Fast-to-fed shift in glucose homeostasis: clues to an earlier detection of human prediabetic states

FCM: UC Bioquímica I - PhD Thesis

Caracterização da função do monóxido de azoto e glutationo hepáticos na sensabilidade periférica à insulina

xi RESUMO A acção da insulina no músculo esquelético depende de um reflexo parassimpático hepático que conduz à libertação de uma substância hepática sensibilizadora da insulina, designada por HISS, responsável por cerca de 55% do efeito hipoglicemiante da insulina. A acção da HISS é finamente regulada pelo monóxido de azoto (NO) hepático e pelo estado prandial, aumentando no período pós-prandial imediato e diminuindo progressivamente com as horas de jejum. A secreção da HISS pode ser inibida cirúrgica ou farmacologicamente, quer por desnervação selectiva do plexo anterior hepático, quer por administração de atropina, quer por inibição do sintase do NO (NOS) hepático. O objectivo geral do trabalho apresentado nesta dissertação foi a caracterização da via de transdução de sinal que conduz à libertação da HISS. O modelo utilizado neste estudo foi o rato Wistar. A sensibilidade à insulina foi avaliada através do teste rápido de sensibilidade à insulina (RIST). A primeira hipótese de trabalho testada foi que a sequência de eventos que conduzem à secreção da HISS inicia-se com a activação do sistema parassimpático hepático seguida de activação do NOS hepático com subsequente produção de NO e activação do guanilato ciclase (GC). Observou-se que a administração de um dador de NO reverteu a resistência à insulina induzida, quer por inibição do NOS hepático, quer por antagonismo dos receptores muscarínicos com atropina. Em contraste, a resistência à insulina produzida por inibição do NOS hepático não foi revertida por administração intraportal de acetilcolina (ACh). Constatou-se que a inibição do GC hepático diminuiu a sensibilidade à insulina. Estes resultados sugerem que: a ACh libertada no fígado induz a síntese de NO hepático que conduz à libertação da HISS, que por sua vez é modulada pelo GC hepático. A libertação da HISS em resposta à insulina é regulada pelo estado prandial. Uma vez que os níveis hepáticos de glutationo (GSH) se encontram, tal como a HISS, diminuídos no estado de jejum e aumentados após a ingestão de uma refeição, testou-se a hipótese de que o GSH hepático está envolvido na secreção da HISS. Observou-se que a depleção do GSH hepático induziu resistência à insulina, comparável à obtida após inibição do NOS hepático. Estes resultados suportam a hipótese de que o GSH hepático desempenha um papel crítico na acção periférica da insulina. Considerando que, no estado de jejum, tanto os níveis de GSH hepático como os níveis de NO hepático são baixos, testou-se a hipótese de que a co-administração intraportal de um dador de GSH e de um dador de NO promove um aumento da sensibilidade à insulina no estado de jejum, devido ao restabelecimento do mecanismo da HISS. Observou-se que a administração sequencial de dadores de GSH e de NO no fígado provocou um aumento na sensibilidade à insulina, dependente da dose de dador de GSH administrada. Concluiu-se portanto que ambos, GSH e NO, são essenciais para que o mecanismo da HISS esteja completamente funcional. O GSH e o NO reagem para formar um S-nitrosotiol, o S-nitrosoglutationo (GSNO). Os resultados supra-mencionados conduziram à formulação da hipótese de que a secreção/acção da HISS depende da formação de GSNO. Observou-se que a administração intravenosa de S-nitrosotióis (RSNOs) aumentou a sensibilidade à insulina, em animais submetidos a um período de jejum, ao contrário da administração intraportal destes fármacos, o que RSNOs têm uma acção periférica, mas não hepática, na sensibilidade à insulina. Os resultados obtidos conduziram à reformulação da hipótese da HISS, sugerindo que a ingestão de uma refeição activa os nervos parassimpáticos hepáticos levando à libertação de ACh no fígado que, por sua vez activa o NOS. Simultaneamente, ocorre um aumento dos níveis de GSH hepático que reage com o NO hepático para formar um composto nitrosado, o GSNO. Este composto mimetiza a acção hipoglicemiante da HISS no músculo esquelético. SUMMARY Insulin action at the skeletal muscle depends on a hepatic parasympathetic reflex that promotes the release of a hepatic insulin sensitizing substance (HISS) from the liver, which contributes 55% to total insulin action. HISS action is modulated by hepatic nitric oxide (NO) and also by the prandial status so as to, in the immediate ostprandial state, HISS action is maximal, decreasing with the duration of fasting. HISS secretion may be inhibited by interruption of the hepatic parasympathetic reflex, achieved either by surgical denervation of the liver or by cholinergic blockade with atropine, or by prevention of hepatic NO release, using NO synthase (NOS) antagonists. The main objective of this work was to characterize the signal transduction pathways that lead to HISS secretion by the liver. Wistar rats were used and insulin sensitivity was evaluated using the rapid insulin sensitivity test (RIST). The first hypothesis tested was that the sequence of events that lead to HISS secretion starts with an increase in the hepatic parasympathetic tone, followed by the activation of hepatic NOS and subsequent triggering of guanylate cyclase (GC). We observed that insulin resistance produced either by muscarinic receptor antagonism with atropine or by hepatic NOS inhibition was reversed by the intraportal administration of an NO donor. In contrast, intraportal acetylcholine (ACh) did not restore insulin sensitivity after NOS inhibition. We also observed that GC inhibition lead to a decrease in insulin sensitivity.These results suggest that the release of ACh in the liver activates hepatic NO synthesis in order to allow HISS secretion, through a signaling pathway modulated by GC. HISS release in response to insulin is controlled by the prandial status. The second hypothesis tested was that glutathione (GSH) is involved in HISS secretion since the hepatic levels of GSH are, like HISS action, decreased in the fasted state and increased after ingestion of a meal. We observed that hepatic GSH depletion led to insulin resistance of the same magnitude of that observed after inhibition of hepatic NOS. These results support the hypothesis that hepatic GSH is crucial in peripheral insulin action. Since, in the fasted state, both hepatic GSH and NO levels are low, we tested the hypothesis that intraportal o-administration of a GSH donor and an NO donor enhances insulin sensitivity in fasted Wistar rats, by restoring HISS secretion. We observed that GSH and NO increased insulin sensitivity in a GSH dose-dependent manner. We concluded that HISS secretion requires elevated levels of both GSH and NO in the liver. GSH and NO react to form a S-nitrosothiol, S-nitrosoglutathione (GSNO). The last hypothesis tested in this work was that HISS secretion/ action depends on the formation of GSNO. We observed that intravenous administration of -nitrosothiols (RSNOs) increased insulin sensitivity in animals fasted for 24 h, in contrast with the intraportal administration of the drug. This result suggests that RSNOs enhanced insulin sensitivity through a peripheral, and not hepatic, mechanism. The results obtained led to a restructuring of the HISS hypothesis, suggesting that the ingestion of a meal triggers the hepatic parasympathetic nerves, leading to the release of Ach in the liver, which in turn activates NOS. Simultaneously, hepatic GSH levels increase and react with NO to form a nitrosated compound, GSNO. S-nitrosoglutathione mimics HISS hypoglycaemic action at the skeletal muscle.

Infecção por Treponema pallidum: análise serológica e pesquisa de DNA

RESUMO: A sífilis é uma infecção causada por T. pallidum que pode ser transmitida por via vertical, por contacto sexual ou por sangue, e cujo diagnóstico se baseia na associação entre manifestações clinicas e testes serológicos. Neste estudo utilizaram-se os testes serológicos RPR, TPHA, FTA-Abs, um teste rápido não comercializado (Signal-Spirolipin) que pesquisa anticorpos treponémicos (CDC-T) e não treponémicos (CDC-2) em simultâneo no mesmo dispositivo e uma técnica de PCR-multiplex para a pesquisa de ADN de T. pallidum. Da comparação das técnicas serológicas constatou-se que a sensibilidade dos testes RPR e TPHA foi de 84,5% e 98% respectivamente. A especificidade foi de 77,3% para o teste RPR e de 87,5% para o teste TPHA. Na avaliação do teste rápido a comparação do teste CDC-2 com o teste RPR resultou numa taxa de concordância de 93,1% enquanto que, a do teste CDC-T com o teste TPHA foi de 94,8%. A sensibilidade e especificidade obtidas pelos testes CDC-2 e CDC-T foram de 88,7% e 65% e de 94,9% e 91,3% respectivamente. Considerando o diagnóstico de sífilis activa com base na reactividade simultânea dos testes RPR e TPHA, avaliou-se a sensibilidade do teste rápido utilizando esse mesmo critério. A sensibilidade obtida foi de 98,4% para o teste rápido e de 97,2% para a associação dos testes RPR/TPHA. A técnica de PCR-multiplex apresentou fraca sensibilidade já que em apenas 33% dos casos de sífilis foi identificado ADN de T. pallidum. O teste rápido avaliado apresentou um comportamento idêntico aos testes geralmente utilizados na rotina laboratorial tais como os utilizados neste estudo. Apresenta a vantagem de pesquisar anticorpos treponémicos e não treponémicos, ao contrário dos testes rápidos comercializados que pesquisam apenas anticorpos treponémicos. Não sendo necessário para a sua execução equipamento laboratorial especializado poderá ser de grande utilidade para o clinico a exercer em locais sem laboratório.------------- ABSTRACT: Syphilis is an infection caused by T. pallidum. Transmission may be vertical, through sexual contact or blood. The diagnosis is based in both serology and clinical manifestations. In this study, we used the serological tests RPR, TPHA, FTA-Abs and a non -commercialized rapid test (Signal-Spirolipin) to detect both treponemal (CDC-T) and non – treponemal antibodies (CDC-2) in the same device. T. pallidum DNA was identified with a multiplex PCR technique. In this study, the RPR and TPHA tests sensitivity was 84,5% and 98%, respectively, and the specificity 77,3% for the RPR test and 87,5% for TPHA test, respectively. The concordance rate was 93,1% in the comparison between the RPR and the CDC2 tests and 94,8% between the CDC-T with the TPHA tests. Sensitivity and specificity of the CDC-2 and CDC-T tests were 88,7% and 65% and 94,9% e 91,3%, respectively. Taking into account that the diagnosis of active syphilis is made when both the RPR and TPHA tests are reactive, we evaluated the sensitivity of the rapid test (CDC2 and CDCT) in the diagnosis of active syphilis, using the above described criteria. The sensitivity was 98,4 % for the rapid test and 97,2 % for the association of reactivity in both RPA and TPHA tests. The multiplex PCR technique presented a low sensitivity, with T. pallidum DNA being identified in only 33% of the syphilis cases. The rapid test evaluated in this study presented identical results to the tests generally used in the routine laboratory diagnosis, such as those used here. However, it does have the advantage of detecting both treponemal and non – treponemal antibodies what is not the case of the commercialized rapid test. Furthermore, there is no need of specialized laboratory equipment, which makes it of great utility in regions where such conditions do not exist, as in developing countries.

Epidemiologia da infeção por rotavírus em Huambo, Angola: prevalência da infeção e dos genótipos circulantes

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Médica

Estudo da Prevalência da Malária na Mulher Grávida Submetida ao Tratamento Intermitente e Preventivo com Sulfadoxina e Pirimetamina e sua Associação com Anemia

A malária é causada por parasitas de género Plasmodium e transmitida por mosquitos fêmea do género Anopheles. A doença é endémica em regiões tropicais e intertropicais e constituí uma das maiores causas de morbilidade e mortalidade principalmente no continente Africano. Segundo os dados da OMS ocorrem anualmente 300 a 500 milhões de casos clínicos e um milhão de mortes. Durante a gravidez, a malária é frequente e mais grave, com maior incidência nos países da África subsaariana. As mulheres grávidas têm maior risco de contrair a doença e muitas vezes em formas mais graves com associação à anemia. O objectivo deste estudo foi caracterizar a ocorrência dos casos de malária em mulheres grávidas submetidas ao tratamento intermitente preventivo (TIP) com a Sulfadoxina/ Pirimetamina (SP) nas Províncias de Benguela e Huíla. Neste estudo constatamos que todas as grávidas que participaram tinham tido episódios de malária antes da gravidez quer na província de Benguela tal como na província da Huíla. No total, 633 mulheres grávidas foram analisadas e apresentavam um valor de hemoglobina abaixo dos 14g/dl. A prevalência de malária em grávidas sujeitas a TIP foi significativamente menor (p< 0.01) do que nas grávidas que não a fizeram, respectivamente 4,5% e 10,0%, conforme esperado e descrito anteriormente por outros autores. Todos os casos de malária detectados corresponderam a Plasmodium falciparum, não se tendo verificado nenhuma infecção mista, de acordo com os métodos utilizados. O valor médio da hemoglobina nas grávidas foi inferior ao esperado em grávidas seguidas em consulta pré-natal, e existe uma diferença significativa entre os valores encontrados na Província de Benguela e da Huíla (significativamente mais elevados nesta última). O teste rápido Paracheck-pf detectou a presença de Plasmodium falciparum em maior número do que a microscopia óptica. Por constrangimentos logísticos, o número de amostras submetidas a teste molecular (PCR) não foi suficiente para se tirarem conclusões.

Desenvolvimento de um teste de diagnóstico rápido para a deteção de malária em amostras clínicas

A malária é uma doença infeciosa transmitida através da picada de um mosquito fêmea Anopheles infetado com o parasita protozoário do género Plasmodium (P.), sendo o P. falciparum a espécie mais mortal. É responsável pela morte de milhares de pessoas por ano, nomeadamente nos países em vias desenvolvimento, países esses que não detêm as condições necessárias para a prática da microscopia ótica em larga escala, que continua nos dias de hoje a ser a técnica de eleição para o diagnóstico da doença. A conceção de testes de baixo custo e de fácil utilização tais como os testes de diagnóstico rápido (TDR) são uma mais-valia no diagnóstico deste tipo de doenças. A presente dissertação centra-se no desenvolvimento de um TDR num formato competitivo, baseado em nanopartículas de ouro (AuNP) funcionalizadas com ácido mercaptoundecanoico (MUA) ou com o pentapétido Cys-Ala-Leu-Asn-Asn (CALNN) e conjugadas com um anticorpo monoclonal anti-PfHRP2 que reconhece especificamente a proteína rica em histidina 2 produzida pelo P. falciparum (PfHRP2). Para isso, utilizou-se uma tecnologia inovadora na conceção do TDR, a tecnologia lab on paper, que utiliza o papel Whatman nº1. Os estudos de estabilidade de AuNP funcionalizadas com citrato de sódio, MUA ou CALNN por variação da força iónica e pH do meio mostraram que o pentapéptido CALNN é o agente de revestimento mais resistente a oscilações de força iónica, comparativamente com o citrato de sódio e o MUA e que apenas as AuNP revestidas com citrato de sódio atingiram o ponto de agregação ao pKa da molécula de revestimento. Os principais resultados obtidos aquando do desenvolvimento do TDR revelaram que o valor de diluição ótima de anticorpo anti-IgG (solução mãe a 11 mg.mL-1) imobilizado na linha de controlo é de 1:40 e 1:90, utilizando para deteção os bionanoconjugados AuNP-MUA-Anticorpo e AuNP-CALNN-Anticorpo, respetivamente. Com a aplicação da solução AuNP-CALNN-Anticorpo visualizou-se o aparecimento de cor vermelha na linha de teste, o que demonstra a deteção do antigénio pelos bionanoconjugados. A deteção ocorreu com a aplicação de 2,5 μL de PfHRP2 a 1,5 mg.mL-1. Numa análise global após a aplicação de culturas de sangue não infetadas ou infetadas com o parasita da malária, obteve-se cor na linha de controlo com uma diluição de 1:20 do anticorpo anti-IgG imobilizado. Em relação à linha de teste, na presença de culturas não infetadas, obteve-se sinal na mesma aplicando bionanoconjugados AuNP-MUA-Anticorpo e 2,5 μL de PfHRP2 a 2,6 mg.ml-1.

Avaliação da estabilidade do composto pelo teste do auto-aquecimento

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, Perfil Engenharia Sanitária

Teste de provocação brônquica com metacolina em crianças asmáticas: standardização do método com um dosímetro

Arquivos da Sociedade Portuguesa de Patologia Respiratória. 1988 V-2:p.7-15

Desenvolvimento, construção e teste de um interruptor térmico para baixas temperaturas

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Física

Implementação e teste de métodos de segmentação de lesões em imagens de mamografia digital

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica

Efeitos imediatos da técnica de desrotação do atlas de Rocabado e do SNAG C1/2 de Mulligan na amplitude do teste de flexão-rotação em indíviduos com cefaleia cervicogénica : um ensaio clínico aleatório

RESUMO: A cefaleia cervicogénica é uma forma comum de dor de cabeça, que tem sido associada à existência de uma disfunção das estruturas da coluna cervical superior. Estudos recentes mostram uma grande incidência dessa disfunção a nível de C1-C2, avaliada pelo teste de flexão-rotação. Vários terapeutas manuais, como Brian Mulligan e Mariano Rocabado, têm sido sugerido técnicas de tratamento para este tipo de disfunção. Contudo, a evidência acerca da efectividade dessas técnicas é escassa. Desenho do estudo: Foi efectuado um ensaio clínico aleatório, duplamente cego, composto por três fases: pré-intervenção, intervenção e pós-intervenção. Objectivos: Avaliar e comparar os efeitos imediatos de duas técnicas de Terapia Manual Ortopédica (SNAG C1/2 de Mulligan e técnica de desrotação do atlas de Rocabado), na amplitude de movimento de rotação do segmento vertebral C1-C2, em indivíduos com história de cefaleia cervicogénica e com limitação no teste de flexão-rotação. As técnicas de tratamento foram usadas de forma isolada, em comparação a um grupo placebo. Métodos: Uma amostra de 60 indivíduos, com cefaleia cervicogénica e limitação do teste de flexão-rotação, foram aleatoriamente distribuídos por três grupos: SNAG C1/2 de Mulligan, técnica de desrotação do atlas de Rocabado e grupo placebo. O outcome primário foi a amplitude de movimento obtida no teste de flexão-rotação, que foi medido antes e imediatamente após a intervenção. Resultados: Imediatamente após a intervenção, a amplitude verificada no teste de flexão-rotação aumentou 21.8º (DP, 4.68) no grupo submetido ao SNAG C1/2 de Mulligan, 15º (DP, 5.07) no grupo em que foi aplicada a técnica de desrotação do atlas de Rocabado e 0.65º (DP, 0.67) no grupo placebo. Uma ANOVA modelo misto, 2 por 3, revelou efeito principal significativo do tempo (p<.001) e grupo (p<.001), assim como uma interacção significativa entre grupo e tempo (p<.001), relativamente à variável amplitude do teste de flexão-rotação. Estes resultados indicam que as diferenças verificadas entre os grupos eram dependentes do momento de avaliação. Uma comparação múltipla post hoc revelou que quer as técnicas de Mulligan, quer de Rocabado, produziram efeitos significativamente maiores que a intervenção placebo na amplitude de movimento do teste de flexão-rotação (p<.001 e p=.001, respectivamente). No entanto,não se verificou uma diferença significativa no que diz respeito à efectividade de ambas as técnicas de Terapia Manual Ortopédica aplicadas (p=.42). Conclusão: Esta investigação sugere que as duas técnicas de Terapia Manual Ortopédica avaliadas produziram efeito clínica e estatisticamente significativo na amplitude do teste de flexão-rotação. No entanto, não se verificaram diferenças entre as duas técnicas, no que diz respeito ao seu efeito no ganho de amplitude de movimento. Os resultados obtidos fornecem evidência preliminar sobre a efectividade de ambas as intervenções no tratamento da redução de amplitude de movimento em indivíduos com história de cefaleia cervicogénica.-------------------------------ABSTRACT:Background: Cervicogenic headache is a common form of headache arising from dysfunction in structures of the upper cervical spine. Recent studies have shown a high incidence of C1/2 dysfunction, evaluated by the flexion-rotation test (FRT). Several manual therapists have suggested different approaches to manage that dysfunction, such as Brian Mulligan and Mariano Rocabado. However, the evidence of the effectiveness of those manual techniques is anedoctal. Design: Randomized double blinded controlled trial with three phases: pre-intervention, intervention and post-intervention. Objectives: To determine and compare the immediate effects of two manual therapy techniques (Mulligan’s SNAG C1/2 and Rocabado’s atlas’ derotation technique) in the range of motion of C1-C2 vertebral segments, in cervicogenic headache patients and with limitation on the flexion-rotatoin test. The treatment techniques were used as single treatments against a placebo group. Methods: A sample of 60 subjects with cervicogenic headache and FRT limitation were randomly allocated into one of three groups: Mulligan’s C1/2 SNAG, Rocabado’s atlas derotation technique or placebo group. The primary outcome was the flexion rotation test range, which was measured before and immediately after the intervention. Results: Immediately after the application of the interventions, FRT range increased by 21.8º (SD, 4.68) for the Mulligan’s C1-2 SNAG group, 15º (SD, 5.07) for the Rocabado’s atlas derotation technique and 0.65º (SD, 0.67) for the placebo group. A 2-by-3 mixedmodel ANOVA a significant main effect of time (p<.001) and group (p<.001), as well as a significant interaction between group and time (p<.001) for the variable FRT range. These results indicate that group differences were dependent on time. A pairwise post hoc comparison revelad that both the Mulligan and Rocabado techniques produced significantly more effect on FRT range of motion than the placebo intervention (p<.001 and p=.001, respectively). However, there was not a significant difference between the effectiveness of the two manual therapy techniques (p=.42).Conclusion: This investigation’s findings suggest that both Mulligan’s C1/2 SNAG and Rocabado’s atlas derotation techniques produced a clinically and statistically significant effect on FRT range, but there were no changes between the two techniques in their effectiveness. These results provide preliminary evidence for the efficacy of both manual therapy techniques in the management of individuals with cervicogenic headache and FRT limitation.

Detecção remota em meio urbano: teste com classificadores supervisionados a nível do pixel sobre imagens de alta resolução espacial aplicados numa lógica hierárquica de classes

Dissertação de Mestrado em Gestão do Território, Área de Especialização em Detecção Remota e Sistemas de Informação Geográfica

SleepLab V.2.0: plataforma integrada de teste de algoritmos para classificação não supervisionada do sono

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

O teste de esfericidade por blocos de matrizes para uma amostra

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Matemática e Aplicações

Introdução ao problema do teste - da relação na tecnologia a partir das noções de teste e transdução

Dissertação apresentada para o cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Cultura Contemporânea e Novas Tecnologias.