Diseño y caracterización de plataformas de biorreconocimiento basadas en el uso de nanoestructuras, biomoléculas y polímeros. Aplicaciones para el desarrollo de (bio)sensores electroquímicos. Design and characterization of biorecognition platforms based on the use of nanostructures, biomolecules and polymers. Applications for the development of electrochemical (bio)sensors.

Los requerimientos de métodos analíticos que permitan realizar determinaciones más eficientes en diversas ramas de la Química, así como el gran desarrollo logrado por la Nanobiotecnología, impulsaron la investigación de nuevas alternativas de análisis. Hoy, el campo de los Biosensores concita gran atención en el primer mundo, sin embargo, en nuestro país es todavía un área de vacancia, como lo es también la de la Nanotecnología. El objetivo de este proyecto es diseñar y caracterizar nuevos electrodos especialmente basados en el uso de nanoestructuras y estudiar aspectos básicos de la inmovilización de enzimas, ADN, aptámeros, polisacáridos y otros polímeros sobre dichos electrodos a fin de crear nuevas plataformas de biorreconocimiento para la construcción de (bio)sensores electroquímicos dirigidos a la cuantificación de analitos de interés clínico, farmaco-toxicológico y ambiental.Se estudiarán las propiedades de electrodos de C vítreo, Au, "screen printed" y compósitos de C modificados con nanotubos de C (CNT) y/o nanopartículas (NP) de oro y/o nanoalambres empleando diversas estrategias. Se investigarán nuevas alternativas de inmovilización de las biomoléculas antes mencionadas sobre dichos electrodos, se caracterizarán las plataformas resultantes y se evaluarán sus posibles aplicaciones analíticas al desarrollo de biosensores con enzimas y ADNs como elementos de biorreconocimiento. Se funcionalizarán CNT con polímeros comerciales y sintetizados en nuestro laboratorio modificados con moléculas bioactivas. Se diseñarán y caracterizarán nuevas arquitecturas supramoleculares basadas en el autoensamblado de policationes, enzimas y ADNs sobre Au. Se evaluarán las propiedades catalíticas de NP de magnetita y de perovskitas de Mn y su aplicación al desarrollo de biosensores enzimáticos. Se diseñarán biosensores que permitan la detección altamente sensible y selectiva de secuencias específicas de ADNs de interés clínico. Se estudiará la interacción de genotóxicos con ADN (en solución e inmovilizado) y se desarrollarán biosensores que permitan su cuantificación. Se construirán biosensores enzimáticos para la cuantificación de bioanalitos, especialmente glucosa, fenoles y catecoles, y sensores electroquímicos para la determinación de neurotransmisores, ácido úrico y ácido ascórbico. Se diseñarán nuevos aptasensores electroquímicos para la cuantificación de biomarcadores, comenzando por lisozima y trombina y continuando con otros de interés regional/nacional.Se emplearán las siguientes técnicas: voltamperometrías cíclica (CV), de pulso diferencial (DPV) y de onda cuadrada (SWV); "stripping" potenciométrico a corriente constante (PSA); elipsometría; microbalanza de cristal de cuarzo con cálculo de pérdida de energía por disipación (QCM-D); resonancia de plasmón superficial con detección dual (E-SPR); espectroscopía de impedancia electroquímica (EIE); microscopías de barrido electroquímico (SECM), de barrido electrónico (SEM), de transmisión (TEM) y de fuerzas atómicas (AFM); espectrofotometría UV-visible; espectroscopías IR, Raman, de masas, RMN.Se espera que la inclusión de los CNT y/o de las NP metálicas y/o de los nanoalambres en los diferentes electrodos permita una mejor transferencia de carga de diversos analitos y por ende una detección más sensible y selectiva de bioanalitos empleando enzimas, ADN y aptámeros como elementos de biorreconocimiento. Se espera una mayor eficiencia en los aptasensores respecto de los inmunosensores, lo que permitirá la determinacion selectiva de diversos biomarcadores. La modificación de electrodos con nanoestructuras posibilitará la detección altamente sensible y selectiva del evento de hibridación. La respuesta obtenida luego de la interacción de genotóxicos con ADN permitirá un mejor conocimiento de la asociación establecida, de la cinética y de las constantes termodinámicas. Los neurotransmisores podrán ser determinados a niveles nanomolares aún en muestras complejas.

Desarrollo de Sistemas Innovadores de Transporte y Liberación Destinados a la Optimización de la Actividad Terapéutica de Fármacos

Existen numerosos fármacos con atributos terapéuticos relevantes que presentan propiedades físicoquímicas o biológicas desfavorables, las que comprometen su eficacia o seguridad y en consecuencia requieren nuevas estrategias de formulación para superar tales deficiencias. Debido a lo expuesto, el objetivo general de este proyecto es diseñar, desarrollar y evaluar nuevos sistemas de transporte y liberación de fármacos que presentan baja biodisponibilidad cuando son administrados por vía oral, 4 debido a su escasa solubilidad y/o permeación a través del epitelio gastrointestinal. Como objetivos específicos se proponen: - Obtención de nuevos sistemas portadores que incidan sobre la efectividad del proceso de absorción de fármacos modelos, facilitando su disolución y/o permeación en el tracto gastrointesinal. - Evaluación de la eficacia de los sistemas obtenidos, en el transporte y pasaje de los fármacos a través de las mucosas del tracto gastrointestinal, mediante metodologías in situ e in vitro, que contribuyan a la determinación de los parámetros biofarmacéuticos de relevancia. La metodología de trabajo propuesta contempla la formación de complejos ternarios utilizando ciclodextrinas (ß-ciclodextrina, hidroxipropil-ß-ciclodextrina y metil- ß-ciclodextrina) y etanolaminas, aminoácidos o meglumina; la incorporación en microemulsiones de los complejos con ciclodextrina obtenidos; así como la obtención de pellets por extrusión-esferonización. Para los estudios biofarmacéuticos, de los principios activos en los sistemas de transporte y liberación desarrollados, se diseñarán estudios de permeación, in situ, a través del método de perfusión de paso simple en ratas e in vitro, utilizando membranas artificiales y cultivos de células Caco-2. Se desarrollarán y validarán procedimientos analíticos adecuado para las determinaciones de los fármacos en todos los estudios implementados.

Angiogénesis y vascularización en el microambiente uterino placentario en porcinos

La placenta es un órgano transitorio formado durante la gestación, a través del cual se relacionan fisiológicamente membranas maternas y embrionarias. Constituye un tejido esencial ya que de la correcta comunicación materna/fetal depende la aceptación del conceptus, la viabilidad de los embriones, el éxito de la preñez y la sobrevida postnatal de los fetos. El cerdo presenta una placenta corialantoidea que se caracteriza por una aposición entre los epitelios uterino y coriónico, entre los cuales se interdigitan las microvellosidades maternas y fetales, involucrando un vasto incremento en el área de contacto sin pérdida de la continuidad de las membranas. Éstas persisten hasta el final de la gestación, pero la distancia entre los vasos sanguíneos uterinos y fetales se reduce a medida que avanza la preñez a fin de hacer más eficiente la difusión. En el cerdo, para que se produzca una preñez exitosa seguida de una gestación normal debe ocurrir, a nivel de la placenta una correcta vascularización que permita un adecuado establecimiento y desarrollo de los embriones/fetos. La angiogénesis placentaria es un factor primordial durante la gestación, ya que es necesario un incremento en el flujo sanguíneo a medida que avanza la preñez, aumentando el transporte de nutrientes desde la madre para satisfacer las demandas metabólicas del conceptus. Al inicio de la preñez porcina se observa una vascularización endometrial involucrada en el establecimiento y crecimiento placentario. Fisiológicamente, para que se produzca una preñéz exitosa debe ocurrir una correcta remodelación celular placentaria y vascular, indispensable para el crecimiento fetal y el desarrollo placentario; para ello se expresan diferentes moleculas presentes en el microambiente materno/fetal, tales como VEGF y sus receptores, y las proteínas de matriz extracelular: osteopontina, fibrinógeno, colágeno, desmina, vimentina y fibronectina. El propósito de este trabajo es estudiar la angiogénesis, la vascularización y la caracterización de la matriz extracelular, en muestras de tejido placentario de cerdas de razas mestizas. Para ello se propone determinar el número de vasos sanguíneos placentarios, su clasificación de acuerdo al calibre y ubicación y la localización de VEGF, sus receptores, osteopontina, fibrinógeno, colágeno, desmina, vimentina y fibronectina. Además, se determinará la remodelación celular vascular a través de microscopía óptica de alta resolución (MOAR) y microscopía electrónica de transmisión. Todas las determinaciones se realizarán durante la placentación porcina: al inicio (30 días), la mitad (60 y 80 días) y al final de la gestación (114 días). Poder reconocer algunos de los procesos fisiológicos que desencadenan la remodelación celular y la vascularización durante el establecimiento y crecimiento placentario porcino, permitirá profundizar el conocimiento de los mecanismos que posibilitan un apropiado intercambio sanguíneo materno-fetal durante la gestación en porcinos. La identificación y el estudio de las moléculas que intervienen en la integridad y sostén tisular-vascular que sirven de contexto en los procesos de angiogénesis y vascularización redundará en el futuro en beneficios aplicables a la producción porcina.

Evaluación de la interacción virus-hospedante-vector- endosimbiontes y su influencia en la transmisión del Mal de Río Cuarto en infecciones simples y mixtas con el Cereal Rhabdovirus.

El “Mal de Río Cuarto” es la enfermedad más importante del maíz en la Argentina. El agente causal es un fijivirus denominado Mal de Río Cuarto virus (MRCV). Se transmite únicamente a través de delfácidos (Hemiptera-Delphacidae) de forma persistente propagativa. Se han descripto diversas especies con demostrada capacidad vectora, entre ellos Delphacodes kuscheli Fennah y Toya propinqua Fieber. La primera es de gran importancia tanto por su abundancia en las zonas maiceras de nuestro país como por su eficiencia de transmisión mientras que T. propinqua es una especie cosmopolita que se encuentra ampliamente distribuida en toda el área productiva. Ambas especies poseen una demostrada capacidad de transmisión a cereales de grano fino, importantes epidemiológicamente por su rol como reservorios del virus y el vector en época invernal. Un aspecto que requiere especial atención es la aparición de una nueva virosis, un Cytorhabdovirus, en infecciones mixtas con MRCV en cereales de invierno en el sur de la provincia de Córdoba (región endémica del Mal de Río Cuarto). Al igual que este último el rhabdovirus se transmite por insectos delfácidos, por lo que sería relevante estudiar las posibles interacciones entre la coinfección por ambos patógenos y sus consecuencias en la transmisión del MRCV. La capacidad vectora puede estar afectada por diversos aspectos biológicos, entre los que se pueden mencionar el estadío del insecto al momento de la adquisición del virus, los niveles de concentración viral alcanzados en el organismo del vector, la existencia de barreras morfofisiológicas (como las membranas basales del intestino medio y glándulas salivales, y mecanismos de inmunidad innata) y la presencia de endosimbiontes. Se conoce que existen diferencias en la transmisión según el MRCV se adquiera como ninfa de primer o tercer estadío, por lo que se propone realizar estudios comparativos entre ambos grupos. Se plantea además evaluar el efecto de diferencias de concentración del MRCV en el organismo del insecto en la transmisión mediante RT-qPCR, en infecciones simples y mixtas. Se analizará la posible existencia de barreras morfofisiológicas observando el tropismo de las partículas virales en los tejidos del vector a través de inmunomicroscopía confocal y la activación diferencial de genes de inmunidad innata con RT-qPCR. Dado que existen antecedentes de la presencia de endosimbiontes, como Wolbachia pipientis en este grupo de insectos, se propone además estudiar la prevalencia de esta bacteria y analizar las cepas existentes en poblaciones de delfácidos del área maicera. Este objetivo es importante por dos razones. En primer lugar, W pipientis es ampliamente estudiada como potencial biocontrolador de vectores debido al fenómeno de incompatibilidad citoplasmática que expresa en sus hospedantes. En segundo lugar, esta bacteria influye en la eficiencia de transmisión de enfermedades ya que se conoce que los endosimbiontes producen proteínas denominadas simbioninas que protegen las partículas virales de la degradación enzimática durante su circulación por la hemolinfa. De este modo, la presencia de Wolbachia podría condicionar la replicación, estabilidad y persistencia de las partículas virales en insectos vectores, fenómenos comprobados para otros patosistemas. Este proyecto tiene como objetivo final profundizar los conocimientos acerca del fenómeno de la transmisión viral y establecer bases para el manejo integrado del vector y la enfermedad.

Estados de cuasi-equilibrio dipolar en fluidos complejos estudiados por relajación y decoherencia en Resonancia Magnética Nuclear

La dinámica molecular colectiva de los cristales líquidos (CL) juega un papel preponderante en la respuesta de estos sistemas ante la aplicación de campos eléctricos y magnéticos externos, por lo que el estudio básico de la dinámica molecular, particularmente de los movimientos correlacionados, es indispensable para el diseño de aplicaciones tecnológicas basadas en CL. Por otra parte, se reconoce que la dinámica molecular colectiva distintiva de las fases ordenadas de fluidos complejos es además una propiedad que controla procesos clave en diversidad de materiales biológicos (funcionalidad y propiedades viscoelásticas de membranas, resistencia al almacenamiento de semillas y alimentos, temperatura de transición vítrea de compuestos de almidón, estabilidad de fases lamelares, etc.). Al presente, la relación entre estos conceptos reclama exhaustivos análisis y técnicas adecuadas para estudiar los movimientos microscópicos en distintas escalas temporales. En este Proyecto de investigación básica proponemos desarrollar y optimizar un conjunto de técnicas de RMN selectivamente aptas para el estudio de la dinámica lenta característica de las fases parcialmente ordenadas, por lo que tendrían aplicación directa en sistemas de interés biológico y tecnológico. Mediante diversas secuencias de pulsos en experimentos de RMN, es posible preparar estados cuánticos de “orden dipolar” en el sistema de espines nucleares, tanto en muestras en fase sólida como en CL. Tales estados de orden, están caracterizados por "cuasi-invariantes" que son observables de espin que relajan lentamente, intercambiando energía con la red que hace las veces de reservorio térmico. En síntesis, una vez creado el orden y establecido el estado de cuasi-equilibrio de cada cuasi-invariante, el sistema se comporta como un sistema termodinámico en contacto térmico con una red. De hecho, con todo rigor, se puede caracterizar el grado de orden por una "temperatura de espin". Además hay evidencia que los cuasi-invariantes dipolares reflejan sensible y selectivamente los movimientos moleculares correlacionados (a diferencia del cuasiinvariante Zeeman o magnetización nuclear). El aspecto distintivo de nuestra propuesta con respecto al estado actual del conocimiento, radica en la provisión de un nuevo parámetro de relajación de protones en cristales líquidos, para lo cual enfocamos las tareas hacia la caracterización de estos cuasiinvariantes, al diseño de técnicas de medición de sus tiempos de relajación y al desarrollo de la teoría que relaciona a éstos con la dinámica molecular. El esquema de trabajo se basa en reconocer que los eventos relevantes en los experimentos de creación-relajación de cuasi-invariantes dipolares ocurren en dos escalas de tiempo: la escala microscópica asociada con la decoherencia de los estados cuánticos y la escala macroscópica en la que se observa la relajación espín-reservorio. Proponemos como hipótesis general que los procesos que gobiernan la decoherencia, determinan también la relajación espin-red. Proponemos un enfoque innovador dentro del campo general de relajación de espin nuclear por RMN: considerar al sistema de espines nucleares como un sistema cuántico abierto multi-spin interactuando con un sistema (también cuántico) no observado. Para incorporar el detalle de la dinámica en escala microscópica en la descripción de la relajación es necesario el estudio experimental de los fenómenos que gobiernan la decoherencia y la relajación. Los resultados esperados en cada uno de esos grupos se interrelacionan, ya que la caracterización de los observables dipolares es un paso indispensable para explotar la potencialidad de la relajación del orden dipolar en presencia de movimientos moleculares correlacionados.

Resonancia Magnética Nuclear aplicada al estudio de nuevos sistemas farmacéuticos y biológicos, complejos poliméricos y conjuntos de espines modelo. Nuclear Magnetic Resonance applied to the study of new pharmaceutical and biological systems, polymeric complexes and model spin clusters.

El presente proyecto plantea utilizar integralmente la técnica de Resonancia Magnética Nuclear en sólidos como un medio experimental que permite entender fenómenos de la física fundamental, como así también realizar aplicaciones de interés en el campo de la química, los desarrollos farmacéuticos y la biología. Novedosas técnicas experimentales serán empleadas, en conjunción con otras más tradicionales, en la caracterización de nuevas estructuras poliméricas acomplejadas a metales, membranas biológicas y compuestos de interés farmacéutico en vías de desarrollo, los cuales presentan el fenómeno de polimorfismo . Esto se llevará a cabo complementando los resultados de RMN en sólidos con técnicas tanto espectroscópicas como analíticas (Infrarrojo, Difracción de Rayos X, Calorimetría, RMN en solución) y trabajo interdisciplinario. Paralelamente al desarrollo de estos temas, profundizaremos mediante investigación básica, en la compresión de la dinámica cuántica y el surgimiento de la irreversibilidad en sistemas de espines nucleares. Observaremos en particular la generación, evolución y control de las coherencias cuánticas múltiples en sistemas cuánticos abiertos, lo cual nos da información sobre tamaño de clusters de espines. Esto permitirá la correcta implementación de secuencias de pulsos sofisticadas, como así también desarrollar nuevos métodos de medición aplicados a la caracterización estructural y a la dinámica molecular de sólidos complejos. Debemos resaltar que este proyecto está conectado con aspectos tanto básicos como aplicados de la RMN en sólidos como técnica experimental, la cual se desarrolla en el país únicamente en FaMAF-UNC. Se nutre además de trabajo multidisciplinario promoviendo la colaboración con investigadores y becarios de distintas áreas (física, química, farmacia, biología) provenientes de distintos puntos del país. Finalmente podemos afirmar que este plan impulsa la aplicación de la física básica proyectada a diferentes áreas del conocimiento, en el ámbito de la provincia de Córdoba. The aim of the present proyect is to use Nuclear Magnetic Resonance (NMR) as a complete techique that allows the understanding of fundamental physics phenomena and, at the same time, it leads to important applications in the fields of chemistry, pharmaceutical developments and biology. New experiments will be used together with traditional ones, in the characterization of new metal-polymer complexes, biological membranes and pharmaceutical compounds, some of them presenting polymorfism. NMR experiments will be complemented with diverse spectroscopic and analytical techniques: Infrared, X ray Diffraction, Thermal Analysis, solution NMR, as well as multidisciplinary investigation. Additionally, the present proyect plans to study in depth several aspects of quantum dynamics phenomena and decoherence in nuclear spin systems. The present proyect is connected with basic and applied aspects of the solid state NMR technique, developed in our country, only at FaMAF-UNC. It is is composed by multidisciplinary work and it promotes the collaboration with researchers and students coming from different fields (physics, chemistry, pharmaceutical developments, biology) and different points of our country.

Participación del tráfico y la distribución de proteínas en la polaridad y el desarrollo de procesos neuronales. Protein sorting and trafficking participation in neuronal processes polarity and development.

El estudio del tráfico intracelular en neuronas ha despertado gran interés en los últimos años, debido a que un gran número de enfermedades neurodegenerativas y neuropsiquiátricas parecen tener origen en en el transporte defectuoso de proteínas en estos tipos celulares. Mediante el uso de técnicas de biología celular y molecular, fuimos capaces de describir una de las vías que regula la fisión de las vesículas que llevan su cargo desde la última cisterna del Aparato de Golgi hacia la superficie celular en células epiteliales no polarizadas. Uno de los componentes clave de esa vía resultó ser la Proteina Kinasa D1 (PKD1), cuya actividad en el Aparato de Golgi es esencial para un normal transporte intracelular. Sorprendentemente, observamos que la PKD1 en neuronas con polaridad establecida no regula la fisión en el Golgi, pero si estaría involucrada en la selectividad y distribución (sorting) de vesículas cuyo cargo debe ser específicamente dirigido a las membranas dendríticas. El bloqueo de la actividad de la PKD1 no solamente cambia el destino final de estos cargos, que son enviados de esta forma a la membrana terminal del axón, sino que también es capaz de inducir defectos en el desarrollo y crecimiento de los procesos dendríticos a largo plazo. En este proyecto estudiaremos de que manera influye la perturbación del sorting, en ausencia de PKD1 activa y de otros componentes que la regulan, en la distribución de receptores de factores neurotróficos y de neurotransmisores glutamatérgicos, y cómo estos cambios en su distribución afectan el número, tamaño, y funcionalidad de los procesos neuronales (axones y dendritas). Estos resultados contribuirán a adquirir mayores conocimientos de los mecanismos dependientes del transporte y sorting de proteínas de membrana que participan en la regulación del crecimiento neuronal, los cuales a su vez aportarán información valiosa en la comprensión de un gran número de enfermedades neurológicas. The study of intracellular trafficking in neurons has arisen a great deal of interest in the last years, since a great number of neurodegenerative and neuropsychiatric disorders seem to be originated in abnormal protein transport in these type of cells. Using cell and molecular biology methodologies, we have been capable of describe one of the pathways that regulate the fission of vesicles that carry their cargo from the last Golgi Apparatus cisternae to the cell surface in non-polarized epithelial cells. One of the key components in this pathway is the Protein Kinase D1 (PKD1), whose activity in the Golgi Apparatus is essential for a normal intracelular transport. Surprisingly, we have observed that PKD1 does not regulate fission in neurons with established polarity, but it would be involved in vesicles' sorting at Golgi, particularly of those that carry specific dendritic cargo. Blocking PKD1 activity changes the final destination of these cargoes, which is now sent to the axons' terminal membranes, and also produces late dendritic development and growing defects. In this project we will study how sorting perturbation in absence of PKD1 and its regulators activities influences selectivity and distribution of neurotrophic and neurotransmitter receptors, and how these sorting changes affect number, size and functionality of neuronal processes (axons and dendrites). These results will help to acquire greater knowledge about transport and sorting mechanisms of neuronal growth regulatory membrane proteins. In addition, these studies will contribute with new valuable information necessary to understand numerous neurological diseases.

Sistemas supramoleculares autoensamblados con proyección a la Química Sustentable y sus aplicaciones en síntesis y reacciones de transferencia de electrones.

Este proyecto combina una serie de líneas de trabajo que, en esencia, estudian interacciones moleculares débiles y propiedades fisicoquímicas de diversos solutos en distintos medios. En todos los casos se procura comprender los factores que determinan la interacción de un soluto con su medio ya sea homogéneo o heterogéneo y aplicar estos conocimientos a diversos procesos, fundamentalmente en medios supramoleculares auto-organizados. Los medios supramoleculares que se estudian son: micelas inversas con agua u otros solventes polares sustitutos confinados en su corazón polar y vesículas. En este proyecto se desarrollan métodos que optimizan la detección de diferentes tipos de interacciones no-covalentes con distintas moléculas pruebas en los diferentes medios y, a partir de esto obtener aplicaciones diversas. Se trata de comprender los factores que determinan la solubilización, ubicación y/o reactividad de las moléculas pruebas en diferentes sitios del medio supramolecular y de esta manera obtener información acerca de las diferentes interacciones específicas en cada sitio del sistema supramolecular, lo cual es fundamental para el reconocimiento molecular ("inteligencia"). En definitiva estos estudios están orientados a: i) entender la adaptabilidad de nuevos sistemas supramoleculares para utilizar los resultados en el diseño de métodos de síntesis, electrosíntesis y catálisis dentro de los principios de la química sostenible o química verde y en la prevención a problemas de impacto ambiental tal como la remediación de aguas contaminadas por hidrocarburos y la degradación de pesticidas utilizando estrategias no convencionales; ii) la comprensión de fenómenos de transferencia de carga en sistemas auto-organizados y membranas biológicas; iii) el desarrollo de nuevos métodos de detección electroquímicos para compuestos de interés biológico, en medicina, alimentos y farmacología. También, dentro de los objetivos hay una componente muy fuerte de formación de recursos humanos como se aprecia en el número de becarios ya incorporados y a incorporar. La integración de estos conocimientos multidisciplinarios crea un ámbito sumamente beneficioso para la formación de doctorandos tan necesarios para el país ya que tendrán la oportunidad de participar en temas de investigación variados, relacionados con disciplinas diferentes, lo que sin duda será un valor añadido en su formación.