Studies on resistance and response to vancomycin in Enterococcus faecalis: a last resort antibiotic

Dissertation presented to obtain a Ph.D. degree in Biochemistry by Instituto de Tecnologia Química e Biológica Universidade Nova de Lisboa.

Role of ß-lactamase operon on mecA expression in Staphylococcus aureus

RESUMO: Os Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA, do inglês “methicillin-resistant Staphylococcus aureus”) são um dos principais agentes responsáveis por infeções hospitalares. Os MRSA são resistentes a praticamente todos os antibióticos β-lactâmicos devido a dois mecanismos principais: produção de β-lactamase (bla), codificada pelo gene blaZ, e produção de uma proteína de ligação à penicilina (PBP2a, do inglês “penicillin binding protein 2”), codificada pelo gene mecA. Estes dois genes são regulados por sistemas homólogos, constituídos por um sensor-transdutor (BlaR1 e MecR1) e um repressor (BlaI e MecI), de tal modo que ambos os sistemas são capazes de co-regular os genes mecA e blaZ, embora com eficiências de indução muito diferentes. De facto, a indução mediada pelo sistema mecI-mecR1 é tão lenta que se acredita que este sistema não está funcional na maioria das estirpes MRSA. No entanto, dados recentes do nosso laboratório, demonstram a ausência de relação entre a presença do gene mecI e o nível de resistência à meticilina em estirpes MRSA epidémicas, e também que, o fenótipo de resistência da grande maioria das estirpes não é perturbado pela sobre-expressão em trans do repressor mecI. Curiosamente, as duas estirpes em que a expressão da resistência foi afetada pela sobre-expressão do mecI são negativas para o locus da β-lactamase, o que sugere que este locus pode interferir diretamente com a repressão do gene mecA mediada pelo MecI. Nesta tese de mestrado esta hipótese foi explorada usando estratégias de biologia molecular e ensaios fenotípicos da resistência aos -lactâmicos. Os resultados obtidos demonstram que a presença do plasmídeo nativo da β-lactamase não só anula a repressão mediada pelo MecI, como também aumenta o nível de resistência das estirpes parentais. Várias hipóteses foram então formuladas para explicar estas observações. Dados preliminares, em conjunto com evidências experimentais publicadas, sugerem que o BlaI forma hetero-dímeros com o MecI que, após a indução, são inativados eficientemente pelo BlaR1. Em conclusão, estes resultados apresentam novas perspetivas para o mecanismo de regulação do mecA e para uma nova importante função do operão da β-lactamase para o fenótipo das estirpes MRSA.-------------------ABSTRACT: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is an important nosocomial pathogen and is also emerging in the community. MRSA is cross-resistant to virtually all β-lactam antibiotics and has acquired two main resistance mechanisms: production of β-lactamase (bla), coded by blaZ, and production of penicillin binding protein 2a (PBP2a), coded by mecA. Both genes are regulated by homologous sensor-transducers (BlaR1 and MecR1) and repressors (BlaI and MecI), and coregulation of mecA and blaZ by both systems has been demonstrated, although with remarkable different efficiencies. In fact, induction of mecA by mecI-mecR1 is so slow that it is believed it is not functional in most MRSA strains. However, recent data from our laboratory has unexpectedly demonstrated that not only there is no correlation between the presence of mecI gene and the resistance level in epidemic MRSA strains, but also that for most strains there were no significant changes on the resistance phenotype upon the mecI overexpression in trans. Interestingly, the two strains in which mecI overexpression affected the resistance expression were negative for the bla locus, suggesting that this locus may interfere directly with the MecI-mediated repression of mecA and account for those puzzling observations. In this master thesis we have explored this hypothesis using molecular biology strategies and phenotypic analysis of -lactam resistance. The data obtained demonstrate that the presence of a wild-type plasmid containing the bla locus not only disrupts the MecImediated repression, but also significantly enhances the expression of resistance. Several preliminary hypotheses were formulated to explain these observations and preliminary data, together with published evidence, support the working model that BlaI forms functional hetero-dimers with MecI, which upon induction are readily inactivated by BlaR1. These results provide new insights into the regulatory mechanism(s) of mecA and open new perspectives for the role of β-lactamase operon in the MRSA phenotype.

A contribuição das bombas de efluxo QacA e Smr para a multirresistência em Staphylococcus aureus

RESUMO: O efluxo de compostos antimicrobianos é um mecanismo importante na multirresistência em bactérias. Bombas de efluxo codificadas em plasmídeos, como a QacA e a Smr, estão implicadas na susceptibilidade reduzida a biocidas, geralmente utilizados na prevenção e controlo de infecções nosocomiais, incluindo as causadas por estirpes de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA). Neste trabalho pretendeu-se avaliar a relevância de QacA e Smr no perfil de susceptibilidade dos isolados clínicos MRSA SM39 e SM52, que transportam os plasmídeos pSM39 e pSM52 com os determinantes qacA e smr, respectivamente. A actividade de efluxo das estirpes SM39 e SM39 curada (sem pSM39) e das estirpes SM52 e RN4220:pSM52 (estirpe susceptível RN4220 transformada com pSM52) foi caracterizada por: (1) determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de biocidas, corantes e antibióticos, na ausência e presença dos inibidores de efluxo tioridazina, clorpromazina, verapamil e reserpina; e (2) fluorometria em tempo-real. A determinação de CMIs demonstrou que a actividade de efluxo mediada por QacA e Smr está envolvida na susceptibilidade reduzida aos biocidas e corantes testados, que incluíram o brometo de hexadeciltrimetilamónio, a cetrimida, o cloreto de benzalcónio, a berberina, o cloreto de dequalínio, a pentamidina e o brometo de etídeo. Os ensaios fluorométricos confirmaram a elevada actividade de efluxo presente nas estirpes com os genes qacA ou smr. A determinação de CMIs para antibióticos β-lactâmicos em conjunto com o teste da nitrocefina revelou a presença simultânea do gene qacA e de uma β-lactamase no plasmídeo pSM39. Este trabalho evidencia a importância das bombas de efluxo QacA e Smr na resistência a biocidas em estirpes MRSA e na sobrevivência destas estirpes em ambiente hospitalar e na comunidade, para além de destacar a questão da potencial co-resistência entre biocidas e antibióticos.--------------- ABSTRACT: Drug efflux has become an important cause of multidrug resistance (MDR) in bacteria. Plasmid-encoded MDR efflux pumps, such as QacA and Smr, are implicated in reduced susceptibility to biocides, generally used in the prevention and control of nosocomial infections, including the ones caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). In this work, we aimed to evaluate the relevance of QacA and Smr to the susceptibility profile of the clinical MRSA isolates SM39 and SM52, which harbor the plasmids pSM39 and pSM52 that carry the determinants qacA and smr, respectively. Efflux activity of strain SM39 and its plasmid-free counterpart, SM39 cured, SM52 and RN4220:pSM52 (susceptible strain RN4220 transformed with pSM52) was characterized by: (1) determination of minimum inhibitory concentration (MIC) of biocides, dyes and antibiotics, in the absence and presence of the efflux inhibitors thioridazine, chlorpromazine, verapamil and reserpine; and (2) real-time fluorometry. MIC determination showed that QacA and Smr mediated efflux was involved in the reduced susceptibility profile to the biocides and dyes tested, which included hexadecyltrymethylammonium bromide, cetrimide, benzalkonium chloride, berberine, dequalinium chloride, pentamidine and ethidium bromide. Fluorometric assays confirmed the higher efflux activity present in strains harboring qacA or smr genes. Moreover, MIC determination for β-lactam antibiotics together with the nitrocefin test confirmed the presence of a β-lactamase in the plasmid carried by SM39 strain, pSM39. This work highlights the relevance of QacA and Smr to the biocide resistance in MRSA strains, and consequently to their survival and maintenance in the hospital environment and in the community. Furthermore, the presence of a β-lactamase and qacA determinants in the the same plasmid reinforces the question of the potencial biocide/antibiotic co-resistance in MRSA strains.

Non-clinical isolates bring new findings on enterococcal virulence

Dissertation presented to obtain the PhD degree in Biology

Pneumonias adquiridas durante o internamento hospitalar : impacte na saúde e implicação nos custos

RESUMO - Introdução: O presente estudo pretende analisar o impacte na saúde e a implicação nos custos da Pneumonia adquirida durante o internamento hospitalar. Está comprovado que as infeções hospitalares constituem um problema de Saúde pública dos hospitais em todo o mundo. Metodologia: A população em estudo abrange 97 033 episódios de internamento, ocorridos em 10 hospitais, no ano de 2010. O trabalho compreende três fases: i) caracterização da população em estudo; ii) identificação das variáveis que influenciam os resultados em saúde; iii) estimação dos custos do internamento com Pneumonia. Resultados: Os episódios de internamento com Pneumonia ocorreram maioritariamente no sexo masculino (58.1%). A faixa etária com mais episódios foi a dos 80 aos 89 anos. A taxa de Prevalência foi de 4.16% e a taxa de Mortalidade foi de 34.56%. Os doentes com Pneumonia tiveram uma demora média superior em 13 dias em relação aos doentes sem Pneumonia para o mesmo conjunto de GDH. Pertencer ao sexo masculino e os episódios de internamento ocorridos em hospitais não universitários levam a um aumento da probabilidade de morrer. Por sua vez apresentar uma maior duração de internamento e um número superior de comorbilidades levam a uma diminuição deste risco. Os custos em excesso dos episódios de internamento devido à aquisição de Pneumonia como doença secundária foram de aproximadamente 18 milhões de euros. Conclusão: O trabalho foi elaborado tendo em vista a quantificação do fenómeno em Portugal, tanto em termos da carga da doença, como das implicações financeiras. Os valores encontrados são preocupantes, pelo que se torna necessário tomar medidas e introduzir práticas na atividade hospitalar que minimizem as infeções hospitalares em geral e da Pneumonia em particular. Por sua vez é expectável, face ao descrito na literatura internacional, que a introdução destas práticas melhor os resultados em saúde e o desempenho financeiro dos hospitais.

Avaliação de bacteriófagos com atividade antibacteriana em isolados provenientes de doentes com pneumonia associada ao ventilador

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Spore differentiation in relation to the infectious cycle of the enteric pathogen Clostridium difficile

Clostridium difficile is a gram positive, spore former, anaerobic bacterium that is able to cause infection and disease, with symptoms ranging from mild diarrhea to pseudomembranous colitis, toxic megacolon, sepsis and death. In the last decade new strains have emerged that caused outbreaks of increased disease severity and higher recurrence, morbidity and mortality rates, and C. difficile is now considered both a main nosocomial pathogen associated with antibiotic therapy as well as a major concern in the community.(...)

Estimativa dos custos das infeções nosocomiais da corrente sanguínea relacionadas com o cateter venoso central no Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental

RESUMO - Introdução: As Infeções nosocomiais da corrente sanguínea associada a cateter venoso central (INCS-CVC) provocam um aumento das despesas hospitalares, traduzindo num aumento dos dias de internamento, consumo de antibióticos e de meios complementares de diagnóstico e terapêutica (MCDT). O presente estudo pretende avaliar os custos das INCS-CVC nos serviços de internamento do CHLO, no ano de 2012. Metodologia: Realizou-se um estudo retrospetivo de caso-controlo para determinar os custos adicionais inerentes às INCS-CVC. Foram identificados, em 2012, 32 doentes com infeção e 31 sem infeção. Os controlos foram extraídos da população tendo igual grupo diagnóstico Homogéneo (GDH), idade, sexo, serviço e duração de internamento e presença de CVC. As principais fontes de informação foram os registos da Comissão Controlo de Infeção (CCI) e do processo clinico eletrónico (PCE). A estimativa dos custos teve em consideração a duração de internamento, consumo de antibióticos e de MCDT. Resultados: A idade média dos casos e controlos foi de 66 e 69, respetivamente (p=0,432), 50% dos casos e 51,6% dos controlos eram do sexo masculino. Um total de 22 casos foi comparado com 22 controlos. A duração média de internamento dos casos e controlos foi de 70,8 e 36,6 dias, respetivamente (p=0,000). Em média o custo adicional por doente com antibióticos foi de 256€ (p=0,001). Nos casos o consumo de análises clinica foi 2,5 vezes superior e de exames imagiológicos 2 vezes superior aos controlos. O custo total médio adicional por doente foi de 20.737,6€. Conclusão: A ocorrência de INCS-CVC resultou num aumento significativo de utilização de recursos hospitalares e consequentemente num aumento dos custos hospitalares.

Gold nanoprobes for assessing expression of critical genes in the infection pathway of MRSA

Staphylococcus aureus is an important opportunistic pathogen that can cause a wide variety of diseases from mild to life-threatening conditions. S. aureus can colonize many parts of the human body but the anterior nares are the primary ecological niche. Its clinical importance is due to its ability to resist almost all classes of antibiotics available together with its large number of virulence factores. MRSA (Methicillin-Resistant S. aureus) strains are particularly important in the hospital settings, being the major cause of nosocomial infections worldwide. MRSA resistance to β-lactam antibiotics involves the acquisition of the exogenous mecA gene, part of the SCCmec cassette. Fast and reliable diagnostic techniques are needed to reduce the mortality and morbidity associated with MRSA infections, through the early identification of MRSA strains. The current identification techniques are time-consuming as they usually involves culturing steps, taking up to five days to determine the antibiotic resistance profile. Several amplification-based techniques have been developed to accelerate the diagnosis. The aim of this project was to develop an even faster methodology that bypasses the DNA amplification step. Gold-nanoprobes were developed and used to detect the presence of mecA gene in S. aureus genome, associated with resistance traits, for colorimetric assays based on non-crosslinking method. Our results showed that the mecA and mecA_V2 gold-nanoprobes were sensitive enough to discriminate the presence of mecA gene in PCR products and genomic DNA (gDNA) samples for target concentrations of 10 ng/μL and 20 ng/μL, respectively. As our main objective was to avoid the amplification step, we concluded that the best strategy for the early identification of MRSA infection relies on colorimetric assays based on non-crosslinking method with gDNA samples that can be extracted directly from blood samples.