Búsqueda e identificación de polimorfismos en genes asociados con una efectividad farmacológica disminuida. Caracterización molecular, hallazgos bioquímicos y clínicos y su respectiva correlación con la respuesta farmacológica en el tratamiento de enfermedades crónicas e infecciosas

En medicina, es frecuente encontrar diferencias en la respuesta de una misma droga en distintos individuos. Algunos factores que contribuyen con esta respuesta diferencial incluyen variables como edad, biodisponilidad y absorción gastro-intestinal de los medicamentos, interacción entre fármacos, hábitos alimentarios y factores genéticos. Dentro de los factores genéticos, encontramos polimorfismos genéticos que afectan la absorción, el metabolismo y el transporte de fármacos, como así también receptores de los mismos y/o, la interacción con otros genes. Algunos polimorfismos genéticos que contribuyen a una respuesta farmacológica disminuida han sido descriptos en patologías como, la hipercolesterolemia, artritis reumatoidea, cáncer, diabetes, hipertensión arterial, esquizofrenia, asma, hepatitis C y SIDA, entre otras. Nuestro estudio pretende: I) Identificar polimorfismos en genes que codifican para enzimas metabolizadoras de fármacos, para canales iónicos y, para receptores de fármacos (como por ejemplo polimorfismos en el receptor beta 2 adrenérgico en pacientes tratados con salbutamol que presentan bronquiolitis). II) Identificar la presencia de un polimorfismo en el gen CES 1 que codifica para la enzima carboxilesterasa 1 (en una población hospitalaria), que participa en la activación de la prodroga oseltamivir utilizada en el tratamiento de la Gripe A (H1N1). Los resultados obtenidos podrán ser de gran utilidad en el tratamiento médico, ya que permitirá optimizar el uso de fármacos, disminuir los efectos secundarios causados por los mismos, y proponer el empleo de otros fármacos

Regulación supramolecular de la dinámica de biomembranas por Esfingolípidos y Fosfolípidos

Los cambios que ocurren durante el funcionamiento (normal o patológico) de biomembranas resultan de alteraciones de interacciones moleculares dinámicas. Éstas involucran a fenómenos supramoleculares críticos (cambios de fase, electrostáticos y topológicos) que regulan la organización, estabilidad, expresión y metabolismo de lípidos y proteínas de membrana. Para conocer los factores físico-químicos que controlan el comportamiento de biomembranas se deben utilizar técnicas que permitan un control preciso de la organización molecular. (...) Objetivos generales y específicos: El propósito a largo plazo de las investigaciones es establecer las bases moleculares y supramoleculares por las cuales interacciones entre esfingolípidos, fosfolípidos y sus derivados regulan la organización, reconocimiento y reactividad de biomembranas. Al presente se estudia: I) Control supramolecular de la catálisis enzimática interfacial por enzimas fosfohidrolíticas que median la transducción de señales a nivel de membrana. II) Modulación de la estabilidad de biomembranas por cambios críticos de composición de la interfase, interacciones y transiciones topológicas. III) Caracterización y transferencia a soportes sólidos y líquidos de capas monomoleculares de organización intermolecular controlada, formadas con membranas neuronales y gliales.

Parámetros magnéticos y estructura molecular

Los estudios realizados a través de este proyecto pretenden abarcar dos aspectos fundamentales en la Física Experimental y Teórica, los cuales son: a) Realizar estudios en investigación básica, orientados a acrecentar el conocimiento en ramas de la Física Molecular, utilizando la técnica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Para ello se obtienen e interpretan los parámetros magnéticos moleculares característicos y se desarrollan e implementan métodos de cálculo de gran potencia y tiempo de cómputo a fin de correlacionar los estudios de tales parámetros con la estructura geométrica y electrónica molecular y/o con las diversas interacciones moleculares que se puedan presentar. b) Presentar y desarrollar tecnología adicional que permita aplicaciones de la RMN a otras líneas de estudio y también la consolidación de la infraestructura experimental existente en la Universidad Nacional de Río Cuarto. Objetivos generales y específicos: Se plantea como objetivo global, el acrecentar el conocimiento de un conjunto de propiedades moleculares, estudiando una familia de compuestos orgánicos mediante la técnica de la RMN de alta resolución y el empleo de métodos de cálculo tipo ab-initio. (...) Se mencionan a continuación los objetivos específicos más importantes a alcanzar: * Proponer modelos y leyes empíricas que describan el comportamiento de los parámetros magnéticos pertenecientes a familias de compuestos orgánicos heterocíclicos en relación a su estructura electrónica y conformacional. * Compatibilizar los estudios empíricos con resultados teóricos. * Desarrollar nuevos métodos de cálculo a fin de obtener una función de onda que mejor aproxime lo anterior. * Orientar parte del trabajo experimental a diversas aplicaciones de la RMN, adaptando el equipamiento existente a otras técnicas y/o adquiriendo equipamiento para tal fin.

Nematodos para el control de insectos perjudiciales: Descripción y aspectos de la biología de poblaciones de nematodos entomófagos

Los nematodos entomopatógenos son verdaderos reguladores de poblaciones de insectos: son parásitos estrictos o facultativos y matan indefectiblemente al huésped que parasitan. Las familias Mermithidae, Heterorhabditidae y Steinernematidae son las más importantes de esta categoría. En Argentina poco se conoce acerca de estos nematodos, solo en Córdoba y Buenos Aires se están realizando estudios sobre el particular. Los resultados obtenidos en Córdoba, indican que la nematofauna autóctona es rica y variada: se ha descripto un nuevo género, cinco especies y numerosas poblaciones. Además se cuenta con el registro de cincuenta poblaciones más, en las regiones centro-sur de la Provincia. Además, se han estudiado diversos aspectos de la bioecología de algunas de las especies aisladas. Los resultados evidencian la presencia de un material con características particularmente interesantes en la relación huésped parásito y agresividad. El presente proyecto pretende contribuir al conocimiento de los nematodos detectados, recabar información acerca de la taxonomía, aspectos de la bioecología (resistencia, infectividad, modalidades del ciclo de vida, comportamiento de las larvas infectivas, especificidad, producción en condiciones de laboratorio-entre las principales). Estos trabajos están orientados a la selección de especies a ser utilizadas en el control biológico de insectos perjudiciales. Cabe mencionar que la naturaleza de este proyecto permite la participación de biólogos y alumnos interesados en la temática y por lo tanto la posibilidad de la formación de recursos humanos. Objetivos generales y específicos: El objetivo principal de esta línea de investigación es de contribuir al conocimiento de la diversidad de este grupo zoológico en nuestra provincia. Desde un punto de vista aplicado este estudio podría aportar el conocimiento de nuevos agentes para la utilización en el control biológico de insectos perjudiciales. Los objetivos específicos que se pretenden son: -Detección e identificación de poblaciones naturales. -Recuperación y obtención de cultivos puros. -Estudios taxonómicos y aspectos de bioecología de las poblaciones aisladas.

Interaccion de proteínas en estados intermediarios de plegamiento con membranas lipídicas

Comprender cómo una proteína adquiere su conformación tridimensional específica es un problema clave para la biología celular y molecular. Es un entretenido desafío intelectual y un problema de considerable importancia tecnológica debido al interés de expresar proteínas recombinantes biológicamente activas. Un fuerte incentivo es poder describir cómo ocurre el plegamiento en el medio celular, acoplado a la biosíntesis de la proteína y probablemente codificado por la secuencia primaria. La mayor parte de la información que disponemos, sin embargo, proviene de estudios estructurales, cinéticos, bioquímicos y termodinámicos in vitro de proteínas maduras. Particularmente importante pata la comprensión del problema del plegamiento ha sido la descripción de las rutas seguidas y de los estados intermedios de este proceso. Uno de estos estados intermedios es el glóbulo fundido: es un estado conformacional en el cual la proteína conserva su estructura terciaria. La proteína se encuentra parcialmente desplegada pero su grado de compactación es similar al del estado nativo. Aunque solo algunas proteínas pueden ser asimiladas en esa conformación, es aceptado que el glóbulo fundido es intermedio cinético entre la estructura nativa y la desplegada existencia universal. El estudio de proteínas en el estado de glóbulo fundido no sólo es relevante para comprender los procesos de plegamiento, sino también la inserción y translocación de proteínas solubles e intrínsecas en membranas lipídicas. (...) El objetivo general de este proyecto es estudiar las interacciones de proteínas en estados conformacionales intermedios con membranas lipídicas. El propósito es contribuir al conocimiento de los mecanismos por los cuales una proteína soluble puede, en ciertas circunstancias, penetrar y atravesar una membrana lipídica y estudiar de que manera el ambiente lipídico participa en el procesos de plegamiento de una proteína de membrana. Como modelo experimental se utilizará inicialmente a-lactoalbúmina, cuyo intermediario de plegamiento estable es el más estudiado y con la cual este grupo de trabajo posee experiencia. Se explorará también la posibilidad de utilizar otras proteínas, como anhidrasa carbónica, cuyos intermediarios de plegamiento pueden ser aislados. Se estudiarán particularmente los siguientes aspectos: 1. Estabilidad del intermediario en membrana 2. Estructura de intermediarios en membranas lipídicas. (...)

Circulación y epidemiología molecular de virus emergentes asociados a patologías humanas linfoproliferativas, neurológicas y gastrointestinales en Córdoba

Desde hace mucho tiempo las enfermedades diarreicas y linfoproliferativas constituyen un importante problema de Salud Pública. Sin embargo hasta el momento no existen datos sobre la prevalencia de los virus emergentes entericos y los retrovirus humanos HTLV-I y HTLV-II en la ciudad de Córdoba, información imprescindible para conocer la magnitud del problema y para la implementación de programas preventivos y asistenciales que reduzcan la diseminación y morbi mortalidad por estas patologías. Los objetivos generales de este proyecto son: * Establecer la prevalencia y perfil local de las infecciones producidas por los retrovirus humanos HTLV-I y HTLV-II en la Provincia de Córdoba. * Identificar, caracterizar y determinar la frecuencia etiológica de agentes virales emergentes asociados a gastroenteritis en la provincia de Córdoba. * Desarrollar, estandarizar e implementar metodologías moleculares suplementarias para el diagnóstico confirmatorio de la infección por retrovirus humanos y virus asociados a gastroenteritis. * Realizar estudios de epidemiología molecular para caracterizar las cepas circulantes en Córdoba. La importancia de la estandarización e implementación de metodologías serológicas y moleculares para los virus en estudio se fundamenta en la necesidad de disponer de técnicas sensibles y específicas que permitan realizar estudios continuados de la circulación de estos virus en nuestra comunidad. (...) Siendo la sangre vía transfusión una de las principales formas de transmisión de estos agentes y cuyo control a tiempo evitaría la diseminación de los mismos, creemos que nuestros resultados serán de fundamental importancia para ilustrar a las autoridades de salud sobre cuál es la situación en nuestro medio y poder así evaluar la necesidad de iniciar el control de los virus HTLV-I y HTLV-II en los bancos de sangre de nuestra ciudad, como se está haciendo en otros países no endémicos del mundo. Los resultados del proyecto informarán sobre la magnitud del problema en nuestro medio, los grupos más expuestos al riesgo de infección, la época del año en la que prevalecen las diferentes infecciones y otros datos que servirán para la aplicación de eventuales medidas preventivas (control de Bancos de Sangre, control de pacientes inmunodeprimidos hospitalizados por diarreas, etc.).

Fluctuaciones de orden local en sistemas moleculares

Existe actualmente un interés muy difundido por los fluidos anisotrópicos (cristales líquidos, polímeros) debido a la gran cantidad de aplicaciones que se pueden realizar con ellos (por ejemplo en la fabricación de displays, en medicina, biología, etc.). Su estudio también planea interesantes problemas desde un punto de vista de la física fundamental. Sin embargo, a pesar de esto es muy poco lo que se conoce acerca de la dinámica molecular, y el problema está abierto. Las técnicas más apropiadas en este campo son el estudio de las propiedades dieléctricas y la RMN (relajación spin-red). En esta última, hay una gran actividad en el campo experimental con el desarrollo de numerosas técnicas nuevas. Sin embargo, desde el punto de vista de la teoría de la relajación se continúa utilizando aproximaciones semiclásicas. Entonces, es necesario revisar las hipótesis fundamentales de la teoría de la RMN con el fin de extender su campo de aplicación a problemas complejos como los que plantean los fluidos anistrópicos. El propósito general de esta línea de trabajo es el de extender la teoría semiclásica de relajación nuclear en RMN para incluir la naturaleza cuántica del fenómeno. Al cabo de esta investigación se espera poder describir la relajación del orden dipolar en mesofaces ordenadas como los cristales líquidos, ferrofluídos, etc. (...) Al cabo de este período se espera avanzar en las siguientes tareas: 1. Contar con una ecuación maestra para la matriz densidad de spin lo suficientemente general para incluir los efectos mencionados, pero que a la vez permita la comparación con los resultados experimentales. Dejando de lado las suposiciones clásicas de alta temperatura y orden débil, y en el marco de la suposición de temperatura de spin, se estudiará una expansión de la ecuación maestra en inversas de las temperaturas de la red y de spin. Conservando términos de orden mayor que lineal (aproximación clásica) e introduciendo las interacciones spin-spin durante el tiempo de correlación de la red (memoria microscópica) se analizará la dependencia con la frecuencia de Larmor de T1D y T1Z. Las interacciones spin-spin se introducirán mediante un método perturbativo de operadores. 2. Comprender la razón física de la diferencia de comportamiento con la frecuencia de Larmor de los parámetros T1D y T1Z. 3. Generalizar el análisis para aplicarlo al tiempo de relajación spin-red en el sistema rotante T1r.

Manipulación acustica del orden y dinámica molecular en estructuras mesomorficas de organización lamelar. Acoustic manipulation of molecular order and dynamics in mesomorphic structures of lamellar organization.

El control de propiedades hidrodinámicas capaces de influir en la mecánica de ruptura y poración de sistemas lamelares o membranas es de fundamental interés para diferentes aplicaciones biotecnológicas. Resulta de particular interés la conexión entre los procesos microscópicos relacionados al tipo de moléculas o unidades básicas, el orden determinado en el auto-ensamblado de las mismas y la dinámica local del sistema, con las propiedades físicas que determinan el comportamiento macroscópico bajo estimulación acústica. Resultados logrados recientemente sugieren la existencia de resonancias hidrodinámicas que podrian ser utilizadas para lograr la inestabilidad del sistema a baja potencia acústica. Se realizaran estudios experimentales utilizando principalmente técnicas que combinan resonancia magnética nuclear (RMN) y la sonicación de la muestra. También se realizarán estudios teóricos y simulaciones numéricas que permitan modelar los sistemas bajo estudio. Se propone dar continuidad al desarrollo de una técnica de relaxometría magnética nuclear en la cual se estimula acústicamente a la muestra durante el proceso de relajación magnética nuclear, y continuar la implementación de técnicas de RMN con resolución espacial que permitan complementar los estudios mencionados. Se espera comprender los mecanismos físicos que determinan la estabilidad de fases lamelares, logrando un modelo verificable y consistente que permita relacionar las propiedades mecánicas e hidrodinámicas con las propiedades de orden y dinámica molecular. Asimismo, se espera lograr avances en el desarrollo de las técnicas experimentales involucradas. La importancia del proyecto radica en el enfoque del problema. A diferencia de casi la totalidad de los estudios reportados, nuestro interés se enfoca en mecanismos de interacción entre la membrana y el campo acústico que sean eficientes a baja potencia acústica, en un régimen donde los gradientes térmicos y la cavitación sean despreciables.

Preservación de la información génica en bacterias; mecanismos y modulación molecular. Preservation of the genetic information in bacteria; mechanisms and molecular modulation.

El objetivo general del presente proyecto es contribuir a la caracterización genética y bioquímica molecular de mecanismos involucrados en el mantenimiento de la información génica, a través del estudio de sistemas fisiológicos involucrados en la prevención, reparación y tolerancia de mutaciones. Dichos sistemas se encuentran evolutivamente conservados y ampliamente distribuidos en los seres vivos. La importancia de los mismos se refleja en el hecho que su deficiencia genera en humanos, enfermedades genéticas, apoptosis y cáncer; y en especies procariotas, células denominadas "hipermutadoras". En los últimos años el estudio de la hipermutabilidad en bacterias ha cobrado gran interés ya que se le atribuye importancia en procesos infectivos y en aspectos básicos relacionados a evolución. Nuestro modelo de estudio son las bacterias Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli, siendo esta última especie no solo modelo de estudio sino también especie de referencia. P. aeruginosa es una bacteria ambiental gram negativa, e importante patógeno oportunista de humanos. Específicamente nos proponemos estudiar en P. aeruginosa algunos aspectos particulares del Sistema de Reparación de Bases Apareadas Incorrectamente (Mismatch Repair System, MRS), del Sistema de Prevención/Reparación de Lesiones Oxidativas generadas a través de 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxo-dG ó GO) y el papel de las ADN Polimerasas de baja fidelidad en la modulación de la tasa de mutación. Asimismo estamos interesados en estudiar en cepas de E. coli deficientes en el sistema Dam, la existencia de subpoblaciones de alta estabilidad genética debido a la eliminación de posibles mutantes por incremento de la expresión de los otros componentes del MRS. Metodológicamente la caracterización bioquímica de factores proteicos se llevará a cabo utilizando proteínas recombinantes purificadas, análisis de interacción proteína-proteína y proteína-ADN mediante electroforesis en geles y resonancia plasmónica de superficie (Biacore), mutagenésis dirigida in vitro, y estudios de complementación en cepas mutantes específicas. Aspectos fenotípicos y de regulación génica en cultivos de biofilm y células en suspensión serán estudiados mediante la construcción de cepas mutantes, fusiones transcripcionales, PCR en tiempo real, western blot y microscopia de fluorescencia confocal.

Acciones tróficas de GABA: implicancias en la diferenciación sexual del cerebro. Trophic actions of GABA: Implications for sexual differentiation of the brain.

En el hipotálamo en desarrollo, el ácido gamma-amino butírico (GABA) produce depolarización neuronal, pudiendo incluso disparar potenciales de acción y causar la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje. Esto se debe a que la concentración intracelular de Cl- es alta respecto al medio extracelular, por lo que en reposo el potencial de equilibrio de GABA es más positivo que el potencial de membrana. A medida que el desarrollo transcurre, la concentración intracelular de Cl- disminuye y se produce un cambio en la respuesta de depolarizante (etapa excitatoria) a hiperpolarizante (etapa inhibitoria). Se ha demostrado que este cambio ocurre también en neuronas hipotalámicas in vitro. El dimorfismo sexual del cerebro de los vertebrados es consecuencia de la acción del estrógeno aromatizado a partir de andrógenos segregados por el testículo durante el "periodo crítico" del desarrollo cerebral. Evidencias previas de nuestro y otros laboratorios pusieron de manifiesto diferencias en el crecimiento y diferenciación de neuronas que no podían atribuirse a la acción hormonal, ya que ocurren antes que se inicie el brusco aumento de la secreción gonadal, alrededor del día 18 de desarrollo embrionario en la rata (E18). Además de las diferencias morfológicas, encontramos diferencias sexuales en la forma que las neuronas hipotalámicas responden a muscimol, un agonista específico del receptor GABAA. A los 9 días in vitro (9 DIV) la respuesta a muscimol fue hiperpolarizante (etapa inhibitoria) y además fue de mayor amplitud, área y duración en machos respecto a hembras. Esto nos indica que las neuronas provenientes de embriones machos son intrínsecamente diferentes a las de embriones hembra aún antes de la acción organizadora de los esteroides sexuales. En base a estas evidencias nos propusimos continuar nuestros estudios sobre la participación de GABA en la determinación de diferencias sexuales en el cerebro antes de la acción organizadora de los esteroides gonadales. Para ello, en cultivos de neuronas hipotalámicas de E16 separados por sexos, estudiaremos:- la respuesta a muscimol de las neuronas, en la etapa excitatoria (2 DIV) de la acción de GABA.- las composición de subunidades de los receptores GABAA en la etapa excitatoria/inhibitoria de la acción de GABA.- la participación de los receptores GABAA sobre el crecimiento neurítico.- la activación de la vía de las MAP quinasas por muscimol.- la participación de los receptores GABAA sobre el crecimiento axonal inducido por estradiol in vitro.Toda la metodología propuesta es de uso habitual en nuestro laboratorio e involucra herramientas de la electrofisiología y la biología celular-molecular; como patch-clamp, cultivo de neuronas hipotalámicas, Western blot, RT-PCR, entre otras. Esperamos encontrar diferencias sexuales en la amplitud, área y duración de la respuesta de las neuronas hipotalámicas al muscimol a los 2 DIV, y que éstas se deban a una diferente composición de subunidades del receptor GABAA. En cuanto a la participación del receptor GABAA en la neuritogenesis, esperamos encontrar mayor longitud neurítica en neuronas macho como así también una activación sexualmente dimórfica de la vía de las MAP quinasas. Además esperamosque la acción de un antagonista del receptor GABAA interfiera con la axogénesis inducida por estradiol in vitro, característica que muestra diferencia sexual también a favor de los machos, lo que reforzaría nuestra hipótesis. La importancia y originalidad de este proyecto reside en la evaluación de la participación del sistema GABAérgico en la determinación de características que durante el desarrollo, podrían estar involucradas en la determinación de diferencias sexuales permanentes en el cerebro adulto independientemente de la acción de los esteroides sexuales. Hasta la fecha, no ha sido evaluada la influencia de los receptores GABAA en la diferenciación sexual del cerebro antes de la acción organizadora de los esteroides gonadales.

Desarrollo de fotosensibilizadores con aplicaciones en la inactivación fotodinámica de microorganismos. Development of photosensitizer with applications in the photodynamic inactivation of microorganisms.

El plan propone desarrollar nuevas agentes fotosensibilizadores derivados de macrociclos pirrólicos con aplicaciones en la inactivación fotodinámica (PDI) de microorganismos. La propuesta abarca el desarrollo de procedimientos apropiados para la síntesis de compuestos derivados de porfirinas, subftalocianinas y ftalocianinas sustituidas en la periferia por grupos que permitan aumentar la actividad biológica. Con la finalidad de incrementar la incorporación intracelular y la actividad fotodinámica se evaluarán sensibilizadores con distinta distribución y número de cargas, en los cuales se ha incrementado el carácter anfifílico por la presencia de grupos lipofílicos y catiónicos. La combinación de un fotosensibilizador con un compuesto antifúngico está diseñada para aumentar la eficiencia en la inactivación de hongos. También serán evaluadas superficies antimicrobianas recubiertas con una película de fotosensibilizadores. En primera instancia, la actividad fotodinámica de los nuevos agentes fototerapéuticos serán evaluados en sistemas biomiméticos conteniendo sustratos biológicamente activos. Los estudios in vitro serán realizados en cultivos de bacterias y levaduras. Esta aplicación presenta considerable importancia en la inactivación de microorganismos patógenos que crecen in vivo en un foco localizado de infección, en la desinfección de fluidos biológicos y aguas contaminadas con microbios resistentes.

Estrategias estadístico-computacionales avanzadas para análisis de expresión de proteínas/genes en cáncer. Advanced statistical and computational strategies for protein/gene expression analysis in cancer.

El objetivo de este proyecto, enmarcado en el área de metodología de análisis en bioingeniería-biotecnología aplicadas al estudio del cancer, es el análisis y caracterización a través modelos estadísticos con efectos mixtos y técnicas de aprendizaje automático, de perfiles de expresión de proteínas y genes de las vías metabolicas asociadas a progresión tumoral. Dicho estudio se llevará a cabo mediante la utilización de tecnologías de alto rendimiento. Las mismas permiten evaluar miles de genes/proteínas en forma simultánea, generando así una gran cantidad de datos de expresión. Se hipotetiza que para un análisis e interpretación de la información subyacente, caracterizada por su abundancia y complejidad, podría realizarse mediante técnicas estadístico-computacionales eficientes en el contexto de modelos mixtos y técnias de aprendizaje automático. Para que el análisis sea efectivo es necesario contemplar los efectos ocasionados por los diferentes factores experimentales ajenos al fenómeno biológico bajo estudio. Estos efectos pueden enmascarar la información subycente y así perder informacion relavante en el contexto de progresión tumoral. La identificación de estos efectos permitirá obtener, eficientemente, los perfiles de expresión molecular que podrían permitir el desarrollo de métodos de diagnóstico basados en ellos. Con este trabajo se espera poner a disposición de investigadores de nuestro medio, herramientas y procedimientos de análisis que maximicen la eficiencia en el uso de los recursos asignados a la masiva captura de datos genómicos/proteómicos que permitan extraer información biológica relevante pertinente al análisis, clasificación o predicción de cáncer, el diseño de tratamientos y terapias específicos y el mejoramiento de los métodos de detección como así tambien aportar al entendimieto de la progresión tumoral mediante análisis computacional intensivo.

Agentes deletéreos para Trypanosoma cruzi: Patogenia de la infección de placenta humana en la enfermedad congénita de Chagas, in vitro. Deleterious agents to Trypanosoma cruzi: Pathogenia of the human placenta infection in the congenital Chagas disease.

Trypanosoma cruzi, agente causal del Chagas, atraviesa la barrera placentaria y produce la enfermedad congénita. Objetivo general: Analizar si el T. cruzi, agente causal del Chagas, produce alteraciones trofoblásticas de las vellosidades coriónicas mediadas por óxido nítrico (principal agente deletéreo contra T. cruzi) y estrés oxidativo con variaciones que pudieran depender de la disponibiidad de L-arginine, sobre placentas en modelos in vitro de co-cultivos de explantos de vellosidades coriónicas, de sinciciotrofoblasto aislado y de células derivadas del trofoblasto de placentas humanas en interacción con distintas cepas del Trypanosoma cruzi, que pudieran dar alguna luz en la explicación de mecanismos involucrados en la infección placentaria y en algunos síndromes clínicos de la transmisión congénita del Chagas. Objetivos Específicos: a) Describir alteraciones estructurales y presencia de T. cruzi en vellosidades coriónicas de placentas humanas procedentes de co-cultivos con Trypanosoma cruzi in vitro (y sus respectivos controles), mediante técnicas histológicas y PCR analizando secuencias de ADN específicas del parásito.b) Establecer la localización y expresión proteica y la expresión transcripcional de las isoformas II y III de la Öxido Nítrico Sintasa sobre la misma población muestral de (a) mediante técnicas inmunohistoquímica, RT-PCR y semicuantificación con software adecuado. c) Analizar la susceptibilidad a la infección por el T. cruzi del citotrofoblasto (CTB) y sinciciotrofoblasto (STB) placentario aislado in vitro. d) Determinar concentraciones de óxido nítrico y estrés oxidativo del sinciciotrofoblasto (STB) aislado ante la infección por T. cruzi. e) Relacionar concentraciones de L-arginina con infección del trofoblasto aislado. f) Relacionar inhibiciones de la eNOS y de la arginasa con infección trofoblástica y óxido nítrico producido.Se emplearán métodos y técnicas de Biología celular y molecular, mediciones hormonales, enzimáticas, proteicas, parasitarias y bioquímicas en medios sobrenadantes de cultivo, de inmuno-detección de epitopes proteicos en tejidos, expresión de ARN por RT-PCR, Western blot, detección de DNA en tejidos por PCR, Cuantificaciones morfométricas. En general, el presente proyecto podría redundar en beneficios para un sector de la población de las áreas endémicas para esta enfermedad de bajos recursos económicos, sociales y culturales, mediante la obtención de datos que pudieran explicar algunos mecanismos de síndromes clínicos descriptos en esta patología y que pudieran participar en la transmisión congénita de la enfermedad de Chagas.

Regulación de la función de macrófagos por Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii y su participación en la generación de la inmunidad adaptativa antifúngica. Regulation of macrophage function by Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii and their role in the antifungal adaptative immunity.

La criptococosis es causada por la inhalación de levaduras encapsuladas de Cryptococcus neoformans o Cryptococcus gattii. Representa una de las tres infecciones graves por oportunistas en pacientes con SIDA y existe aproximadamente un 6 por ciento de incidencia de criptococosis clínica en pacientes con transplante de órganos sólidos. Estas dos especies difieren la fisiopatogenia durante la infección. El factor de virulencia principal de Cryptococcus sp. es la presencia del polisacárido capsular, glucuronoxilomanano (GXM), de alto peso molecular, que es continuamente secretado por las levaduras. Los macrófagos son células centrales en la respuesta innata al hongo, los cuales deben ser activados por linfocitos T helper 1 para un eficiente control de la infección. Sin embargo, estas células también son suceptibles al parasitismo intracelular, permitiendo la infección persistente y la diseminación a sitios extrapulmonares. Este proyecto propone investigar la capacidad de levaduras de C. neoformans, C. gattii y de los polisacáridos capsulares para modular la respuesta proinflamatoria de los macrófagos. Queremos estudiar si el tratamiento de macrófagos con levaduras o polisacárido puede inducir perfiles supresores de la respuesta protectiva T helper 1, tales como linfocitos T helper 2 o T reguladores, favoreciendo la sobrevida intracelular del hongo. Además, pensamos que C. neoformans o C. gattii podrían inducir un activación diferencial de macrófagos lo que condicionaría la respuesta adaptativa, lo que podría explicar las diferencias en la fisiopatogenia de estas dos especies. Procedimientos experimentales -Microorganismos y obtención de GXM: se trabajará con C. neoformans variedad grubii, cepa ATCC 62067 y C. gattii serotipo B, cepa NIH112B. Se obtendrán polisacáridos capsulares (GXM) de C. neoformans y C. gattii por precipitación con etanol y y acomplejamiento selectivo con CTAB. - Obtención de macrófagos murinos y cultivos celulares: se obtendrán macrófagos por lavados peritoneales y/o alveolares de ratones BALB/c. Los macrófagos se cultivarán por 24 h en ausencia o presencia de levaduras muertas o vivas (sin opsonizar u opsonizadas) de C. neoformans o C. gattii o en presencia de GXM purificado. -Objetivo 1. Estudio de la modulación de las propiedades proinflamatorias de Mac: en sobrenadantes de los cultivos se medirán las citoquinas por ELISA de captura y en lisados celulares, la expresión de las enzimas (iNOS, arginasa, IDO) por western blot. Se analizará por citometría de flujo la expresión de MCHII y moléculas CD80, CD86, CD40, CTLA-4. -Objetivo 2. Estudios in vitro de la capacidad de macrófagos tratados con levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg: los macrófagos preincubados con GXM o levaduras, se incubarán con linfocitos autólogos estimulados con anti-CD3. Se medirá la proliferación celular y el perfil de citoquinas por citomtría de flujo. Células T CD4+ CD25- serán purificadas de suspenciones esplénicas de ratones normales. Luego las células serán incubadas con macrófagos (sin tratar o tratados con levaduras o GXM) y estimulados con anti-CD3. Se analizará la proliferación celular con CFSE y expresión de CD4, CD25 y Foxp3 . - Objetivo 3. Estudios in vivo de la capacidad de levaduras o GXM para inducir linfocitos Th1, Th2 o Treg . Rol de los macrófagos in vivo: Los ratones serán inyectados con 100000 levaduras o con 200 µg de GXM puro vía endovenosa y luego de 7, 14, 30 y 40 días se evaluarán las poblaciones celulares de bazo, por citometría de flujo usando marcaciones simultáneas para CD4, CD8, CD25, Foxp3 y citoquinas intracelulares. Para investigar la participación in vivo de los macrófagos, se depletaran estas células inyectando los animales con PBS-liposomas o clodronato (DMDP)-liposomas por vía endovenosa o inhalatoria (200- 300 µl por ratón). Luego de 24 h, los animales se infectarán con levaduras o inocularán con GXM y se evaluarán los perfiles de células T esplénicos o de nódulos linfaticos.