Homogneous time resolved fluorescence: a new technique for detection and quantifications of infliximab in autoimmune patients

RESUMO:As terapias biológicas revolucionaram o tratamento das doenças autoimunes nos últimos anos. Tipicamente têm como alvos mediadores importantes no mecanismo das doenças. Os antagonistas do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) são um grupo de agentes biológicos muito prescrito, pois estão indicados no tratamento de doenças imuno-mediadas comuns, tais como artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, artrite psoriática, espondilite anquilosante, doença de Crohn e colite ulcerosa. Com o uso frequente de inibidores do TNF-α, tem-se tornado evidente que estes agentes têm um potencial imunogénico importante, que pode comprometer o prognóstico a longo prazo dos doentes cronicamente tratados. A produção de anticorpos anti-fármaco parece causar falência terapêutica secundária em muitos doentes. Um dos efeitos dos anticorpos anti-fármaco é o aumento da eliminação do fármaco. A eliminação do fármaco, por sua vez, varia entre indivíduos, refletindo diferentes perfis farmacocinéticos. A determinação dos níveis séricos mínimos do agente anti-TNF-α é assim muito informativa e pode auxiliar nas decisões terapêuticas. Contudo, os testes imunológicos para determinar as concentrações séricas do fármaco não estão facilmente disponíveis na prática clínica. De forma a investigar uma nova técnica potencialmente fidedigna e prática para a deteção e quantificação dos agentes biológicos anti-TNF-α, foi testada a técnica por HTRF (homogeneous time-resolved fluorescence resonance energy transfer) para a determinação de concentrações séricas de infliximab. Apesar de apresentar algumas limitações relacionadas com as condições de leitura da fluorescência, esta técnica provou obter resultados próximos das concentrações obtidas por ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) bridging. Adicionalmente, tem a vantagem de ser de execução muito mais fácil e rápida. Deste modo, a técnica por HTRF poderá ser otimizada e tornar-se uma valiosa ferramenta laboratorial para orientar as decisões terapêuticas em doentes autoimunes com falência da terapêutica anti-TNF-α.--------- ABSTRACT: Biologic therapies revolutionized the treatment of autoimmune diseases in the last years. Typically, they target important disease mediators. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) antagonists constitute a very prescribed group of biologic agents as they are indicated for the treatment of common immune-mediated diseases, such as rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn’s disease and ulcerative colitis. With the increasing use of TNF-α inhibitors it has been noticed that they have an important immunogenic potential that can compromise long-term outcomes in chronically treated patients. The production of anti-drug antibodies seems to cause secondary therapeutic failure in many patients. One of the effects of anti-drug antibodies is the enhancement of drug clearance. Drug clearance, in turn, varies among individuals, reflecting different pharmacokinetic profiles. Determination of serum anti-TNF-α drug trough levels is though very informative and could support treatment decisions. However, immunologic assays to determine drug serum concentrations are not readily available in clinical practice. In order to investigate a potentially reliable and practical new technique for detection and quantification of anti-TNF-α biologic agents, homogeneous time-resolved fluorescence resonance energy transfer (HTRF) technique was tested for determination of serum infliximab concentrations. Although presenting some limitations related with fluorescence reading conditions, this technique proved to give results close to the concentrations obtained by the widely used bridging enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In addition, it has the advantage of being much easier and faster to perform. Thus, HTRF technique can be optimized and become a valuable laboratorial tool to guide treatment decisions in autoimmune patients with anti-TNF-α therapy failure.

Princípios de terapêutica antibiótica na doença crítica

RESUMO: A infeção é frequente durante a doença crítica, quer como causa da doença crítica quer como complicação da sua evolução. Paradoxalmente, os avanços da medicina moderna aumentaram eles próprios o risco de infeção, ao permitir a sobrevida até idades avançadas, ao criar um novo grupo de doentes imunodeprimidos, nomeadamente doentes tratados com fármacos que interferem com as suas defesas naturais (corticóides, citostáticos), ao aumentar o tempo de vida de hospedeiros com comorbilidades debilitantes. Os antibióticos são um dos elos essenciais no tratamento da infeção. Contudo o seu uso também promove a seleção e crescimento de bactérias resistentes. Para além disso as doses convencionais de antibióticos foram selecionadas numa altura em que a resistência era um fenómeno raro e podem não ser atualmente as mais adequadas. Existe hoje muita evidência acumulada que os doentes críticos sofrem alterações da sua farmacocinética (PK) que podem facilitar a ocorrência de falência terapêutica ou de toxicidade tanto por sub como por sobredosagem de antibióticos. Essas alterações são complexas e difíceis de estudar. Finalmente, também a farmacodinâmica (PD) dos antibióticos pode estar alterada nesta população, podendo haver necessidade de ajustar os alvos terapêuticos de forma individual. O objetivo deste trabalho foi investigar a relação entre a terapêutica antibiótica, as suas características PK e PD, a carga bacteriana e o prognóstico dos doentes críticos. O plano de investigação incluiu: 1. Dados da epidemiologia portuguesa de doentes críticos com infeção; 2. Avaliação da relação entre a carga bacteriana, o tempo até ao início do tratamento antibiótico e o prognóstico dos doentes críticos; 3. Avaliação da evolução da PK durante o tratamento da infeção; 4. Um estudo multicêntrico para avaliação da eficácia da terapêutica com um β- lactâmico doseado de acordo com a relação PK/PD. Na introdução é descrita a importância dos antibióticos, a sua origem e o problema crescente das resistências bacterianas relacionadas com o seu emprego e abuso. É salientada a importância de racionalizar a posologia, de acordo com os conceitos de PK e de PD. No Capítulo 1 são apresentados dados de epidemiologia portuguesa de infeção em doentes críticos, sobretudo retirados de dois estudos prospetivos, observacionais, os quais incluíram mais de 50% da capacidade de internamento em cuidados intensivos existente em Portugal. No Capítulo 2 são descritos os conceitos de PK e as suas alterações nos doentes críticos. De seguida são revistos os conceitos de PD de antibióticos e a sua aplicação a esta população, em particular durante as infeções graves (Capítulo 3). Nos capítulos seguintes são aprofundadas estas alterações da PK nos doentes críticos e as suas causas, de forma a destacar a importância da monitorização da concentração dos antibióticos. São apresentados os dados duma revisão sistemática de PK de antibóticos nesta população (Capítulo 4), pormenorizadas as alterações da PD que comprometem a eficácia da terapêutica antibiótica, facilitam o desenvolvimento de resistências e podem levar a falência terapêutica (Capítulo 5). Consequentemente a compreensão global destas alterações, da sua relevância clínica e a revisão da evidência disponível facilitou o desenvolvimento do próprio plano global de investigação (Capítulos 6 e 7). No Capítulo 6.1 são descritos os antibióticos tempo-dependente e a importância de aumentar o seu tempo de perfusão. Foi desenhado um estudo multicêntrico para comparar a eficácia e segurança da perfusão contínua da piperacilina tazobactam (um antibiótico β-lactâmico associado a um inibidor de β-lactamases) com a mesma dose do antibiótico, administrado em dose convencional, intermitente. A importância de dosear corretamente os antibióticos concentração-dependente foi também avaliada num estudo a primeira dose dos aminoglicosídeos (Capítulo 6.2). Outras estratégias para melhorar os resultados assistenciais dos doentes infetados são abordadas no Capítulo 7, em particular a importância da terapêutica antibiótica precoce, a avaliação da carga bacteriana e a compreensão da variação da PK ao longo do tratamento da infeção. Foi desenvolvido um algoritmo de abordagem terapêutica que incluiu estas alterações da PK e da PD nos doentes críticos. Finalmente no Capítulo 8 são descritos mecanismos de desenvolvimento das resistências bacterianas bem como estratégias para a sua abordagem. O Capítulo final (Capítulo 9) aponta um plano para futuras áreas de trabalho. O elemento chave identificado neste trabalho de investigação é o reconhecimento da variabilidade significativa da PK dos antibióticos durante a doença crítica, a qual condiciona a sua posologia. Estas alterações estão relacionadas com a própria gravidade da doença e tendem a diminuir ao longo do seu tratamento. No entanto nem a gravidade da doença nem as características individuais as permitem prever de forma aceitável pelo que a utilização duma posologia universal, independente da situação clínica concreta, pode ser inadequada. As estratégias para melhorar os resultados assistenciais dos doentes críticos infetados devem ser baseadas na individualização da posologia antibiótica de acordo com os princípios da PK e da PD, preferencialmente apoiadas em doseamentos da sua concentração. ------------------------------------ ABSTRACT: Infection commonly occurred during critical illness, either as a cause or complicating the course of the disease. Advances in medicine had paradoxically increase the risk of infection, both by improving survival to older ages and by introducing a new group of immunosuppressed patients, those who are treated with drugs that interfere with their natural defenses (corticosteroids, cytostatics) and those who survived longer with aggressive diseases. Antibiotics are of paramount importance for treating infection. However the use of these drugs also promote the selection and growth of resistant bacteria. Furthermore conventional antibiotic doses were calculated for less severe patients during a time when resistance was rare. Nowadays there is increasing evidence that critically ill patients experiment altered pharmacokinetics (PK) that may lead to therapeutic failure and/or drug toxicity. Equally, such PK alterations are complex and challenging to investigate. Finally pharmacodynamics (PD) may also be different in this population and antibiotic targets may need to be tailored to the individual patient. The aim of this research was to investigate the relationship between antibiotic therapy, its PK and PD, bacterial burden and critically ill patients outcomes. The research plan comprised of: 1. Epidemiological portuguese data of critically ill infected patients; 2. Relationship between burden of bacteria, time until the start of antibiotics and patient outcomes; 3. Evaluation of PK during treatment of infection; 4. A multicentre study evaluating PK guided β-lactam therapy. The introductory chapter outlines the importance of antibiotics, its origins, the problem of increasing bacteria resistance, related to its use and overuse and the importance of rational drug dosing using PK and PD concepts. In Chapter 1 portuguese epidemiological data of infections in critically ill patients is presented, mostly coming from two prospective observational studies, encompassing more than 50% of critically ill beds available in Portugal. Chapter 2 describes the concepts of PK and the changes occurring in critically ill patients. This is followed by a review of the concepts of PD of antibiotics and its application to this population, especially during severe infections (Chapter 3). In the following chapter these changes in antibiotics PK in critical illness are and its causes are detailed, to outline the importance of therapeutic drug monitoring. Data on a systematic review of antibiotics PK in those patients is provided (Chapter 4). The following chapter (Chapter 5) elucidates important changes in PD, that compromises antibiotic therapy, facilitate the occurrence of resistance and may lead to therapeutic failure. Thus, an understanding of the clinical problem and available evidence facilitated the development of a comprehensive research plan (Chapter 6 and Chapter 7). Chapter 6.1 describes time-dependent antibiotics and the importance of extending its perfusion time. A multicenter study was designed to compare the continuous infusion of piperacillin tazobactam (a β-lactam antibiotic) with the same daily dose, prescribed in a conventional, intermittent dose. The importance of correct dosing of antibiotics was also assessed through a study addressing aminoglycoside (a concentration-dependent antibiotic) therapy (Chapter 6.2), focusing on its first dose. Strategies to improve severe infected patients outcomes were addressed in Chapter 7, namely the importance of early antibiotic therapy, assessing the burden of bacteria and understanding changes in antibiotic concentration during the course of infection. An algorithm to include all the described changes in both PK and PD of critically ill patients was developed. Finally in Chapter 8 mechanisms of the increasing resistance of bacteria are described and strategies to address that problem are proposed. The closing chapter (Chapter 9) lays a roadmap for future work. The key finding of this research is the significant variability of the antibiotics PK during critical illness, which makes dosing a challenging issue. These changes are related to the severity of the infection itself and improve through the course of the disease. However neither disease severity nor individual characteristics are useful to predict PK changes. Therefore, the use of a universal dose approach, regardless of the individual patient, may not be the best approach. Strategies to improve patients’ outcomes should be based on tailoring antibiotics to the individual patient, according to PK and PD principles, preferentially supported by therapeutic drug monitoring.

Economies of scale and scope in the provision of diagnostic techniques and therapeutic services in Portuguese hospitals

This paper analyses the provision of auxiliary clinical services that are typically carried out within the hospital. We estimate a exible cost function for the three most important (cost- wise) diagnostic techniques and therapeutic services in Portuguese hospitals: Clinical Pathology, Medical Imaging and Physical Medicine and Rehabilitation. Our objective in carrying out this estimation is the evaluation of economies of scale and scope in the provision of these services. For all services, we nd evidence of ray economies of scale and some evidence of economies of scope. These results have important policy implications and can be related to the ongoing discussion of where and how should hospitals provide these services.

Reconstitution of the failure of the Fonte Santa mine tailings dam. Modelling of the dam breaching process

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Civil Perfil de Estruturas e Geotecnia

Transplante hepático sequencial com preservação da veia cava inferior (técnica de "Duplo Piggyback") : uma técnica original

RESUMO:Desde a declaração de Bethesda em 1983, a transplantação hepática é considerada um processo válido e aceite na prática clínica para muitos doentes com doença hepática terminal, relativamente aos quais não houvesse outra alternativa terapêutica. Em 1991, por proposta de Holmgren, professor de genética, o cirurgião sueco Bo Ericzon realizou em Huntingdon (Estocolmo) o primeiro transplante hepático num doente PAF (Polineuropatia Amilloidótica Familiar), esperando que a substituição do fígado pudesse frenar a evolução da doença. Nesta doença hereditária autossómica dominante, o fígado, apesar de estrutural e funcionalmente normal, produz uma proteína anormal (TTR Met30) responsável pela doença. A partir de então, a transplantação hepática passou a ser a única terapêutica eficaz para estes doentes. Portugal é o país do mundo com mais doentes PAF, tendo sido o médico neurologista português Corino de Andrade quem, em 1951, identificou e descreveu este tipo particular de polineuropatia hereditária, também conhecida por doença de Andrade. Com o início da transplantação hepática programada em Setembro de 1992, o primeiro doente transplantado hepático em Portugal, no Hospital Curry Cabral, foi um doente PAF. Desde logo se percebeu que a competição nas listas de espera em Portugal, entre doentes hepáticos crónicos e doentes PAF viria a ser um problema clínico e ético difícil de compatibilizar. Em 1995, Linhares Furtado, em Coimbra, realizou o primeiro transplante dum fígado dum doente PAF num doente com doença hepática metastática, ficando este tipo de transplante conhecido como transplante sequencial ou “em dominó”. Fê-lo no pressuposto de que o fígado PAF, funcional e estruturalmente normal, apesar de produzir a proteína mutada causadora da doença neurológica, pudesse garantir ao receptor um período razoável de vida livre de sintomas, tal como acontece na história natural desta doença congénita, cujas manifestações clínicas apenas se observam na idade adulta. A técnica cirúrgica mais adequada para transplantar o doente PAF é a técnica de “piggyback”, na qual a hepatectomia é feita mantendo a veia cava do doente, podendo o transplante ser feito sem recorrer a bypass extracorporal. Antes de 2001, para fazerem o transplante sequencial, os diferentes centros alteraram a técnica de hepatectomia no doente PAF, ressecando a cava com o fígado conforme a técnica clássica, recorrendo ao bypass extracorporal. No nosso centro imaginámos e concebemos uma técnica original, com recurso a enxertos venosos, que permitisse ao doente PAF submeter-se à mesma técnica de hepatectomia no transplante, quer ele viesse a ser ou não dador. Essa técnica, por nós utilizada pela primeira vez a nível mundial em 2001, ficou conhecida por Transplante Sequencial em Duplo Piggyback. Este trabalho teve como objectivo procurar saber se a técnica por nós imaginada, concebida e utilizada era reprodutível, se não prejudicava o doente PAF dador e se oferecia ao receptor hepático as mesmas garantias do fígado de cadáver. A nossa série de transplantes realizados em doentes PAF é a maior a nível mundial, assim como o é o número de transplantes sequenciais de fígado. Recorrendo à nossa base de dados desde Setembro de 1992 até Novembro de 2008 procedeu-se à verificação das hipóteses anteriormente enunciadas. Com base na experiência por nós introduzida, a técnica foi reproduzida com êxito em vários centros internacionais de referência, que por si provaram a sua reprodutibilidade. Este sucesso encontra-se publicado por diversos grupos de transplantação hepática a nível mundial. Observámos na nossa série que a sobrevivência dos doentes PAF que foram dadores é ligeiramente superior àqueles que o não foram, embora sem atingir significância estatística. Contudo, quando se analisaram, apenas, estes doentes após a introdução do transplante sequencial no nosso centro, observa-se que existe uma melhor sobrevida nos doentes PAF dadores (sobrevida aos 5 anos de 87% versus 71%, p=0,047).Relativamente aos receptores observámos que existe um benefício a curto prazo em termos de morbi-mortalidade (menor hemorragia peri-operatória) e a longo prazo alguns grupos de doentes apresentaram diferenças de sobrevida, embora sem atingir significância estatística, facto este que pode estar relacionado com a dimensão das amostras parcelares analisadas. Estes grupos são os doentes com cirrose a vírus da hepatite C e os doentes com doença hepática maligna primitiva dentro dos critérios de Milão. Fora do âmbito deste trabalho ficou um aspecto relevante que é a recidiva da doença PAF nos receptores de fígado sequencial e o seu impacto no longo prazo. Em conclusão, o presente trabalho permite afirmar que a técnica por nós introduzida pela primeira vez a nível mundial é exequível e reprodutível e é segura para os doentes dadores de fígado PAF, que não vêem a sua técnica cirúrgica alterada pelo facto de o serem. Os receptores não são, por sua vez, prejudicados por receberem um fígado PAF, havendo mesmo benefícios no pós-operatório imediato e, eventualmente, alguns grupos específicos de doentes podem mesmo ser beneficiados.---------ABSTRACT: Ever since Bethesda statement in 1983, Liver Transplantation has been accepted as a clinical therapeutic procedure for many patients with advanced hepatic failure Holmgren, professor of genetics, suggested that one could expect that transplanting a new liver could lead to improve progressive neurological symptoms of Familial Amyloidotic Polyneuropathy (PAF). Bo Ericzon, the transplant surgeon at Huddinge Hospital in Stockholm, Sweden, did in 1991 the first Liver Transplant on a FAP patient. FAP is an inherited autosomal dominant neurologic disease in which the liver, otherwise structural an functionally normal, produces more than 90% of an abnormal protein (TTR Met30) whose deposits are responsible for symptoms. Liver Transplantation is currently the only efficient therapy available for FAP patients. Portugal is the country in the world where FAP is most prevalent. The Portuguese neurologist Corino de Andrade was the first to recognize in 1951 this particular form of inherited polyneuropathy, which is also known by the name of Andrade disease. Liver Transplantation started as a program in Portugal in September 1992. The first patient transplanted in Lisbon, Hospital Curry Cabral, was a FAP patient. From the beginning we did realize that competition among waiting lists of FAP and Hepatic patients would come to be a complex problem we had to deal with, on clinical and ethical grounds. There was one possible way-out. FAP livers could be of some utility themselves as liver grafts. Anatomically and functionally normal, except for the inherited abnormal trace, those livers could possibly be transplanted in selected hepatic patients. Nevertheless the FAP liver carried with it the ability to produce the mutant TTR protein. One could expect, considering the natural history of the disease that several decades would lapse before the recipient could suffer symptomatic neurologic disease, if at all. In Coimbra, Portugal, Linhares Furtado performed in 1995 the first transplant of a FAP liver to a patient with metastatic malignant disease, as a sequential or “domino” transplant. FAP Liver Transplant patients, because of some dysautonomic labiality and unexpected reactions when they are subjected to surgery, take special advantage when piggyback technique is used for hepatectomy. This technique leaves the vena cava of the patient undisturbed, so that return of blood to the heart is affected minimally, so that veno-venous extracorporeal bypass will not be necessary. The advantages of piggyback technique could not be afforded to FAP patients who became donors for sequential liver transplantation, before we did introduce our liver reconstruction technique in 2001. The hepatectomy took the vena cava together with the liver, which is the classical technique, and the use of extracorporeal veno-venous bypass was of necessity in most cases. The reconstruction technique we developed in our center and used for the first time in the world in 2001 consists in applying venous grafts to the supra-hepatic ostia of piggyback resected FAP livers so that the organ could be grafted to a hepatic patient whose liver was itself resected with preservation of the vena cava. This is the double piggyback sequential transplant of the liver. It is the objective of this thesis to evaluate the results of this technique that we did introduce, first of all that it is reliable and reproducible, secondly that the FAP donor is not subjected to any additional harm during the procedure, and finally that the recipient has the same prospects of a successful transplant as if the liver was collected from a cadaver donor. Our series of liver transplantation on FAP patients and sequential liver transplants represent both the largest experience in the world. To achieve the analysis of the questions mentioned above, we did refer to our data-base from September 1992 to November 2008. The reconstructive technique that we did introduce is feasible: it could be done with success in every case ion our series. It is also reproducible. It has been adopted by many international centers of reference that did mention it in their own publications. We do refer to our data-base in what concerns the safety for the FAP donor.Five years survival of FAP transplanted patients that have been donors (n=190) has been slightly superior to those who were not (n=77), with no statistical significance. However, if we consider five year survival of FAP transplanted patients after the beginning of sequential transplant program in our center, survival is better among those patients whose liver was used as a transplant (87% survival versus 71%, p=0.047). In what concerns recipients of FAP livers: Some short-term benefit of less perioperative morbi-mortality mainly less hemorrhage. In some groups of particular pathologies, there is a strong suggestion of better survival, however the scarcity of numbers make the differences not statistically significant. Patients with cirrhosis HVC (83% versus73%) and patients with primitive hepatic cancer within Milan criteria (survival of 70% versus 58%) are good examples. There is one relevant problem we left beyond discussion in the present work: this is the long-term impact of possible recurrence of FAP symptoms among recipients of sequential transplants. In Conclusion: The reconstruction technique that we did develop and introduce is consistently workable and reproducible. It is safe for FAP donors with the advantage that removal of vena cava can be avoided. Hepatic patients transplanted with those livers suffer no disadvantages and have the benefit of less hemorrhage. There is also a suggestion that survival could be better in cirrhosis HVC and primary liver cancer patients.

Transplante renal : desigualdades no acesso

RESUMO - Em Portugal estima-se que existam cerca de 14 mil insuficientes renais crónicos e estima-se que em 2025 sejam 24 mil. As alternativas de tratamento são: hemodiálise, diálise peritoneal ou o transplante renal. Das alternativas de tratamento, o transplante renal é considerado a melhor alternativa terapêutica proporcionando melhor qualidade de vida, aumentando a sobrevida dos doentes, caracterizando-se por ser menos oneroso e por apresentar melhor custo- efectivo, quando comparado com hemodiálise ou diálise peritoneal. Portugal situa-se entre os primeiros da Europa, relativo ao número de transplantes renais efectuados (56,1 por milhão de habitante), em 2010 efectuaram-se 573 transplantes renais. Apesar disso, muitos são os doentes que continuam em lista de espera a aguardar transplante, em média os doentes esperam cerca de dois a três anos por um transplante renal, quando o tempo ideal seria três a seis meses. Por outro lado, estudos internacionais demonstram que existem desigualdades no acesso ao transplante renal, assim à semelhança de outros países torna-se pertinente estudar a realidade portuguesa em relação à temática da desigualdade no acesso, dado o objectivo primordial do Serviço Nacional de Saúde de garantir a equidade nos cuidados de saúde. Este trabalho tem como objectivo principal avaliar se factores como o sexo, idade a localização geográfica influenciam o acesso ao transplante renal, contribuindo para desigualdades no acesso. Este trabalho baseou-se na base de dados dos doentes inscritos em lista de espera para transplante renal, respeitante à área de abrangência do Centro de Histocompatibilidade do Sul. Caracterizou-se a população quanto ao sexo, idade, concelho, região de saúde e unidade de transplantação. Determinou-se ainda, os tempos médios de espera para inscrição em lista activa e para transplante por sexo, idade, região de saúde e unidade de transplantação.Dos resultados obtidos salienta-se que as desigualdades encontradas no acesso ao transplante renal verificam-se entre o início do tratamento até à inscrição em lista activa para transplante. Depois dos doentes em lista activa, o tempo de espera médio não é influenciado significativamente pelo sexo, idade ou localização geográfica.

A lesão de isquémia/reperfusão em transplante hepático: análise genética, morfológica e correlação clínica

RESUMO: O transplante hepático ortotópico é uma terapêutica aceite para casos selecionados de falência hepática terminal. O procedimento tem-­‐se aperfeiçoado, evidenciado pelo aumento da taxa de sobrevida de 30 para 75% aos 5 anos, mas cerca de 13 a 27% dos enxertos desenvolve falência primária (PNF) ou disfunção primária (DF) após o transplante. As consequências são devastadoras para a sobrevida do doente e do enxerto. A sua etiologia é multifactorial, incluindo factores relacionados com o dador e o receptor, tempos de isquémia, agressões cirúrgicas, bem como características anatomopatológicas do enxerto. A lesão de isquémia/reperfusão mantem-­‐se como um factor de risco intra operatório, com implicações directas sobre toda a evolução do transplante : existe uma relação íntima entre a PNF e a DF, a preservação do enxerto, a lesão de isquémia/reperfusão, e a falência do transplante. Além disso, está comprovada evidência que sugere que a lesão de I/R torna um aloenxerto mais vulnerável por aumento da imunogenicidade, aumentando a probabilidade de episódios de rejeição precoce e tardia. Com base na prática clínica quotidiana do CHBPT HCC, estudaram-­‐se 54 casos de transplante hepático, agrupados segundo grupos por alocação do enxerto respectivo: Grupo 1(n=27): dador cadáver para receptor cirrótico, Grupo 2 (n=15): dador cadáver para receptor PAF, Grupo 3 (n=12): dador PAF para receptor cirrótico. Observaram-­‐se as alterações histológicas e moleculares sobre o enxerto até ao final da operação do receptor, e as suas consequências clínicas,avaliando: -­‐ As diferentes capacidades de resistência e cada enxerto à lesão de isquémia/reperfusão. -­‐ As situações em que os factores do receptor se sobrepõem às do enxerto na definição do prognóstico, e vice versa. -­‐ A relevância das lesões histológicas e moleculares precoces no tecido hepático na evolução do enxerto e do receptor. Foram colhidas biópsias por agulha dos 54 enxertos hepáticos,42 provenientes de cadáver com coração batente(morte cerebral) e 12 provenientes de dador vivo com PAF, em três tempos diferentes do processo de colheita e transplante hepático: ­‐ A primeira(T0)antes da clampagem da aorta do dador -­‐ A segunda (T1) no final da isquémia fria -­‐ A terceira (T2) após a reperfusão do enxerto, durante o encerramento da parede abdominal. A estas amostras foi extraído RNA total, convertido em cDNA por transcrição reversa e feita a análise da expressão dos genes da CTLA4, IL-­‐1β, IL-­‐4, IL-­‐6, IL-­‐13, TNF-­‐α, Perforina, Selectina, (SELE), Fas-­‐ligando, Granzima-­‐B, Heme-­‐Oxigenase 1(HO1)e Óxido Nítrico Sintetase(iNOS2A)por PCR quantitativo segundo o método do Ct comparativo, utilizando como referência a expressão dos genes da amostra não-­‐isquémica –T0. Os fragmentos de todas as biópsias foram seccionados, para envio de amostra comparativa para processamento histológico habitual, sem qualquer alteração ao protocolo seguido habitualmente na Unidade de Transplantação do Hospital Curry Cabral. A presença de alguns parâmetros histológicos definidos, como esteatose, necrose, vacuolização, congestão sinusoidal e infiltração neutrofílica, foi registada e contabilizada numa classificação numérica. O seguimento clínico e laboratorial, bem como o acompanhamento de eventuais complicações, foi registado e correlacionado com os dados das colheitas de órgãos e com os dados das biópsias. Foram consideradas as seguintes variáveis, como as mais relevantes e objectivas para a interpretação da evolução clínica, tendo sido comparadas estatisticamente com os dados recolhidos, laboratoriais e clínicos: disfunção do enxerto, 207 pós operatórias, número de internamentos igual ou superior a 2 e rejeição crónica e/ou morte do receptor. Foram identificadas características clínicas menos favoráveis, a considerar, nalgumas circunstâncias: género feminino do receptor (sobretudo associado a enxerto masculino, p=0,077), isquémia fria superior a 500 minutos (p=0,074), isquémia quente superior a 90 minutos (p=0,099). Na análise laboratorial, distinguiram-­‐se duas características histológicas desfavoráveis e irreversíveis, como índice de mau prognóstico: a necrose e a balonização (p=0,029); no painel genético escolhido neste estudo,a expressão basal de IL-­‐1β(p=0,028), de SELE p=0,013)e de FAS-­‐L (p=0,079)relacionaram-­‐se com pior prognóstico. Algumas características protectoras intrínsecas dos enxertos só se revelaram indirectamente, como menor infiltração neutrofílica e maior expressão de HO1 e de iNOS nos enxertos PAF, não tendo sido possível provar uma interferência directa nos resultados clínicos. Não se obteve expressão mensurável de genes anti-­‐ inflamatórios nas biopsias hepáticas processadas neste estudo, como a IL13 e a I 4: assim, com a metodologia utilizada, não foi possível obter um perfil de expressão genética associado a boa evolução clínica. O perfil inverso foi sugerido apenas pela expressão basal dos 3 genes mencionados (FAS-­‐L,IL-­‐1β e SELE)no mesmo painel, com o protocolo seguido neste conjunto de 54 doentes. As características do receptor sobrepuseram-­‐se às do enxerto no caso de: -­‐ diagnóstico de PAF no receptor, que determinou uma maior predisposição para a disfunção do enxerto, o que, por sua vez, determina uma menor sobrevida. No entanto, o diagnóstico de PAF no receptor exibe uma curva de sobrevida mais favorável. -­‐ receptores com um baixo balanço de risco (BAR)definiram características favoráveis para enxertos com níveis baixos e moderados de esteatose, fazendo que esta característica, definida como um risco acrescido, não só não se manifestasse clinicamente,como parecesse um factor favorável. As características do enxerto sobrepuseram-­‐se às do receptor no caso de: -­‐ tempo de isquémia fria superior a 500 minutos -­‐ balonização, necrose, FAS-­‐L,IL-­‐1β e SELE em T0 A integração dos resultados moleculares e morfológicos com a evolução clínica, realça o papel da mobilização precoce de neutrófilos nos desempenhos menos favoráveis do enxerto hepático. -------------ABSTRACT: Orthotopic liver transplantation is na accepted therapeutic procedure for selected cases of terminal liver failure. The procedure has been improved, evidenced by the rise of survival rates from 30 to 70% at 5 years, but 13 to 27% of the liver grafts develops primary non function (PNF) or primary dysfunction (PDF) after transplantation. The consequences are devastating for the survival of the patient and of the graft. Its etiology is multifactorial, including factos related with the donor and with the recipient, ischemic times, surgical aggressions, as well as the histological characteristics of the graft. The ischemia/reperfusion lesion is still an intraoperative risk factor, with direct implications in the whole transplant outcome: there is a close interrelation between PNF and DF, graft preservation, ischemia / reperfusion lesion and graft failure. Beyond his, there is proved evidence that suggests that I/R lesion turns the allograft more vulnerable by increasing its immunogenity, increasing the probability of precocious and late rejection episodes. Based on the daily clinical practice at CHBPT /HCC, 54 cases of hepatic transplantation have been studied, grouped by allocation of each graft: Group (n=27):deceased do nortocirrhotic recipient, Group 2 (n=15): deceased donor to FAP recipient, Group 3 (n=12): FAP living donor to cirrhotic recipient. The histologic and molecular changes in the liver graft were observed until the end of the recipiente operation,together with its clinical consequences, evaluating:-­‐The different capacity of resistance of each graft to the ischemia / reperfusion lesion -­‐ The situations where the recipiente factos overlap the ones of the graft, in the definition of prognosis, and vice versa.-­‐ The relevance of the precocious histologic and molecular lesions of the hepatic tissue in the clinical outcome of the graft and the recipient. Needle biopsies were obtained from 54 liver grafts, 42 deceased brain dead donors and 12 from FAP living donors, at three diferente times of the harvesting and the hepatic transplantation: The first one (T0) before clamping the donor aorta -­‐ The second one (T2) in the end of cold ischemia time -­‐ The third one (T) after the reperfusion of the graft, during the closure of the abdominal wall. Total RNAwas extracted to these samples, converted to cDNA by reverse transcription and the analysis of gene expression was made for CTLA4,IL-­‐1β,IL-­‐4,IL-­‐6,IL-­‐13,TNF-­‐α,Perforin,E Selectin (SELE),Fas-­‐ligand,Granzyme-­‐B,Heme-­‐oxigenase 1 (HO1) and Nitric Oxide Sintetase (iNOS2A) by quantitative PCR, according with the Ct comparative method, using the expression of the non ischemic sample – T0. The fragments of all the biopsies were divided, to send a comparative sample to the usual histologic processement, keeping the same usual protocol at the Transplantation Unit of Curry Cabral Hospital. The presence of some defined histologic parameters, such as steatosis, necrosis, vacuolization, sinusoidal congestion and neutrophilic infiltration, was registered and catalogued in a numeric classification. The clinical and laboratory follow-­‐up, as well as the following of eventual complications, was registered and correlated with the data from organ procurement operations and with the data from the biopsies. The following variables were considered as the most relevant and objective ones, to the interpretation of the clinical evolution, being statistically compared with the clinical and laboratorial collected data: graft dysfunction, post-­‐operative complications, number of readmissions of 2 or more and chronic rejection and /or recipiente death. There were identified some unfavorable clinical characteristics, to be considered under certain circumstances: recipiente female gender (specially associated with malegraft, p=0,077), cold ischemia time of more than 500 minutes (p=0,074), warm ischemia time of more than 90 minutes (p=0,099). In the laboratory analysis, two histologic characteristics were identified as unfavorable and irreversible, associated with bad prognosis: necrosis and balonization (p=0,029); in the gene panel selected in this study, the basal expression of IL-­‐1β (p=0,028), SELE (p=0,013) and FAS-­‐L (p=0,079)were related with worse prognosis.Some intrinsic protective characteristics of the grafts were only indirectly revealed, such as less neutrophilic infiltration and bigger expression of HO1 and iNOS in FAP grafts, being impossible to prove any direct inte ference in the clinical results. A relevant and measurable expression of the anti inflammatory genes IL13 and IL4 was not obtained: with the used methodology, it was impossible to obtain a gene expression profile associated with a favorable clinical outcome.The inverse profile was suggested only by the basal expression of the three mentioned genes (FAS-­‐L, IL-­‐ 1β e SELE) in the same gene panel, according with the followed protocol in this group of 54 patients. The characteristics of the recipient overlapped those from the graft, in the case of :-­‐ FAP diagnosis in the recipient, which determined a bigger predisposition to graft dysfunction, which by itself determines a shorter survival. However, FAP diagnosis in the recipiente depicts a more favorable survival curve. -­‐ Recipients with a low balance risk índex (BAR) defined favorable characteristics to grafts with low and moderate grades of steatosis, making that this characteristic, associated with bad prognosis, looked like a favorable factor, and with no clinical interference. The graft characteristics overlapped those from the receptor in the case of: -­‐ Cold ischemic time more than 500 minutes -­‐ Balonization, necrosis, FAS-­‐L, IL-­‐1β and SELE at T0. The integration of molecular and morphologic results with the clinical evolution, stresses the role of a precocious neutrophils mobilization in the worse outcomes of liver grafts.

Assessment by doppler ultrasound of entheseal lesions in spondyloarthritis : a longitudial study to determine structural damage and disease activity lesions

RESUMO: Enthesitis is the hallmark of spondyloarthritis (SpA), and is observed in all subtypes. Wide information on SpA abnormalities, including synovitis, tendinitis and enthesitis, can be efficiently perceived by Doppler ultrasound. Furthermore, several studies on imaging of enthesis showed that imaging techniques are better than clinical examination to detect enthesis alterations; and vascularized enthesitis detected by Doppler ultrasound appears to be a valuable diagnostic tool to confirm SpA diagnosis. However, data published until now concerning entheseal elementary alterations that characterize SpA enthesitis (enthesis inflammatory activity) or enthesopathy (permanent structural changes) reflect rather the authors’ empiric opinion than a methodological validation process. In this sense it seems crucial to identify elementary entheseal lesions associated with activity or damage, in order to improve monitoring and treatment response in SpA patients. The development of better assessment tools is today a challenge and a need in SpA. The first study of this thesis focused on the analysis of the reliability of inter-lector and inter-ultrasonography equipment of Madrid sonography enthesitis index (MASEI). Fundamental data for the remaining unrolling project validity. In the second and third studies we concerned about two entheseal elemental lesions: erosions and bursa. In literature erosions represent a permanent structural damage, being useful for monitoring joint injury, disease activity and therapeutic response in many rheumatic diseases; and to date, this concept has been mostly applied in rheumatoid arthritis (RA). Unquestionably, erosion is a tissue-related damage and a structural change. However, the hypothesis that we decided to test was if erosions represent a permanent structural change that can only grow and worsen over time, as occurs in RA, or a transitory alteration. A longitudinal study of early SpA patients was undertaken, and the Achilles enthesis was used as a model. Our results strongly suggested that previously detected erosions could disappear during the course of the disease, being consistent with the dynamic behavior of erosion over time. Based on these striking results it seems reasonable to suggest that the new-bone formation process in SpA could be associated with the resolution of cortical entheseal erosion over time. These results could also be in agreement with the apparent failure of anti-tumor necrosis factor (TNF) therapies to control bone proliferation in SpA; and with the relation of TNF-α, Dickkopf-related protein 1 (Dkk-1) and the regulatory molecule of the Wnt signaling pathway in the bone proliferation in SpA. In the same model, we then proceeded to study the enthesis bursa. Interestingly, the Outcome Measures in Rheumatology Clinical Trials (OMERACT) enthesopathy definition does not include bursa as an elementary entheseal lesion. Nonetheless, bursa was included in 46% of the enthesis studies in a recently systematic literature review, being in agreement with the concept of “synovio-entheseal complex” that includes the link between enthesitis and osteitis in SpA. It has been clarified in recent data that there is not only a close functional integration of the enthesis with the neighboring bone, but also a connection between enthesitis and synovitis. Therefore, we tried to assess the prevalence and relevance of the bursa-synovial lesion in SpA. Our findings showed a significant increase of Achilles bursa presence and thickness in SpA patients compared to controls (healthy/mechanical controls and RA controls). These results raise awareness to the need to improve the enthesopathy ultrasonographic definition. In the final work of this thesis, we have explored new perspectives, not previously reported, about construct validity of enthesis ultrasound as a possible activity outcome in SpA. We performed a longitudinal Achilles enthesis ultrasound study in patients with early SpA. Achilles ultrasound examinations were performed at baseline, six- and twelve-month time periods and compared with clinical outcome measures collected at basal visit. Our results showed that basal erythrocyte sedimentation rate (ESR) and C-reactive protein (CRP) are higher in patients with Doppler signal in enthesis, and even that higher basal ESR, CRP and Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score (ASDAS) predicted a higher Doppler signal (an ultrasound alteration accepted as representative of inflammation) six months later. Patients with very high disease activity assessed by ASDAS (>3.5) at baseline had significantly higher Achilles total ultrasound score verified at the same time; and ASDAS <1.3 predicted no Doppler signal at six and twelve months. This seems to represent a connection between classical biomarkers and clinical outcomes associated with SpA activity and Doppler signal, not only at the same time, but also for the following months. Remarkably, patients with inactive disease (ASDAS < 1.3) at baseline had no Doppler signal at six and twelve months. These findings reinforce the potential use of ultrasound related techniques for disease progression assessment and prognosis purposes. Intriguingly, Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (BASDAI) didn’t show significant differences between different cut-offs concerning ultrasound lesions or Doppler signal, while verified with ASDAS. These results seem to indicate that ASDAS reflects better than BASDAI what happens in the enthesis. The work herein discussed clearly shows the potential utility of ultrasound in enthesis assessment in SpA patients, and can be important for the development of ultrasound activity and structural damage scores for diagnosis and monitoring purposes. Therefore, local promotion of this technique constitutes a medical intervention that is worth being tested in SpA patients for diagnosis, monitoring and prognosis purposes.

Development of 3D in vitro models for prediction of hepatic metabolism and toxicity

The development of human cell models that recapitulate hepatic functionality allows the study of metabolic pathways involved in toxicity and disease. The increased biological relevance, cost-effectiveness and high-throughput of cell models can contribute to increase the efficiency of drug development in the pharmaceutical industry. Recapitulation of liver functionality in vitro requires the development of advanced culture strategies to mimic in vivo complexity, such as 3D culture, co-cultures or biomaterials. However, complex 3D models are typically associated with poor robustness, limited scalability and compatibility with screening methods. In this work, several strategies were used to develop highly functional and reproducible spheroid-based in vitro models of human hepatocytes and HepaRG cells using stirred culture systems. In chapter 2, the isolation of human hepatocytes from resected liver tissue was implemented and a liver tissue perfusion method was optimized towards the improvement of hepatocyte isolation and aggregation efficiency, resulting in an isolation protocol compatible with 3D culture. In chapter 3, human hepatocytes were co-cultivated with mesenchymal stem cells (MSC) and the phenotype of both cell types was characterized, showing that MSC acquire a supportive stromal function and hepatocytes retain differentiated hepatic functions, stability of drug metabolism enzymes and higher viability in co-cultures. In chapter 4, a 3D alginate microencapsulation strategy for the differentiation of HepaRG cells was evaluated and compared with the standard 2D DMSO-dependent differentiation, yielding higher differentiation efficiency, comparable levels of drug metabolism activity and significantly improved biosynthetic activity. The work developed in this thesis provides novel strategies for 3D culture of human hepatic cell models, which are reproducible, scalable and compatible with screening platforms. The phenotypic and functional characterization of the in vitro systems performed contributes to the state of the art of human hepatic cell models and can be applied to the improvement of pre-clinical drug development efficiency of the process, model disease and ultimately, development of cell-based therapeutic strategies for liver failure.

Phage display as a tool for generation of bio-therapeutic agents for breast cancer

Notch is a conserved signalling pathway, which plays a crucial role in a multiple cellular processes such as stem cell self-renewal, cell division, proliferation and apoptosis. In mammalian, four Notch receptors and five ligands are described, where interaction is achieved through their extracellular domains, leading to a transcription activation of different target genes. Increased expression of Notch ligands has been detected in several types of cancer, including breast cancer suggesting that these proteins represent possible therapeutic targets. The goal of this work was to generate quality protein targets and, by phage display technology, select function-blocking antibodies specific for Notch ligands. Phage display is a powerful technique that allows the generation of highly specific antibodies to be used for therapeutics, and it has also proved to be a reliable approach in identifying and validating new cancer-related targets. Also, we aimed at solving the tri-dimensional structure of the Notch ligands alone and in complex with selected antibodies. In this work, the initial phase focused on the optimization of the expression and purification of a human Delta-like 1 ligand mutant construct (hDLL1-DE3), by refolding from E. coli inclusion bodies. To confirm the biological activity of the produced recombinant protein cellular functional studies were performed, revealing that treatment with hDLL1-DE3 protein led to a modulation of Notch target genes. In a second stage of this study, Antibody fragments (Fabs) specific for hDLL1-DE3 were generated by phage display, using the produced protein as target, in which one good Fab candidate was selected to determine the best expression conditions. In parallel, multiple crystallization conditions were tested with hDLL1-DE3, but so far none led to positive results.

Corporate governance failure at PT

The following case study depicts the bitter transfiguration of Portugal Telecom, SGPS (PT), a multinational telecommunications company that was once an honourable flag of innovation, corporate governance standards in Portugal and overseas. It scrutinises the controversial episodes that paved the way for the pitiful condition in which PT is nowadays: a company that carries the weight of a ruinous €897 million investment in a defaulted company and no more than a 25.6% stake in a heavily indebted Brazilian carrier. The free-fall is made, ironically, of a complete disregard for best corporate governance practices, allowing for PT’s major shareholders to take over the helm of the company, using it selfishly as a cash cow.