuentran la Terapia Fotodinámica.La Terapia Fotodinámica (TFD) es un tratamiento experimental de algunos tipos de cáncer, basado en el efecto citotóxico inducido en el tejido tumoral, por la acción combinada de una droga (fotosensibilizador) y la luz visible. El fotosensibilizador posee la propiedad de absorber la luz y reaccionar con el oxígeno molecular, produciendo una forma activa del oxígeno: el oxígeno singlete (1O2) que oxida diversas moléculas biológicas, induciendo un efecto citotóxico que se traduce en la regresión tumoral. Los nuevos avances en la dosimetría de la luz, así como la búsqueda de una segunda generación de nuevos fotosensibilizadores más eficaces que los actualmente utilizados, han permitido incluir protocolos de Terapia Fotodinámica en numerosos centros hospitalarios principalmente para el tratamiento de cánceres de pulmón, vejiga, esófago y piel. Plantas fototóxicas, sus metabolitos fotosensibilizantes y sus posibles usos; En general, dentro de las especies vegetales tóxicas existen aquellas denominadas plantas alergénicas, que son las que pueden producir sus efectos indeseables por vía dérmica. También existen aquellas que pueden producir efectos tóxicos por vía sistémica. Sin embargo, coexiste en la naturaleza otro grupo de plantas tóxicas que desencadenan sus efectos nocivos bajo la acción de la luz, por lo que son llamadas plantas fototóxicas, cuyos principios activos son comúnmente denominados agentes fotosensibilizantes La apoptosis como blanco terapéutico contra el cáncer: Los conocimientos moleculares sobre la apoptosis adquiridos en los últimos años están siendo aplicados al desarrollo de nuevos fármacos que puedan modular selectivamente las señales involucradas en la muerte de las células. Una de las razones que justifica el interés en el estudio de este tipo de moléculas, es que una de las características más tempranas en la transformación de la células neoplásicas esta relacionada con la incapacidad de responder a los estímulos de muerte. Esto lleva a una desregulación del proceso de apoptosis desencadenando una proliferación descontrolada. Los otros eventos que desencadenan el cáncer son, la invasión vascular y la metástasis a distanciaLa adquisición de resistencia a los efectos citotóxicos de los tratamientos anticancerígenos ha emergido como un significante impedimento para el efectivo tratamiento de la enfermedad. Por ello, en el presente proyecto se investigará si la adquisición de resistencia a TFD inducida en la línea celular estudiada es conferida por el aumento de la proteína MDRP1 a través de la vía de señalización PI3K/Akt. Además, se estudiará la correlación entre la posible resistencia a drogas y la inducción de apoptosis, analizando los mecanismos involucrados. Los resultados obtenidos contribuirán a dilucidar y entender los mecanismos moleculares implicados en la resistencia y sensibilidad tumoral a la TFD, y de esta manera mejorar la eficacia de dicha terapia antitumoral para sensibilizar a las células a la apoptosis. OBJETIVOS Estudiar el efecto de agentes fotosensibilizadores de origen sintético (ftalocianinas), comercialmente ya aprobadas por la FDA (Me-ALA), de origen natural (antraquinonas), y obtenidas en procesos nanotecnologicos (nanofibras) respecto a su capacidad de inducir la muerte celular en sistemas experimentales in vivo, para el desarrollo de nuevas drogas de aplicación en Terapia Fotodinámica (PDT). Estudiar las señales de apoptosis que se desencadenan, combinando la PDT con iRNA (antisurvivina) con la finalidad de aumentar la eficiencia de la muerte tumoral. Estudiar los mecanismos de resistencia a la Terapia Fotodinámica en carcinoma de células escamosas con fotosensibilizadores permitidos (Me-ALA).

Mecanismos Celulares y Moleculares que regulan la Secreción, Proliferación y Muerte de Células Lactotropas. Cellular and molecular mechanisms that regulate secretion, proliferation and death of lactotroph cells.

El presente proyecto está dirigido a estudiar los mecanismos celulares y moleculares involucrados en la regulación de la población de lactotropas, como resultado del balance entre los procesos de proliferación y muerte celular correlacionados con la secreción de prolactina. Dentro de las vías de transducción de señales involucradas se determinará la activación de las diferentes isoformas de PKC utilizando inhibidores específicos y la participación de la vía MAPK-ERK1/2 en cultivos primarios adenohipofisarios y en la línea tumoral GH3B6. Además, se completará la caracterización morfológica y bioquímica de los diferentes procesos de muerte celular inducidos por bromocriptina en modelos de regresión de prolactinomas. Se incorporan al presente proyecto nuevas líneas de investigación dirigidas a estudiar la participación de receptores estrogénicos nucleares y de membrana sobre la actividad secretoria y proliferativa de células lactotropas. Se fija como objetivo la identificación de los mismos y su translocación intracelular en respuesta a estímulos específicos. Estas investigaciones se realizarán en cultivo primario de adenohipófisis, a nivel de microscopía electrónica y confocal. La participación de las isoformas alfa y beta de receptores estrogénicos intracelulares y de membrana en los efectos del estradiol sobre la proliferación y secreción de PRL se determinará mediante el uso de agonistas y antagonistas específicos en cultivo primario de adenohipófisis y de la línea GH3B6. Un tema de actualidad es el estudio de vías de señalización involucradas en las acciones del estrógeno en interacción con neuropéptidos o factores de crecimiento, estableciendo la interacción entre los receptores de membrana, además de posibles "crosstalk" entre diferentes rutas de transducción de señales. Como aporte a este tópico se propone estudiar los efectos genómicos y no genómicos del estradiol en interacción con TRH o FGF-2, modulando la actividad secretoria y proliferativa de las células lactotropas. Los datos obtenidos podrán contribuir al conocimiento de nuevas estrategias utilizadas para disminuir el crecimiento de tumores, inhibiendo moléculas claves como receptores de estrógenos, factores de crecimiento y algunas involucradas en las vías de señalización.

Búsqueda e identificación de polimorfismos en genes asociados con una efectividad farmacológica disminuida. Caracterización molecular, hallazgos bioquímicos y clínicos y su respectiva correlación con la respuesta farmacológica en el tratamiento de enfermedades crónicas e infecciosas.

En medicina, es frecuente encontrar diferencias en la respuesta de una misma droga en distintos individuos. Algunos factores que contribuyen con esta respuesta diferencial incluyen variables como edad, biodisponilidad y absorción gastro-intestinal de los medicamentos, interacción entre fármacos, hábitos alimentarios y factores genéticos. Dentro de los factores genéticos, encontramos polimorfismos genéticos que afectan la absorción, el metabolismo y el transporte de fármacos, como así también receptores de los mismos y/o, la interacción con otros genes. Algunos polimorfismos genéticos que contribuyen a una respuesta farmacológica disminuida han sido descriptos en patologías como, la hipercolesterolemia, artritis reumatoidea, cáncer, diabetes, hipertensión arterial, esquizofrenia, asma, hepatitis C y SIDA, entre otras. Nuestro estudio pretende: I) Identificar polimorfismos en genes que codifican para enzimas metabolizadoras de fármacos, para canales iónicos y, para receptores de fármacos (como por ejemplo polimorfismos en el receptor beta 2 adrenérgico en pacientes tratados con salbutamol que presentan bronquiolitis). II) Identificar la presencia de un polimorfismo en el gen CES 1 que codifica para la enzima carboxilesterasa 1 (en una población hospitalaria), que participa en la activación de la prodroga oseltamivir utilizada en el tratamiento de la Gripe A (H1N1). Los resultados obtenidos podrán ser de gran utilidad en el tratamiento médico, ya que permitirá optimizar el uso de fármacos, disminuir los efectos secundarios causados por los mismos, y proponer el empleo de otros fármacos.

Especies nativas del Centro de Argentina: potencial agroindustrial y perspectivas para la producción de energía y biocombustibles

La región centro de Argentina posee una elevada riqueza de especies nativas y endémicas, con potencial valor agroindustrial. Flourensia campestris y F. oolepis (Asteraceae), conforman comunidades denominadas "chilcales". Son reconocidas por sus usos tradicionales como aromática, tintórea, medicinal y para leña -en especial raíz- y presentan potencial aplicación en la agroindustria como insecticida, antimicrobiana, antifúngica y aleloquímica. Trabajos realizados en nuestro laboratorio con extractos acuosos de hojas secas de F. campestris demostraron un potente efecto herbicida sobre semillas de Lactuca sativa. Mediante el fraccionamiento biodirigido por CC y técnicas espectrales (GC-MS, IR, 1H-RMN, 13C-RMN, 2D-RMN) se pudo identificar la estructura molecular del ácido hamanásico ((4S, 8S)–7–carboxi–8–hidroxi- 1(2), 12(13)-dien-bisaboleno). Su presencia en F. campestris, y su actividad biológica, no habían sido descriptos con anterioridad y sugieren un potencial herbicida natural. En ambas especies se puede apreciar a simple vista su alto contenido en resinas, compuestos propuestos para reemplazar a los hidrocarburos en la fabricación de pinturas, pegamentos y adhesivos. Estudios preliminares en nuestro laboratorio señalan un contenido de entre un 20-40 % de resinas en la biomasa aérea de Flourensia, sin embargo, no existen al presente estudios sobre su composición química ni sobre su potencial aplicación industrial. Por otro lado, el desarrollo de cultivos energéticos, para la generación de electricidad por combustión de biomasa, constituye uno de los objetivos principales dentro de las políticas de energías renovables a nivel nacional (programa GENREN) y mundial. Las especies con mayor aptitud deben poseer altas tasas de crecimiento y un alto grado de tolerancia de adversidades bióticas y abióticas, lo que permitiría cultivarlos en áreas marginales para la agricultura tradicional, hechos que coinciden con las especies de Flourensia en estudio. Asimismo, el tratamiento térmico o pirólisis de biomasa proveniente de la agricultura es una de las alternativas de reutilización de la misma con distintos fines. Este pasivo ecológico puede ser transformado en productos de alto valor agregado. En base a lo expuesto, el objetivo general de este proyecto es investigar en las dos especies vegetales endémicas de Argentina y abundantes en la provincia de Córdoba, las características de los metabolitos secundarios en relación a su potencial aplicación agroquímica (herbicidas naturales), la composición de sus resinas para uso industrial y su rendimiento como materia prima de alta densidad energética para la cogeneración de electricidad y producción de biocombustible, en función del desarrollo de una agricultura sustentable. Para ello, el proyecto propone incrementar el rendimiento de la purificación de ácido hamanásico e identificar y cuantificar su presencia en otros órganos de F. campestris y en F.oolepis, con el objetivo de evaluar su efecto herbicida, mediante bioensayos en cápsulas de Petri, en especies cultivables y malezas. Los usos potenciales de las resinas se estudiarán en base a la identificación de sus compuestos químicos mediante su extracción y análisis espectrales (CG-MS). A través de la determinación del poder calorífico, contenido de cenizas y de nitrógeno de la biomasa aérea de las especies, se evaluará su rendimiento energético para emplear como biocombustible sólido en la cogeneración eléctrica, mientras que con la aplicación del método fast pyrolysis y análisis por CG-MS, se determinará su aplicación o su posterior modificación de acuerdo a las características del bio-oil deseado. El destino energético de las especies propuestas permitiría iniciar de manera rápida la etapa de domesticación y puesta en cultivo, y avanzar en el desarrollo de aplicaciones industriales más sofisticadas, como el aprovechamiento de sus propiedades bioactivas o el desarrollo de productos industriales basados en sus metabolitos secundarios.

Caracterización biológica y molecular de un rhabdovirus causal de mosaico estriado amarillo, en maíz (Zea mays L.) en la provincia de Córdoba.

La familia Rhabdoviridae incluye varios patógenos económicamente importantes de cultivos, entre los más de 70 virus que afectan plantas. Estos últimos se clasifican en los géneros Cytorhabdovirus y Nucleorhabdovirus, dependiendo de si producen inclusiones en el espacio perinuclear, o si desarrollan viriones citoplasmáticos. Los integrantes de esta familia infectan gran cantidad de monocotiledóneas y dicotiledóneas y la mayoría son dependientes de transmisión por insectos. Las interacciones virus-vector son altamente específicas, y se ha registrado la replicación en insectos, del rhabdovirus que transmiten a las plantas. Cada especie de rhabdovirus induce un amplio espectro de síntomas en sus plantas huéspedes, y estos van desde la falta de efectos discernibles hasta la muerte total de la planta. El maíz (Zea mays L.) es el cultivo más ampliamente distribuido a nivel mundial y uno de los principales cultivos de cereales, ubicándose tercero en el ranking de producción en el mundo. En maíz se ha citado la presencia de varios rhabdovirus, entre estos American wheat striate mosaic virus (AWSMV), Cereal chlorotic mottle virus (CCMV), Maize mosaic virus (MMV), Maize sterile stunt virus (strains of Barley yellow striate virus), Northern cereal mosaic virus (NCMV) y Maize fine streak virus (MFSV). Ninguno de ellos reportado en Argentina. Desde 2001 un rhabdovirus es observado, por sintomatología y microscopía electrónica, en plantas de maíz de diferentes localidades de la provincia de Córdoba. Esta virosis pudo ser transmitida en dos oportunidades a plantas de maíz sanas mediante Peregrinus maidis y logró amplificarse mediante RT-PCR con iniciadores degenerados, el gen de la polimerasa L. Nuestra hipótesis es que el agente causal de la sintomatología de mosaico estriado amarillo en maíz sería un rhabdovirus emergente en Argentina, diferente de Maize mosaic virus (MMV), transmitido por delfácidos, que puede aislarse y mantenerse en condiciones controladas. El objetivo del presente trabajo es generar conocimientos biológicos, moleculares y epidemiológicos sobre el agente causal de la sintomatología en maíz de mosaico estriado amarillo. Para ello se colectarán plantas de maíz con sintomatología de mosaico estriado amarillo, en distintas localidades donde se presente la sintomatología. Las muestras se observarán al microscopio electrónico en cortes ultrafinos y en “leaf dip". Los viriones se purificarán, extraerá el RNA de los mismos, y obtendrá la secuencia de nucleótidos, para compararla con otras publicadas de virosis vegetales y se obtendrán homologías. Se realizarán transmisiones experimentales de esta virosis, por incisiones vasculares y mediante el empleo de diferentes especies de insectos vectores. Importancia del proyecto El avance de patógenos tropicales hacia zonas templadas es una de las causas de la aparición de las virosis emergentes, que se caracterizan por producir epifítias al ingresar a nuevos ecosistemas. El Maize mosaic virus (MMV) es un rhabdovirus que produce una de las virosis más importantes del maíz en el continente americano. Determinar la identidad del agente etiológico del mosaico estriado amarillo y establecer su relación con MMV es fundamental para desarrollar medidas proactivas y diseñar estrategias de manejo de esta nueva enfermedad.

Investigación de defectos genéticos en el sistema de la fosforilasa hepática en pacientes argentinos. Definición nosológica mediante una estrategia de análisis molecular. Investigation of genetic defects in the hepatic phosphorylase system in Argentinean patients. Nosological definition by molecular analysis strategy.

Las Enfermedades de Atesoramiento de Glucógeno (EAGs) también llamadas Glucogenosis comprenden un grupo de entidades causadas por una deficiencia enzimática específica relacionada con la vía de síntesis o degradación de esta macromolécula. La heterogeneidad fenotípica de los pacientes afectados dificulta la identificación de las diferentes variantes de EAG y por ende la correcta definición nosológica. En el Centro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas, CEMECO, se fueron definiendo los diferentes tipos de Glucogenosis a través de una estrategia multidisciplinaria que integra distintos niveles de investigación clínica y complementaria, laboratorio metabólico especializado, enzimático, histomorfológico y de análisis molecular. Sin embargo, en algunos enfermos, entre los que se encuentran aquellos con defectos en el sistema de la fosforilasa hepática (EAG-VI y EAG-IX), la exacta definición nosológica aún no está resulta. La EAG-VI se refiere a un defecto en la fosforilasa hepática, enzima codificada por el gen PYGL, mientras que la EAG-IX es causada por un defecto genético en una de las subunidades de la fosforilasa b quinasa hepática codicadas por los genes PHKA2, PHKB y PHKG2, respectivamente. El objetivo del presente trabajo es propender a la definición nosológica de pacientes con defectos en el sistema de la fosforilasa mediante una estrategia de análisis molecular investigando los genes PYGL, PHKA2, PHKB y PHKG2. Los pacientes incluidos en este estudio deberán ser compatibles de padecer una EAG-VI o EAG-IX sobre la base de síntomas clínicos y hallazgos bioquímicos. La metodología incluirá la determinación de la enzima fosforilasa b quinasa en glóbulos rojos y dentro del análisis molecular la extracción de DNA genómico a partir de sangre entera para la amplificación por PCR de los exones más las uniones exon/intron de los genes PHKG2 y PYGL y la extracción de RNA total y obtención de cDNA para posterior amplificación de los cDNA PHKA2 y PHKB. Todos los fragmentos amplificados serán sometidos a análisis de secuencia de nucleótidos. Resultados esperados. Este trabajo, primero en Argentina, permitirá establecer las bases moleculares de los defectos del sistema de la fosforilasa hepática (EAG-VI y EAG-IX). El poder lograr este nivel de investigación traerá aparejado, una oferta integrativa en el vasto capítulo de las glucogenosis hepáticas, con extraordinaria significación en la práctica asistencial para el manejo, pronóstico y correspondiente asesoramiento genético. Hepatic glycogen storage diseases (GSDs) are a group of disorders produced by a deficiency in a specific protein involved in the metabolism of glycogen causing different types of GSDs. Phenotypic heterogeneity of affected patients difficult to identify the different GSD variants and therefore the correct definition of the disease. In the “Centro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas”, CEMECO, were defined the different GSD types by a protocol which included complex gradual levels of clinical, biochemical, enzymatic and morphological investigation. However, in some patients, like those one with defects in the hepatic phosphorylase system (GSD-VI and GSD-IX) the exact definition of the disease has not yet been resolved. The GSD-VI is produced by a defect in the PYGL gen that encode the liver phosphorylase, while the GSD-IX is caused by a genetic defect in one of the Phosphorylase b kinase subunits, encoded by the PHKA2, PHKB and PHKG2 genes, respectively. The aim of the present study is to define the phosphorylase system defects in argentinian patients through a molecular strategy that involve the investigation of PYGL, PHKA2, PHKB and PHKG2 genes. Patients included in the present study must be compatible with a GSD-VI or GSD-IX on the bases of clinical symptoms and biochemical findings. The phosphorylase b kinase activity will be assay on in blood red cells. The molecular study will include genomic DNA extraction for the amplification of PHKG2 and PYGL genes and the total RNA extraction for amplification of the PHKA2 and PHKB cDNA by PCR. All PCR-amplified fragments will be subjected to direct nucleotide sequencing. This work, first in Argentina, will make possible to establish the molecular basis of the defects on the hepatic phosphorylase system (GSD-VI and GSD IX). To achieve this level of research will entail advance in the study of the hepatic glycogen storage disease, with extraordinary significance in the treatment, prognosis and the genetic counselling.

Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la inmunosupresión observada durante la infección con Trypanosoma cruzi: Rol de la vía PD-1/PD1-L y E3 ubiquitina ligasas. Molecular mechanismns involved in the immunosupression during Tryapanosoma cruzi infection. Role of PD1-PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases.

Trypanosoma cruzi es el agente causal de la enfermedad de Chagas, un problema de salud importante en América Latina, así como también en América Central, ya que causa infección crónica afectando a millones de personas [1]. Durante esta enfermedad se han descripto varias alteraciones de la respuesta inmune, entre ellas una severa inmunosupresión durante la etapa aguda de la infección, tanto en humanos como en ratones. Células T provenientes de ratones infectados activadas in vitro, muestran reducción en la respuesta proliferativa a mitógenos, característica de un estado de inmunosupresión [2-4]. La falla del sistema inmune durante estadios tempranos de la infección probablemente colabore con la diseminación y el establecimiento del parásito. Un gran número de estudios se han focalizado en la identificación de mecanismos moleculares responsables del fenómeno de inmunosupresión, entre los mecanismos citados se ha demostrado presencia de células supresoras [5-9], factores inmunosupresores presentes en el parásito [2, 3, 10-13], producción excesiva de óxido nítrico [14], disminuida producción de IL-2 y reducida expresión del receptor de IL2 en células de bazo de animales infectados [9, 15-17]. Muchos de estos mecanismos han sido exhaustivamente investigados, sin embargo no está del todo claro si existen mecanismos adicionales involucrados en la inmunosupresión de la célula T. Adicionalmente, en los últimos años nuevas moléculas que median la regulación negativa de la célula T, entre las cuales están PD-1/PD1-L [18], arginasa [19] y E3 ubiquitina ligasas [20-22], han sido reportadas durante inmunosupresión en diversas infecciones. Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is parasite causing chronic infections in human and other mammalian species. There is an important immunosupresion during the acute phase of the infection that contribute to the dissemination and installation of the parasite. Several studies have been focused on identifying the mechanisms involved in the immunosupresion; however it is not clear if there are additional mechanisms implicated. In addition, during the last years new molecules involved in the negative T cell regulation such as PD-1/PD1-L pathway and E3 ubiquitin ligases (E3-Ub-Lig) have been reported. It has been demonstrated, that E3-Ub-Lig control the amount and localization of intracellular signal mediators, limiting T cell activation. Moreover, these mechanisms mediate the immunosupresion observed during several infections leading to the persistence of the pathogen in the host. In this project the role of E3-Ub-Lig on the T cell immunosupresion and hipo-response mechanisms observed during T. cruzi infection will be studied. On the other hand, it has been reported that some pathogens release proteins with E3-Ub-Lig activity modifying the ubiquitination process to promote their survival and replication in the host. Recently, a protein with E3-Ub-Lig activity was identified in T. cruzi, however its target molecule has not been discovered yet. Therefore, one of the aims of this project consists on studying different potential target molecules for this novel E3-Ub-Lig. In addition, during the last years, important progress has been done about the biological rol of PD-1/PD1-L pathway on the regulation of the immune response in several infections. However, it is not well known how PD-1/PD1-L pathway transduces signals at intracelular level to block T cell response. Because of this, it is interesting to study if there is any relation between the PD-1/PD1-L pathway and E3-Ub-Lig on the mechanism of T cell immunosupression during T. cruzi infection.

Resonancia Magnética Nuclear aplicada al estudio de nuevos sistemas farmacéuticos y biológicos, complejos poliméricos y conjuntos de espines modelo. Nuclear Magnetic Resonance applied to the study of new pharmaceutical and biological systems, polymeric complexes and model spin clusters.

El presente proyecto plantea utilizar integralmente la técnica de Resonancia Magnética Nuclear en sólidos como un medio experimental que permite entender fenómenos de la física fundamental, como así también realizar aplicaciones de interés en el campo de la química, los desarrollos farmacéuticos y la biología. Novedosas técnicas experimentales serán empleadas, en conjunción con otras más tradicionales, en la caracterización de nuevas estructuras poliméricas acomplejadas a metales, membranas biológicas y compuestos de interés farmacéutico en vías de desarrollo, los cuales presentan el fenómeno de polimorfismo . Esto se llevará a cabo complementando los resultados de RMN en sólidos con técnicas tanto espectroscópicas como analíticas (Infrarrojo, Difracción de Rayos X, Calorimetría, RMN en solución) y trabajo interdisciplinario. Paralelamente al desarrollo de estos temas, profundizaremos mediante investigación básica, en la compresión de la dinámica cuántica y el surgimiento de la irreversibilidad en sistemas de espines nucleares. Observaremos en particular la generación, evolución y control de las coherencias cuánticas múltiples en sistemas cuánticos abiertos, lo cual nos da información sobre tamaño de clusters de espines. Esto permitirá la correcta implementación de secuencias de pulsos sofisticadas, como así también desarrollar nuevos métodos de medición aplicados a la caracterización estructural y a la dinámica molecular de sólidos complejos. Debemos resaltar que este proyecto está conectado con aspectos tanto básicos como aplicados de la RMN en sólidos como técnica experimental, la cual se desarrolla en el país únicamente en FaMAF-UNC. Se nutre además de trabajo multidisciplinario promoviendo la colaboración con investigadores y becarios de distintas áreas (física, química, farmacia, biología) provenientes de distintos puntos del país. Finalmente podemos afirmar que este plan impulsa la aplicación de la física básica proyectada a diferentes áreas del conocimiento, en el ámbito de la provincia de Córdoba. The aim of the present proyect is to use Nuclear Magnetic Resonance (NMR) as a complete techique that allows the understanding of fundamental physics phenomena and, at the same time, it leads to important applications in the fields of chemistry, pharmaceutical developments and biology. New experiments will be used together with traditional ones, in the characterization of new metal-polymer complexes, biological membranes and pharmaceutical compounds, some of them presenting polymorfism. NMR experiments will be complemented with diverse spectroscopic and analytical techniques: Infrared, X ray Diffraction, Thermal Analysis, solution NMR, as well as multidisciplinary investigation. Additionally, the present proyect plans to study in depth several aspects of quantum dynamics phenomena and decoherence in nuclear spin systems. The present proyect is connected with basic and applied aspects of the solid state NMR technique, developed in our country, only at FaMAF-UNC. It is is composed by multidisciplinary work and it promotes the collaboration with researchers and students coming from different fields (physics, chemistry, pharmaceutical developments, biology) and different points of our country.

Participación del tráfico y la distribución de proteínas en la polaridad y el desarrollo de procesos neuronales. Protein sorting and trafficking participation in neuronal processes polarity and development.

El estudio del tráfico intracelular en neuronas ha despertado gran interés en los últimos años, debido a que un gran número de enfermedades neurodegenerativas y neuropsiquiátricas parecen tener origen en en el transporte defectuoso de proteínas en estos tipos celulares. Mediante el uso de técnicas de biología celular y molecular, fuimos capaces de describir una de las vías que regula la fisión de las vesículas que llevan su cargo desde la última cisterna del Aparato de Golgi hacia la superficie celular en células epiteliales no polarizadas. Uno de los componentes clave de esa vía resultó ser la Proteina Kinasa D1 (PKD1), cuya actividad en el Aparato de Golgi es esencial para un normal transporte intracelular. Sorprendentemente, observamos que la PKD1 en neuronas con polaridad establecida no regula la fisión en el Golgi, pero si estaría involucrada en la selectividad y distribución (sorting) de vesículas cuyo cargo debe ser específicamente dirigido a las membranas dendríticas. El bloqueo de la actividad de la PKD1 no solamente cambia el destino final de estos cargos, que son enviados de esta forma a la membrana terminal del axón, sino que también es capaz de inducir defectos en el desarrollo y crecimiento de los procesos dendríticos a largo plazo. En este proyecto estudiaremos de que manera influye la perturbación del sorting, en ausencia de PKD1 activa y de otros componentes que la regulan, en la distribución de receptores de factores neurotróficos y de neurotransmisores glutamatérgicos, y cómo estos cambios en su distribución afectan el número, tamaño, y funcionalidad de los procesos neuronales (axones y dendritas). Estos resultados contribuirán a adquirir mayores conocimientos de los mecanismos dependientes del transporte y sorting de proteínas de membrana que participan en la regulación del crecimiento neuronal, los cuales a su vez aportarán información valiosa en la comprensión de un gran número de enfermedades neurológicas. The study of intracellular trafficking in neurons has arisen a great deal of interest in the last years, since a great number of neurodegenerative and neuropsychiatric disorders seem to be originated in abnormal protein transport in these type of cells. Using cell and molecular biology methodologies, we have been capable of describe one of the pathways that regulate the fission of vesicles that carry their cargo from the last Golgi Apparatus cisternae to the cell surface in non-polarized epithelial cells. One of the key components in this pathway is the Protein Kinase D1 (PKD1), whose activity in the Golgi Apparatus is essential for a normal intracelular transport. Surprisingly, we have observed that PKD1 does not regulate fission in neurons with established polarity, but it would be involved in vesicles' sorting at Golgi, particularly of those that carry specific dendritic cargo. Blocking PKD1 activity changes the final destination of these cargoes, which is now sent to the axons' terminal membranes, and also produces late dendritic development and growing defects. In this project we will study how sorting perturbation in absence of PKD1 and its regulators activities influences selectivity and distribution of neurotrophic and neurotransmitter receptors, and how these sorting changes affect number, size and functionality of neuronal processes (axons and dendrites). These results will help to acquire greater knowledge about transport and sorting mechanisms of neuronal growth regulatory membrane proteins. In addition, these studies will contribute with new valuable information necessary to understand numerous neurological diseases.