Novel antibiotic-loaded orthopaedic bone cements: insights on drug release profiles and biocompatibility

Acrylic bone cement (BC) is widely used as an anchor of artificial joints. Bacterial infection due to biofilm formation and inflammation are common and difficult to treat problems associated with commercial available BC formulations. Research on novel BC compositions is urgently needed. The main objective of this thesis was to develop a new biocompatible antibiotic-loaded BC with improved release profile. To achieve that aim several additives were incorporated, as an antibiotic (levofloxacin) to combat bacterial growth, an anti-inflammatory drug (diclofenac) to decrease the inflammatory process and two well-known and broadly used biopolymers, alginate and chitosan in order to increase matrix porosity, and in this way to intensify the amount of released drug. Novel BC formulations were tested in order to find the most suitable one that had potential to proceed to clinical application. Numerous tests were conducted as: a) evaluation of drug release profiles in different biomimetic media, b) mechanical and surface studies, c) microbiological activity testing against Staphylococcus aureus and d) in vitro biocompatibility assays (fibroblasts and osteoblasts). In general, the addition of biopolymers increased drug release, didn’t compromised BC mechanical properties and increased BC hydrophilicity. Microbiological testing revealed that Lev[BC]Chi was the only matrix that reduced significantly biofilm formation. On the contrary, alginate and diclofenac loading into BC seemed to increase biofilm growth. Biocompatibility studies showed some decrease in cell viability, in particularly on osteoblasts, mainly due to the high amounts of released drugs. In conclusion, the present work has shown that the matrix with more potential to proceed in further investigations was Lev[BC]Chi. Other conditions (namely additives and drugs concentrations) should be evaluated with the other tested BC matrices before being discharged.

Hydroxyapatite porous structures for bone tissue engineering

Esta dissertação teve como objetivo o desenvolvimento de espumas porosas de hidroxiapatite (HA) baseadas em réplicas invertidas de cristais coloidais (ICC) para substituição óssea. Um ICC é uma estrutura tridimensional de elevada porosidade que apresenta uma rede interconectada de poros com elevada uniformidade de tamanhos. Este tipo de arquitetura possibilita uma proliferação celular homogénea e superiores propriedades mecânicas quando comparada com espumas de geometria não uniforme. O cristal coloidal (CC) - o molde da espuma - foi criado por empacotamento de microesferas de poliestireno (270 μm) produzidas por microfluídica e posterior tratamento térmico. O molde foi impregnado com um gel de hidroxiapatite produzido via sol-gel utilizando pentóxido de fósforo e nitrato de cálcio tetrahidratado como percursores de fósforo e cálcio, respectivamente. A espuma cerâmica foi obtida num único passo depois de um tratamento térmico a 1100oC que permitiu a solidificação do gel e a remoção do CC. A análise por espetroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e difração de raios-X (XRD) revelou uma hidroxiapatite carbonatada tipo A com presença de fosfatos tricálcicos. As propriedades mecânicas foram avaliadas por testes de compressão. A biocompatibilidade in vitro foi demonstrada através de testes de adesão e proliferação celular de osteoblastos.

The influence of menopausal status on bone turnover and disease control in breast cancer patients with metastatic bone disease treated with chemotherapy plus zoledronic acid : an exploratory retrospective cohort study

RESUMO: Introdução: Uma meta-análise recente demonstrou que uso adjuvante de ácido zoledrónico (AZ) em mulheres pós-menopáusicas com cancro da mama precoce (CM) conduz a redução do risco de morte por CM em 17%. Investigámos o efeito do estado hormonal (pré [PrM] vs pós-menopausa tardia [PoM]) na remodelação óssea e controlo de doença em mulheres com CM e metástases ósseas (MO) tratadas com AZ e quimioterapia (QT). Métodos: Neste estudo de coorte retrospetivo, colhemos variáveis clinico-patológicas e quantificámos o telopéptido N-terminal (NTX) urinário e marcadores tumorais (MT) séricos em mulheres com CM e MO tratadas com QT e AZ. As doentes foram divididas em PrM (<45 anos) e PoM (>60 anos). Endpoints do estudo: variação do NTX, CA15.3 e CEA nos meses 3, 6 e 9, tempo até falência de QT de primeira-linha e sobrevivência. Quando apropriado foram usados os testes de Wilcoxon rank-sum, modelo de efeitos lineares mistos, teste log-rank e modelo de Cox. Resultados: Quarenta doentes foram elegíveis para análise (8 PrM e 32 PoM). Depois da introdução de AZ e QT, os níveis de NTX e MT caíram no coorte global. O perfil de resposta não diferiu entre grupos no mês 3 ou em tempos posteriores (valor-p para interação tempo-estado hormonal no mês 3=0.957). Ademais, o perfil de resposta dos MT também não diferiu entre grupos. O tempo mediano até falência de primeira-linha de QT em PrM e PoM foi de 15.2 e 17.4 meses, respetivamente. Não foi identificada diferença significativa entre grupos, quer em análise univariada quer após controlo para envolvimento visceral (p=0.399 e 0.469, respetivamente). Igualmente, não houve diferenças em termos de sobrevivência. Conclusões: Neste coorte, não foram identificadas diferenças no controlo de NTX ou MT em função do estado menopausico. Igualmente, não foi identificada diferença no tempo até falência de primeira-linha de CT ou sobrevivência.----------- ABSTRACT: Background: A recent meta-analysis showed that the adjuvant use of zoledronic acid (ZA) in postmenopausal women with early breast cancer (BC) leads to a reduction in the risk of breast cancer death by 17%. We investigated the effect of the hormonal status (pre [PrM] vs late post menopause [PoM]) on bone turnover and disease control among women with BC and boné metastases (BM) treated with ZA and chemotherapy (CT). Methods: In this retrospective cohort study, we collected clinicopathologic variables, urinary Nterminal telopeptide (NTX) and serum tumor marker levels from women with BC and BM treated with CT and ZA. Patients were divided in PrM (<45 years) and PoM (>60 years). Study endpoints were NTX, CA15.3 and CEA variation at 3, 6 and 9 months, and time to first-line CT failure and survival. We performed multilevel mixed-effects linear regression models to assess the variation of repeated measures and cox regression models for time to event outcomes. Results: Forty patients were eligible for analysis (8 PrM and 32 PoM). After introduction of ZA and CT, NTX and tumor markers declined in the overall cohort. Response profile was similar between menopausal groups at month 3 and at later time points (p-value for time-hormonal status interaction at month 3=0.957). Furthermore, tumor markers response profile was also equal between groups. Median time to first-line CT failure in PrM and PoM women was 15.2 and 17.4 months, respectively. No significant difference between groups was found, either using a univariate analysis or after controlling for visceral disease involvement (p=0.399 and 0.469, respectively). Likewise, no differences in survival were found. Conclusions: In this cohort, no differences were found in terms of NTX or tumor markers control according to menopausal status. Similarly, no difference in time to first-line CT failure or survival was found.

Osteoclastogenesis, inflammatory cytokines and biomarkers of bone metabolism in psoriatic arthritis

RESUMO:A artrite psoriática (AP) é uma doença inflamatória crónica caracterizada por várias manifestações nas articulações, nas enteses e na pele. A formação de novo osso após inflamação nas enteses é um dos aspetos mais intrigantes desta doença. Os mecanismos celulares e moleculares deste processo ainda não são completamente conhecidos. Este estudo tem como objetivo compreender melhor os mecanismos subjacentes à formação e reabsorção óssea, bem como o efeito de anti-inflamatórios não esteroides (AINEs) nestes processos. Para atingir este objetivo foram quantificados biomarcadores do metabolismo ósseo e citocinas inflamatórias em doentes AP, antes e após terapêutica com AINEs. Os biomarcadores selecionados foram marcadores de remodelação óssea como CTX-I e P1NP, fatores de diferenciação e ativação de osteoclastos como o RANKL e a OPG, inibidores da via de sinalização Wnt, nomeadamente o DKK-1 e a SOST e ainda citocinas pro-inflamatórias como a IL-22 e a IL-23 e a prostaglandina PGE2. Neste contexto foram também estabelecidas culturas celulares de monócitos, isoladas de doentes AP e de controlos saudáveis. Os monócitos foram cultivados in vitro em condições não estimuladas e estimuladas e realizados dois ensaios funcionais: coloração com TRAP e ensaio de reabsorção. Foi observada uma diminuição nos níveis séricos de CTX-I e OPG em doentes AP em relação aos controlos. De igual forma os níveis séricos de SOST encontram-se significativamente mais baixos, em comparação com os controlos saudáveis. Estes valores de SOST são semelhantes aos dos doentes com espondilite anquilosante (EA), documentados anteriormente. Os ensaios com osteoclastos confirmaram a necessidade da presença de RANKL para estimulação da osteoclastogénese e que o celecoxib parece ter um papel inibitório neste processo. Os resultados obtidos sugerem que a população de doentes com AP analisados têm baixos níveis de reabsorção óssea e alguma atividade na formação óssea. --------------------------- ABSTRACT: Psoriatic arthritis (PsA) is a chronic inflammatory disease characterized by several manifestations involving the joints, enthesis and the skin. New bone formation after inflammation at enthesis site has been one of the most intriguing aspects of the disease. Cellular and molecular mechanisms in this process are still not completely understood. This study aims to understand better the mechanisms underlying bone formation and resorption and the effect of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in these processes. To access that, biomarkers of bone metabolism and inflammatory cytokines were measured in PsA patients’ serum before and after NSAID therapy. These selected biomarkers were bone turnover markers such as CTX-I and P1NP, osteoclast differentiation and activation factors RANKL and OPG, Wnt pathway inhibitors DKK-1 and SOST and pro-inflammatory cytokines IL-22, IL-23 and prostaglandin PGE2. In this context monocyte cell culture was also established after PBMC isolation from PsA patients and healthy controls. Monocytes were cultured in vitro under unstimulated and stimulated conditions and two functional assays were performed: TRAP staining and resorption pit assay. It was demonstrated that CTX-I and OPG serum levels in PsA patients were lower than controls. SOST levels were extremely decreased in comparison with controls, resembling the ankylosing spondylitis patients results already documented. Osteoclast assays confirmed the need of RANKL in stimulating osteoclastogenesis and that celecoxib seems to have an inhibitor role in this process. The results obtained suggest that PsA patient population analyzed in this study have low bone resorption levels and some bone formation activity.

Developmental and paleontological insights into skull bone homology and evolution

The Gallus gallus (chicken) embryo is a central model organism in evolutionary developmental biology. Its anatomy and developmental genetics have been extensively studied and many relevant evolutionary implications have been made so far. However, important questions regarding the developmental origin of the chicken skull bones are still unresolved such that no solid homology can be established across organisms. This precludes evolutionary comparisons between this and other avian model systems in which skull anatomy has evolved significantly over the last millions of years.(...)