Participación del sistema de defensa antioxidante en la tolerancia a estres hidríco en cultivares resistentes y susceptibles de trigo

El trigo es uno de los cultivos más importantes de nuestra provincia que se realizan bajo condiciones de secano y consecuentemente expuesto a sequías temporarias. La deficiencia de agua es la principal causa de caída de los rendimientos reales de nuestra agricultura extensiva, oscilando dichas reducciones en alrededor del 30%. El déficit hídrico genera endógenamente un fuerte incremento en el nivel de especies activas del oxígeno y de oxidaciones de los principales elementos celulares. Consecuentemente, se ha propuesto que la tolerancia frente a dichas condiciones adversas estaría asociada a la capacidad de las plantas, fundamentalmente a nivel foliar, de adecuar el funcionamiento de su sistema de defensa antioxidante de cultivares de trigo con diferentes susceptibilidades frente a condiciones de estrés hídrico, a fin de determinar si dicho sistema antioxidante confiere mayor resistencia a la sequía y, en tal caso, establecer cuáles de sus componentes desempeñan un rol clave. El trabajo abarca las siguientes etapas iniciales: a) estudiar el efecto del estrés oxidativo y las especies activas del oxígeno sobre la actividad, cantidad y estabilidad de SOD y GR en hojas de trigo, cloroplastos y proteína aislada; b) caracterizar los cambios en la actividad del sistema antioxidante, tanto enzimático como no enzimático y correlacionarlos con las variaciones en parámetros hídricos, en variedades de trigo de comportamiento contrastante a la sequía, sometidas a déficit hídrico durante períodos críticos del ciclo de cultivo y c) puesta a punto de las condiciones de regeneración y transformación de trigo con construcciones correspondientes a enzimas antioxidantes. Una vez establecida la relación entre el comportamiento del sistema antioxidante, estrés oxidativo y la tolerancia a estrés hídrico será posible contribuir a la selección y creación, por técnicas de mejoramiento e ingeniería genética, de genotipos de trigo de mejor comportamiento frente a situaciones de sequía.

Inactivación reversible de la NR: Aislamiento y caracterización de la proteína inactivante de hojas de avena

La fosforilación reversible de proteínas, catalizadas por protein-kinasas y protein fosfatasas es uno de los principales modos de regulación metabólica en plantas. Entre las enzimas cuya actividad es modulada por procesos de fosforilación reversible está la nitrato reductasa (NR) de plantas superiores. Estos procesos son los responsables de la inactivación reversible de la NR de hojas, observada in vivo, durante la transición luz-oscuridad, correspondiendo la forma fosforilada a la enzima inactiva y la defosforilada a la máxima actividad. Se ha demostrado que la inactivación por fosforilación de la NR sólo es detectada en presencia de cationes divalentes libres y de una proteína inactivante (FI), que ha sido aislada y caracterizada en dictiledóneas. Los datos disponibles permiten suponer que esta proteína existe también en monocotiledóneas, pero hasta el momento esto no ha sido comprobado. El objeto del trabajo es determinar si este FI es de ocurrencia generalizada, por lo que se tratará de aislarlo y caracterizarlo en hojas de avena, donde también fue demostrada la inactivación por fosforilación de la NR.

Estudio de las células dopaminérgicas de la amigdala extendida: Neurobiología, filogenia y ontogenia

En la rata preadolescente varios investigadores han notado la existencia de una población de neuronas catecolaminérgicas que no han sido observadas en el animal adulto o que existen al menos en muy reducido o escaso número. Esta macroestructura en el prosencéfalo, que se extiende continuamente desde la parte media del lóbulo Temporal al prosencefalo basal, ha sido denominada "Amígdala Extendida". Ella está caracterizada por una densa inervación catecolaminérgica en el adulto en diferentes especies incluyendo presumiblemente terminales dopaminérgicas pero también noradrenérgicas y adrenérgicas. Estas últimas terminales son una característica distintiva de la amígdala extendida con respecto a los Ganglios Basales, por ejemplo, quienes reciben bien definidas y fuertes aferencias Dopaminérgicas pero pocas, si es que reciben de algún modo, aferencias noradrenérgicas y/o adrenérgicas. En el período de este proyecto se proponen líneas experimentales para examinar los sistemas de neuronas catecolaminérgicas en varias especies animales en sus períodos preadolescentes y su comparación con los adultos en detalle y con respecto a sus aferencias, eferencias y la posible coexistencia con otros probables neurotransmisores y neuropéptidos. Otro objetivo de este proyecto será establecer si estos mismos sistemas de células catecolaminérgicas preadolescentes en la amígdala extendida existen en especies más primitivas que la rata albina, como el armadillo, con una particular biología, con roedores sociales más evolucionados como el conejo y con especies homínidas más evolucionadas como primates del nuevo mundo y en especímenes de cerebro humano post-autopsia, en desarrollo y adultos. Otro objetivo es tratar de establecer si estas células persisten en el adulto aunque sin expresar las enzimas sintéticas para las catecolaminas, en preferencia por la expresión de otros neurotransmisores. Como consecuencia se tratará de determinar si desafíos farmacológicos específicos y/o experimentos de deaferentación pueden conducir nuevamente a la expresión de las enzimas catecolaminérgicas en amígdala extendida del adulto en las especies animales mencionadas y una correlación entre estos hallazgos y comparación con cerebros post-autopsia de pacientes esquizofrénicos y cuando posible con patologías relacionadas a la alteración de los sistemas catecolaminérgicos como un acercamiento a la comprensión del desarrollo y vulnerabilidad de estos sistemas y de posibles planteos terapéuticos.

Caracterización del sistema de defensa antioxidante en líneas de maní tolerantes y susceptibles a la sequía

El cultivo de maní generó en 1996 un ingreso de divisas de 250 millones de dólares americanos, hecho que posiciona a este cultivo como el principal rubro generador de divisas de origen agropecuario en la provincia de Córdoba. El rendimiento promedio de los últimos 15 años muestra una tendencia creciente debido a la introducción del cultivar Florman INTA. Este cultivar, que ocupa actualmente más del 90 % del área sembrada, introdujo asociado al carácter rendimiento, susceptibilidad a la sequía por lo cual se producen importantes fluctuaciones en la producción y calidad del grano cosechado, en función de las precipitaciones del año. Esta situación plantea la necesidad de obtener un cultivar con mayor tolerancia a la sequía, manteniendo una calidad comercial adecuada a las necesidades del mercado. La tolerancia a la sequía está conformada por un conjunto de atributos fisiológicos entre los cuales se destaca la capacidad para mantener la funcionalidad del sistema fotosintético. En este sentido, el estudio del sistema antioxidante ha cobrado reciente interés ya que provoca el cierre de los estomas. Como consecuencia se producen especies activas del oxígeno que alteran los procesos metabólicos del cloroplasto y membranas celulares. Estos daños pueden ser minimizados si se consiguen variedades que posean un eficiente sistema de defensa antioxidante bajo condiciones de estrés. El sistema está compuesto por un conjunto de sustancias reducidas y enzimas capaces de metabolizar radicales libres. En maní, al presente, no se ha realizado una caracterización ontogenética del sistema ni se ha determinado su relación con la tolerancia a la sequía. Es Objetivo de este proyecto establecer la posible relación entre el funcionamiento del sistema antioxidante, el daño oxidativo provocado por la sequía y la tolerancia al estrés hídrico, en líneas de maní tolerantes y susceptibles a la sequía. Los cultivares utilizados son Florman INTA Manfredi 393 INTA, como susceptible y tolerante respectivamente. El conocimiento generado permitirá seleccionar componentes del sistema antioxidante de utilidad para el mejoramiento de las actuales variedades de maní, mediante procedimientos clásicos o a través de la manipulación de genes.

Modificaciones de fosfatasa alcalina placentaria en plasma y placenta de embarazadas chagásicas in vivo e in vitro

Se ha demostrado que enzimas de placentas humanas asociadas a membranas y a lisosomas experimentan modificaciones por acción del Trypanosoma cruzi . La fosfatasa alcalina placentaria (FAP) es genéticamente muy polimórfica en la población humana y esto ha sido establecido por diversos autores. (...) Trabajos preliminares permiten postular que la actividad de la FAP disminuye en el plasma de pacientes chagásicos en el tercer mes de gestación y que esta disminución se asocia con el nacimiento de niños chagásicos. En placentas de madres chagásicas se demuestra mediante microscopía electrónica una disminución de la FAP en el sinciciotrofoblasto. También se detecta una disminución de la actividad de la enzima en infección placentaria con el Trypanosoma cruzi "in vitro". No existen estudios analíticos ni sistemáticos de la actividad de la fosfatasa alcalina placentaria plasmática, ni en placenta, en la enfermedad de Chagas y durante el transcurso del embarazo que permitan dilucidar el rol de la enzima en la interacción placenta-parásito-feto a través de las formas moleculares características y funciones que se le atribuyen a la enzima en condiciones normales. Objetivo general: Determinar si la enfermedad de Chagas-Mazza induce cambios significativos y específicos de la fosfatasa alcalina placentaria en plasma y placenta durante el transcurso del embarazo en relación con la infección de la placenta y el feto y caracterizar la fosfatasa alcalina placentaria de las placentas normales cultivadas e infectadas con T. cruzi y del medio de cultivo en la infección "in vitro" con el objeto de dilucidar los posibles mecanismos de la infección placentaria en la enfermedad de Chagas congénita.

Estudios sobre mecanismos de acción de hormonas tiroideas: Participación del receptor nuclear

Objetivo General: El objetivo general del plan de trabajo propuesto es aclarar algunos aspectos de los mecanismos que intervienen en la regulación de la acción de las hormonas tiroideas a nivel celular. Debido al papel determinante del receptor nuclear de T3 en la acción de la hormona, se pondrá especial énfasis en la correlación entre cambios a nivel del receptor y su repercusión en la expresión de efectos metabólicos tisulares específicos de la hormona. Se espera que los resultados a obtener aporten información sobre el efecto potencial que diversos factores puedan ejercer sobre el funcionalismo tiroideo. Objetivos Específicos: Tema 1: Estudiar el efecto de dos factores de crecimiento (GH e IGH-I) sobre la expresión de efectos metabólicos tisulares específicos de la hormona tiroidea (actividad de dos enzimas hepáticas dependientes de la T3: alfa-GPD y EM). En tales cirscunstancias, estudiar las posibles modificaciones operadas sobre el receptor nuclear de T3 mediante la evaluación de la expresión del gen (niveles de mRNA), capacidad máxima de unión de T3, afinidad, etc. El interés del estudio de los efectos de estos factores de crecimiento sobre el funcionalismo tiroideo, se debe a la reciente introducción de GH e IGF-I obtenidos por técnicas recombinantes, en el uso clínico para el tratamiento de alteraciones en el crecimiento y desarrollo en endocrinología pediátrica. Tema 2: Investigar la posible regulación por TSH de la expresión de los genes que codifican a los receptores de T3 y de la actividad funcional (capacidad máxima de unión de T3 y constante afinidad) de los mismos en el tejido tiroideo. Se estudiará además el efecto de T3 sobre la biosíntesis de hormonas tiroideas. El conocimiento de los mecanismos involucrados en la regulación de la expresión de los receptores a T3, así como los efectos de T3 sobre su propia biosíntesis permitirá interpretar los mecanismos involucrados en la autorregulación de la glándula tiroides, así como también esclarecer la fisiopatología de algunas de sus enfermedades.

Actividad secretante de condrocitos y sinoviocitos cultivados tratados con AINES e ILs

La inflamación osteoarticular es un desequilibrio entre formación y detrucción tisular. Es factor fundamental la acción condrolítica de metalo proteasas, cuya liberación es el final de una cascada en que los estímulos enzimo-secretorios de moléculas de adhesión, radicales libres de O2, y citokinas compiten con TIMPs y otros inhibidores tisulares. Tales mediadores son generados en la matriz extracelular, en células fias como endoteliocitos, condorcitos y sinoviocitos, o migrantes como PMN, macrófagos y linfocitos. Todas poseen receptores específicos que captan señales estimulantes (ICAM) o inhibidoras (TIMPs) y liberan mediadores que conducen el estímulo hacia el siguiente escalón celular de la cascada. La proteoglicanasa es una metalo proteasa que degrada ciertos componentes de la matriz extracelular. Como las enzimas colagenazas, estromelisina y gelatinazas, es secretada como proenzima y su función es remover el tejido conectivo durante el "turnover" normal y patológico. Los niveles de MMPs, ICAM y VCAM en cultivos de condorcitos, PMN y sinoviocitos provenientes de pacientes con artropatías con y sin estímulo fagocítico y/o la acción de AINEs, podría constituir un índice de la participación celular, reflejar la severidad de la afección y orientar sobre la eficiencia de los tratamientos antiinflamatorios. Objetivos Generales Determinar "in vitro" y "ex vivo" los roles de citokinas, matrixinas, inhibidores tisulares y adhesinas en atritis reumatoidea y osteoartritis como modelos inflamatorios humanos, identificando agentes que puedan inhibir terapéuticamente a las MMPs y citokinas y modular la degradación y reparación del tejido conectivo en esas patologías. Objetivos Específicos Cultivo de condrocitos de tejido articular humano para determinar "in vitro" y "ex vivo" los niveles de molécula de adhesión, inhibidores tisulares de citokinas (TIMPs) y MMPs, comparando con sus concentraciones en plasma y líquido sinovial, con y sin empleo de AINEs.

Vitamina D y homeostasis del calcio extra e intracelular

La vitamina D es uno de los principales reguladores de la homeostasis del calcio extracelular. El intestino es un importante "blanco" de acción de la vitamina desencadenándose allí un aumento de la absorción del catión que permite mantener la calcemia en los valores adecuados. El presente proyecto esta dirigido a conocer el papel del glutatión intestinal y de las oxidorreductasas del ciclo de Krebs durante ese proceso de incremento del transporte de calcio estimulado por la vitamina D. Para ello se estudiarán la absorción intestinal de Ca, la captación de Ca en vesículas de membrana basolateral del enterocito y actividades de enzimas relacionadas a la homeostasis del Ca (Ca-ATPasa, fostotasa alcalina) en animales raquíticos y tratados con vitamina D. Se usará DL-butionina-S, R-sulfoximina para disminuir el contenido intestinal de glutatión. Se emplearán metabolitos derivados de la vitamina D "in vivo" e "in vitro" e inhibidores de mecanismos de señales hormonales para dilucidar las vías usadas por la vitamina D para incrementar las actividades de la oxidoreductasas ligadas a NAD del ciclo de Krebs. La relación de la vitamina D con la homeostasis intracelular de CA se estudiará en el sistema visual del pollo desde retina (target de vitamina D) a corteza visual. Para ello se determinará la distribución de proteínas involucradas en el manejo del Ca intracelular (Ca-ATPasa de membrana plasmática, calbindina D28k y receptor de vitamina D o VDR) como los niveles de ARNm de las mismas en los diferentes niveles de organización del sistema visual.

Clonación de los promotores de los genes TPX1 y TPX2 de tomate y estudio de su actividad en plantas transgénicas

En tomate ( Lycopersicom esculentum ) se han realizado estudios de expresión de los 7 genes de peroxidasa mapeados, y se ha mostrado su asociación a diversas situaciones de estrés, pero no se ha establecido de forma clara el proceso metabólico en el que intervienen estas enzimas. Los genes TPX1 y TPX2 que se expresan constitutivamente en raíces de tomate codifican para proteínas con actividad peroxidasa y mostraron relación directa o indirecta, entre la expresión de estos genes y la respuesta de esta especie a diferentes tipos de estrés. El objetivo de este trabajo es presentar un camino alternativo a los métodos tradicionales para el clonaje de las regiones promotoras de los gnes TPX1 y TPX2 y la obtención de información sobre las regiones consenso de dicha zona del promotor, sobre todo aquellas que están relacionadas con la respuesta a hormonas vegetales. Esto último debido a la frecuente implicancia de las hormonas en la respuesta de las plantas a diferentes tipos de estrés o factores de transcripción. Objetivos generales: * Identificar las regiones 5´ adyacentes a las secuencias de cDNA conocidas de los genes TPX1 y TPX2. * Obtener información sobre los elementos de dicha secuencia que controlan la expresión de los genes. Objetivos específicos: * Aislamiento de los fragmentos de DNA: A) extracción de DNA genómico, B) digestión con enzimas de restricción, C) unión de adaptadores y D) amplificación por PCR del DNA. * Clonación en vector plasmídico de los productos de amplificación: A) purificación de los fragmentos amplificados y B) inserción de los fragmentos en el plásmido pCR-Script Amp SK(+).

Lípido quinasas de raíz de tomate (Lycopersicum esculentum L.) bajo condiciones de estrés salino

Los tejidos en general, presentan al menos dos clases de sistemas transductores de la información a través de una membrana. Uno de ellos esta relacionado al AMPc, mientras que el otro induce a un rápido recambio de los fosfolípidos del inositol, así como una movilización del ión Ca2+. (...) Se tratará de optimizar las condiciones para estudiar la actividad de lípido quinasas en raíces de tomate ( Lycopersicum esculentum L.) cvs Pera y otras, para dilucidar si las mismas están de algún modo comprometidas en las respuestas fisiológicas de ese vegetal al estrés salino. (...) La existencia de vías de señales interconectadas en plantas, podría ayudar a explicar la manera por la que un pequeño grupo de fitohormonas determinarían una amplia variedad de respuestas celulares. Ahí estas podrían desempeñar un papel importante como sustancia señal en la cadena de transducción entre el estrés salino y las respuestas moleculares induciendo expresión génica y/o la acumulación de proteínas específicas u otros compuestos relacionados. Objetivo general: * Estudiar la actividad de lípido quinasas de raíz de tomate para dilucidar si son enzimas claves en el camino de transducción de señales que involucra fosfoinosítidos en plantas bajo condiciones de estrés salino. Objetivos específicos: * Estudiar la capacidad de las quinasas lipídas y diacilglicerol quinasa de raíz de tomate para transferir el fosfato del ATP a de los sustratos lipídicos endógenos. * Analizar la actividad de estas enzimas en raíces de tomate sometidas a estrés salino durante diferentes períodos de tiempo. * Iniciar la caracterización de la actividades de PI-k , y DG-k y estudias su posible relación con la respuesta celular a un estímulo externo, tanto en raíces controles como en raíces sometidas a estrés salino.

Nucleótidos ciclícos potenciales transductores en el reino vegetal; actividad de ciclasas (adenilato y guanilato) en Triticum aestivum en diversas condiciones

El objetivo de este proyecto en general es iniciar estudios de reducción nucleotídica en el reino vegetal. Específicamente, el objetivo planteado es la actividad de ciclasas (adenilato y guanilato), enzimas de síntesis de los nucleótidos cíclicos cAMP y cGMP respectivamente, en Triticum aestivum en diferentes condiciones de iluminación y presión osmótica. La presencia de nucleótidos cíclicos en el reino vegetal es aún motivo de controversias y continúa como un área no explorada ante la escasez de información experimental al respecto, razones que motivan este proyecto. El material de estudio serán segmentos de Triticum aestivum de siete días de desarrollo, de aproximadamente 6 cm., sin porción basal o apical. En extractos obtenidos a partir de este material, se estudiará la actividad de ciclasas (adenilato y guanilato) mediante la capacidad de las muestras de producir cAMP y/o cGMP, producto directo de síntesis de ciclasas. La concentración de cAMP y cGMP de las muestras será dosada por radioinmunoensayo (RIE), metodología rutinaria en este laboratorio. El diseño experimental prevé el estudio de ciclasas en esta especie vegetal en condiciones de temperatura e iluminación controladas; así como la exposición de muestras a distintas condiciones de presión osmótica obtenidas con distintas concentraciones de manitol (0, 0.2M 0.5M manitol).

Metabolismo de las Purinas y Pirimidinas: Errores hereditarios primarios y alteraciones secundarias en otros defectos genéticos

En este trabajo se propuso el estudio de los desórdenes genéticos en el metabolismo de las purinas (Pu) y pirimidinas (Pi), debido a que dentro del amplio espectro de enfermedades metabólicas hereditarias (EMH) que fueron identificándose en nuestro medio no se incluían estas entidades, probablemente por el desconocimiento de su existencia y también por la carencia de la metodología necesaria para su pesquisa. Hasta el presente fueron identificados veintitrés defectos hereditarios que involucran las enzimas esenciales del metabolismo de las Pu y Pi, diecisiete de ellos asociados con serias consecuencias clínicas; los sistemas frecuentemente afectados son: inmunológico, hematológico, neurológico y renal. Defectos enzimáticos en este metabolismo, como por ejemplo el de la enzima Tiopurina S-metiltransferasa (TPMT), pueden provocar también intolerancia al tratamiento de diversas enfermedades con drogas análogas a las Pu y Pi. Los principios de identificación de los desórdenes de las Pu y Pi comprenden la investigación del producto del gen anormal, es decir esencialmente la aplicación de la genética bioquímica que estudia: a) el defecto genético evaluando la consecuencia del bloqueo de la vía metabólica normal por deficiencia de los productos o por acumulación de los precursores de estos metabolitos; b) la actividad enzimática específica, la cual puede presentar una deficiencia total, parcial o sobreactividad. Además se puede aplicar la genética molecular, es decir la investigación de las mutaciones responsables del defecto metabólico de utilidad para la confirmación diagnóstica y para establecer correlaciones genotipo-fenotipo. El estudio abarcó tres áreas estrictamente relacionadas con el tópico central, el metabolismo de las Pu y Pi, y concatenadas en sus objetivos específicos: I. Investigación de las enfermedades genéticas de las Pu y Pi. Objetivo: - Reconocer las EMH-PuPi a través de un protocolo selectivo que permita definir las alteraciones bioquímicas, enzimáticas y moleculares en pacientes presuntos de padecer estos defectos. II. Investigación del polimorfismo genético de la TPMT en la población argentina. Objetivo: - Investigar el polimorfismo genético de la TPMT, fenotipo bioquímico (actividad enzimática) - genotipo (mutaciones), en la población argentina debido a que esta enzima es un excelente ejemplo del potencial impacto de la farmacogenética en medicina. II. Investigación de posibles mecanismos de excitotoxicidad y deficiencia energética en pacientes con diferentes EMH mediante el análisis de bases y nucleósidos en el LCR. Objetivo: - Establecer posibles interacciones entre otras vías comprometidas con la del metabolismo de las Pu y Pi en EMH de exacta nosología.

Regulación transcripcional y relación entre estructura y función de proteínas relacionadas con el metabolismo de colina en Pseudomonas aeruginosa. Transcriptional regulation and relationship between structure and function of proteins related with the choline metabolism in Pseudomonas aeruginosa.

El objetivo general de este proyecto es dilucidar los mecanismos de acción a nivel molecular de enzimas y proteínas involucradas en el metabolismo de colina en Pseudomonas aeruginosa, con énfasis en la identificación de residuos aminoacídicos críticos y regulación de la expresión de los genes en estudio. Los objetivos específicos que se palntean involucran abordajes bioquímicos y moleculares y serán llevados a cabo mediante técnicas de biología molecular y bioquímica (mutación sitio-dirigida, deleción génica, expresión y purificación de proteínas, fusión transcripcional a genes reporteros, etc). Planteo de hipótesis: las proteínas que se inducen por colina (fosforilcolina fosfatasa (PchP), fosfolipasa C (PlcH), acetilcolinestera (AchE), proteínas periplásmicas unidoras de colina (PUch) podrían compartir: a) una organización génica y responder a la regulación por proteínas regulatorias o a factores ambientales de manera similar; b) residuos aminoacídicos conservados que intervengan en la unión o interacción con diferentes ligandos, principalmente, colina. Para ello, se plantean los siguientes Objetivos Específicos: 1) identificar las zonas promotoras de los genes que codifican para PchP, PlcH, AchE y PUch, a fin de localizar posibles sitios de unión a proteínas reguladoras y los factores ambientales que afectan la actividad promotora. 2) determinar en las proteínas mencionadas los residuos aminoacídicos de importancia involucrados en la catálisis y en la interacción con ligandos, principalmente en la unión a compuestos de alquilamonio; 3) Se iniciarán estudios que demuestren la relación entre la inducción por colina de varios factores de patogenicidad la virulencia del microorganismo, empleando mutantes simples o múltiples en estos factores y como modelo de patogenicidad el nematodo C. elegans. A partir de los resultados obtenidos se pretende tener un conocimiento profundo sobre la regulación molecular y bioquímica de varias enzimas comprometidas en la patología que produce P. aeruginosa. Esto más el conocimiento de la fisiología de este microorganismo abre el camino para la búsqueda de posibles blancos de acción de drogas. Por otro lado, se espera tener un conocimiento integral sobre la regulación de la expresión de las actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo de colina y la respuesta de P. aeruginosa ante la presencia de compuestos de alquilamonio utilizados como nutrientes. Se espera conocer el papel que desempeña cada uno de los sitios de unión a los diferentes ligandos para el funcionamiento y control de las enzimas mencionadas y explicar el comportamiento diferencial de las enzimas frente a distintos sustratos y otros ligandos. El conocimiento de los sitios de unión a compuestos de alquilamonio permitirá encontrar esos dominios en diferentes proteínas del género Pseudomonas y otras bacterias Gram negativas. Desde el punto de vista evolutivo, se podrá comparar la similitud de los sitios de unión a colina entre proteínas de organismos eucariotas con procariotas (ej. PUch de bacterias Gram positivas, transportadores de colina, proteína C reactiva, AchE de eucariotas contra las encontradas en bacterias del género Pseudomonas, fosfolipasas A, C o D, etc.). Este proyecto permitirá concretar al menos dos tesis doctorales (Sanchez, Otero) más varios trabajos finales de grado (tesinas) que son y serán realizados por alumnos de la carrera de Microbiología en la UNRC. Les permitirá a los doctorandos y a los alumnos de grado adquirir una formación bastante integral ya que utilizarán herramientas de la fisiología general bacteriana, de la bioquímica clásica, de la biología molecular y de la bioinformática.

Respuesta adaptativa y degradación de compuestos de amonio cuaternarios sintéticos por Pseudomonas putida. Adaptative answer and degradation of quaternary ammonium compounds by Pseudomonas putida.

El objetivo de este trabajo es caracterizar la respuesta de P. putida frente a condiciones ambientales adversas dadas por la presencia del detergente catiónico tetradeciltrimetilamonio (TDTMA). El objetivo final que se persigue es el de utilizar este microorganismo como vehículo en procesos de biorremediación. El proyecto comprende aspectos relacionados con la degradación y con la respuesta adaptativa que le permiten a P. putida tolerar altas concentraciones del biocida. La degradación de TDTMA por P. putida involucra una actividad monooxigenasa, que produce trimetilamina (TMA) y tetradecilalcanal. Parte de la TMA producida es demetilada, por una TMAdehidrogenasa (TMADH), e utilizada por la bacteria como fuente de nitrógeno y parte es acumulada intracelularmente, inhibiendo el crecimiento bacteriano. Considerando la importancia de las oxigenasas y dehidrogenasas en la transformación química de compuestos recalcitrantes, se identificarán los genes responsables de la actividad monooxigenasa y de la TMADH, se caracterizarán las enzimas, lo que permitirá conocer, además, datos evolutivos de las mismas. Teniendo en cuenta que la acumulación intracelular TMA conduce a la degradación parcial del detergente, efecto contrarrestado por la adición de aluminio (Al), se investigarán si otros factores nutricionales participan en el control de la degradación de TDMA por P. putida. Se investigará si el regulador global NtrC, que se activa en respuesta a limitación de nitrógeno, participa en el metabolismo de TDTMA. Se prevé construir mutantes en los genes que codifican para monoxigenasa y TMADH y analizar la respuesta de estas cepas frente al estrés ocasionado por TDTMA y Al. En este proyecto se postula además que los cambios a nivel de fosfolípidos (PL) de membrana son una estrategia de P. putida para sobrevivir en presencia del TDTMA. Para concluir si fosfatidilglicerol es el principal responsable de la adaptación de P. putida frente al estrés ocasionado por TDTMA, se pretenden obtener mutantes afectadas en la biosíntesis de novo de PL, particularmente en cardiolipina sintasa. Paralelamente se estudiará si fosfolipasa D participa en la respuesta, lo que permitirá asignar un rol a esta enzima en procesos de señalización análogos a los que ocurren en organismos eucariotas. En presencia de TDTMA y Al, P. putida responde aumentando el contenido de fosfatidilcolina y posiblemente este PL actúe como un reservorio temporario del ión. Identificar en P. putida los genes que codifican para las enzimas responsables de su biosíntesis, particularmente fosfatidilcolina sintasa y/o fosfolípido N-metiltranferasa, conducirá a conocer el mecanismo por el cual fosfatidilcolina estaría involucrada en la respuesta a Al.

Metabolismo de fosfolípidos, señal de calcio y sus implicancias en la diferenciación de Trypanosoma cruzi. Phospholipids metabolism, calcium signal and its implications in the differentiation of Trypanosoma cruzi.

Trypanosoma cruzi es un protozoo primitivo agente causal de la enfermedad de Chagas. La transmisión de esta enfermedad depende tanto del desarrollo y de la diferenciación del microorganismo en el intestino del vector. Las diferentes formas del parásito se han adaptado a una serie de condiciones impuestas por los distintos ambientes en donde debió habitar. Esta capacidad de sobrevivir a medios externos tan variados está dada por la diversidad en las vías de transducción de señales en el parásito. T. cruzi se multiplica y diferencia (metaciclogénesis) en el recto de los triatominos. A este nivel, los parásitos se enfrentan a un incremento en la osmolaridad causado por un elevado contenido de NaCl en la orina. En nuestro laboratorio se observó que diferentes estímulos son capaces de producir incrementos en los niveles de IP3 y de Ca2+ intracelular, consecuencia de la activación del ciclo del inositol fosfato, y activación de fosfolipasa D (PLD) y fosfatidilinositol 3 quinasa (PI3K). En un medio carente de Na+ los epimastigotes estimulados con carbacol, mostraron una señal de calcio disminuida mientras que la acumulación de IP3 no se modificó. Además, esta señal se incrementó en presencia de PMA, activador de proteína quinasa C, mientras que la acumulación de IP3 se anuló completamente. Estos resultados indujeron a pensar en un mecanismo alternativo y/o paralelo a IP3 en la liberación de Ca2+, en el cual la presencia de un intercambiador Na+/H+ favorecería la liberación del ion desde organelas acídicas. Es conocido que la señal de calcio es requerida para la metaciclogénesis, y que esta señal es independiente del Ca2+ extracelular (Lammel y col. 1996, Marchesini y col., 2002). De este modo se propone que "los epimastigotes de T. cruzi utilizan como elementos conservados a lo largo de la evolución a los elementos del ciclo del inositol fosfato, uno de los sistemas de transducción de señales más antiguo, para responder a estímulos que inducen la diferenciación del parásito". Por lo tanto, para el desarrollo de este proyecto se propone determinar la presencia de un RcIP3 en epimastigotes y conocer su compromiso en la liberación de Ca2+ desde reservorios intracelulares. Además, establecer si un intercambiador Na+/H+ en membrana de acidocalcisomas estaría relacionado con la señal de calcio intracelular y su posible regulación por proteina quinasa C y A (PKC y PKA, respectivamente). Por otro lado, para dilucidar la implicancia de estos mecanismos en el proceso de metaciclogénesis, se propone estudiar la activación del intercambiador Na+/H+ y la señal de calcio en condiciones de hiperosmolaridad, tal como ocurre en el recto del triatomino. Ademas, ya que el proceso de diferenciación involucra una reorganización de los microtubulos del citoesqueleto se pretende estudiar el compromiso del metabolismo de fosfolípidos y tubulina en procesos que contribuyen a la inducción de la metaciclogenesis. El alcance de los objetivos mencionados ayudará a dilucidar la presencia de componentes tales como RcIP3 y el intercambiador Na+/H+ involucrados en la señalización del ion bivalente. Por otro lado, se espera demostrar que los isotipos de tubulina encontrados en T. cruzi cambien en cantidad relativa y nivel de expresión cuando los epimastigotes sean estimulados con posibles inductores de la diferenciación. Además, se espera observar simultáneamente un aumento en la actividad de dos enzimas relacionadas con la reorganización de microtúbulos: PI-3K y PLD. En tal caso, y para comprobar su implicancia en el proceso, se espera que la inhibición de tales enzimas sea capaz de revertir el efecto producido por los estímulos. Como la PLC se expresa principalmente en las forma epimastigotes mas que en los tripomastigotes (forma infectiva), la señal de Ca2+ inducida por IP3 se relacionaría con la capacidad del parásito para responder a ciertos cambios de pH y osmolaridad que enfrenta el microorganismo en el tracto digestivo del insecto vector.