Desenvolvimento de padrão gravimétrico de medição de caudal de fluidos entre 10 mL/min e 100 nL/min

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Mecânica

Conception and first results of a cross-sectional national study on the demography, disease characteristics and socioeconomics status of the Portuguese patients with multiple sclerosis : the PORT-MS study

RESUMO: Introdução e objetivos: Não existia um estudo multicêntrico que descrevesse as características dos doentes com EM, da doença em si, ou do seu tratamento, em Portugal.Métodos: Doentes McDonald 2010 positivos foram sequencialmente recrutados em 7 centros entre Maio e Novembro 2014. Aplicou-se um Caderno de Recolha de Dados incidindo na demografia, doença, educação e emprego (estudo PORT-MS). Resultados: 561 doentes incluídos. Primeiros sintomas aos 30,2±10,5 anos (RRMS 29,2±10, PPMS 39,4±11,7, p<0,001); diagnóstico 3,2±5,3 anos depois (RRMS 3,0±5,1, PPMS 4,9±2,5, p=0,002); tempo de doença após diagnóstico 9,4±7,2 anos (semelhante RRMS no diagnóstico e PPMS); idade atual 42,9±12,4 anos (grupo RRMS no diagnóstico 42,0±12,1, PPMS 52,5±11,3, p<0,001); EDSS atual 2,5 (RRMS 2.0, PPMS 6.0); proporção feminino:masculino é 2,5:1 (RRMS semelhante, PPMS 1,1:1, p<0,05); no diagnóstico RRMS 90,6%, SPMS 0,9%, PPMS 8,6%; 9,5% dos RRMS encontravam-se em SP na inclusão (nomeadamente os com mais idade no diagnóstico e/ou atualidade ou tempo de doença mais prolongado). PPMS mais frequente em doentes diagnosticados mais tardiamente (p<0,001), onde aumenta também ligeiramente a proporção de mulheres na PPMS. Nas últimas décadas: novos casos mostram estabilidade na proporção de géneros e tipos de doença; idade nos primeiros sintomas e no diagnóstico aumentou ligeiramente, tempo entre eles diminuiu ligeiramente. Proporção sob DMT (Maio 2014): global 84,5%; atualmente RRMS 90,4%; SPMS 70,8%; PPMS 36,8%; progressivas agregadas 48%. Tipo de DMT, amostra global: interferões 56,5%, GA 18,4%, Natalizumab 11,6%, Fingolimod 9,7%. Global: economicamente ativos 61,5%, desemprego 13,5%, 74,1% dos não activos estão reformados por doença. Gravidezes após diagnóstico em 15% mulheres. Casos com história familiar positiva 7,8%. Discussão e conclusões: Incluída cerca de 10% da população portuguesa. Resultados congruentes com dados internacionais. Elevada proporção sob DMT, mesmo EDSS alto e formas progressivas. Terapêuticas de segunda linha sub representadas. Doentes jovens e com doença ligeira com vida económica ativa; restantes essencialmente reformados por doença.---------------- ABSTRACT : Background/aims: In Portugal, there wasn’t a multicentric study on the general characteristics (demography, disease milestones, DMT, socioeconomic status) of Multiple Sclerosis patients. Methods: Patients fulfilling McDonald 2010 criteria were sequentially recruited from May to November 2014 in 7 centers and data was systematically collected. Results: 561 patients included. First symptoms occurred at 30,2±10,5 years-old (RRMS 29,2±10, PPMS 39,4±11,7, p<0,001); diagnosis 3,2±5,3 years later (RRMS 3,0±5,1, PPMS 4,9±2,5, p=0,002); 9,4±7,2 years elapsed since diagnosis (similar for those is RRMS at diagnosis and PPMS); current age 42,9±12,4 years-old (group RRMS at diagnosis 42,0±12,1, PPMS 52,5±11,3, p<0,001); current EDSS 2,5 (RRMS 2.0, PPMS 6.0); females to males 2,5:1 (RRMS similar, PPMS 1,1:1, p<0,05); at diagnosis RRMS 90,6%, SPMS 0,9%, PPMS 8,6%; 9,5% of RRMS reached SP at inclusion (those older at diagnosis, in actuality, or with longer follow-up). PPMS more frequente in patients diagnosed at older ages (p<0,001), also slight increase in females. Along the last decades: new cases have showed stable proportions of gender and disease types; age at first symptoms and diagnosis slightly increased, time between them slightly decreased. Proportion on DMT (May 2014): 84,5% of all; 90,4% of currently in RRMS; 70,8% of SPMS; 36,8% of PPMS; 48% of progressive forms together. Type of DMT, all patients: interferons 56,5%, Glatiramer Acetate 18,4%, Natalizumab 11,6%, Fingolimod 9,7%. Economically active 61,5% of all, unemployment 13,5%, 74,1% of non-active are retired due to disease. Females pregnant after diagnosis 15%. Positive family cases in 7,8%. Discussion/Conclusions: 10% of the national MS population collected. Data generally consistente with international reports. Proportion under DMT relatively high in all disease types, but second line therapies underrepresented. Young patients with mild disease have an active economic life. Those not active are essentially retired due to disease.

The role of arl13b in cilia length regulation and in zebrafish development

RESUMO: Arl13b é uma importante proteína ciliar, presente em cílios primários e cílios móveis. Ratinhos mutantes para Arl13b têm comprimento dos cílios reduzido e defeitos nos B-túbulos dos cílios. Como consequência destes fenótipos, deficiências na Arl13b originam, em modelos animais, várias doenças congénitas, incluindo problemas no estabelecimento do eixo esquerda-direita, malformações cerebrais e deformações corporais. Nos seres humanos, deficiências na Arl13b levam a uma doença crónica congénita chamada Síndrome de Joubert. Por outro lado, a sobreexpressão de Arl13b origina cílios mais longos, no entanto existe uma ausência da caracterização dos fenótipos celulares e durante o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, quisemos explorar o efeito da sobre-expressão de Arl13b em embriões de peixezebra. Descobrimos que, ao nível ciliar, a sobre-expressão de Arl13b nas células aumenta o comprimento ciliar em cílios primários e móveis, no entanto, a esses cílios falta adequada acetilação da alfa-tubulina no citoesqueleto feito por microtúbulos. Os nossos resultados mostraram que esse efeito é específico de Arl13b sobre-expressão e quando se manipularam as enzimas responsáveis pela acetilação (Mec17) e pela de-acetilação (HDAC6) encontrámos uma sinergia potencial com ambas. Testámos ainda, que o aumento no comprimento ciliar não estava causalmente relacionado com a falta de acetilação, ou seja, os cílios com menos acetilação não eram necessariamente os mais longos. Também mostrámos que a sobre-expressão de Arl13b é capaz de restaurar o comprimento dos cílios em mutantes com cílios curtos e como isso pode ser explorado para um futuro potencial papel terapêutico para Arl13b. Em seguida, foi avaliado o impacto do aumento da quantidade de Arl13b no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Observou-se que a sobre-expressão de Arl13b apresentava fenótipos muito fracos, quando comparados com a perda de função dos mutantes de Arl13b. Focados no inesperado fenótipo leve no estabelecimento do eixo esquerda-direita abordámos a questão através do estabelecimento de uma colaboração com matemáticos, descobrimos que os cílios mais longos que potencialmente têm a capacidade de movimentar mais fluido são atenuados por amplitudes de batimento menores, e, como resultado, estes longos cílios não prejudicam o movimento do fluido e consequentemente não afetam o estabelecimento dos padrões de esquerda-direita. Sugerimos assim que a Arl13b é um regulador chave, do comprimento ciliar. Descobrimos uma nova interação com as enzimas de acetilação/de-acetilação e levantamos novas hipóteses quanto aos mecanismos moleculares da função da Arl13b. Propomos um novo modelo para o mecanismo molecular da Arl13b na regulação do comprimento dos cílios onde podemos integrar os nossos resultados com os relatados na literatura. Este trabalho adiciona mais conhecimento para o mecanismo de ação da Arl13b e, portanto, fornece uma importante contribuição para o campo da investigação em cílios.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Arl13b is an important ciliary protein, present in primary and motile cilia. arl13b-/- mouse mutants have reduced cilia length and cilia B-tubule defects. As a consequence of these phenotypes, Arl13b loss of function animal models suffer from several congenital disorders including left-right problems, brain malformations and body deformations. In humans Arl13b depletion leads to a congenital chronic disease called Joubert Syndrome. On the other hand, overexpressing Arl13b leads to longer cilia but the characterization of the cellular and developmental phenotypes was missing. In this work we explore the effect of Arl13b overexpression in zebrafish embryos. We found that, at the ciliary level, Arl13b overexpression from 1 cell stage produces longer primary and motile cilia, but these cilia lack proper alpha tubulin acetylation of their microtubule cytoskeleton. Our results showed that this effect is specific from Arl13b overexpression and when we manipulated the enzymes responsible for acetylation, Mec17, and de-acetylation, HDAC6, we found a potential synergy of both mec17 knockdown and HDAC6 activity with Arl13b overexpression. We tested that the ciliary increase in length was not causally related to the lack of acetylation, meaning the more de-acetylated cilia were not necessarily the longer ones. We also showed that Arl13b overexpression is able to restore cilia length in short cilia mutants and how that may be explored to a potential future therapeutic role for Arl13b. Next, we evaluated the impact of increasing the amount of Arl13b in zebrafish embryonic development. We observed that Arl13b overexpression presented very mild phenotypes when compared to the loss of function mutants. We focused on the unexpected left-right mild phenotype and by establishing a mathematical modeling collaboration, we found out that the longer cilia generated force was attenuated by smaller beating amplitudes, and as a result, these long cilia were not impairing the cilia generated flow and the establishment of left-right patterning. We suggest that Arl13b is one key cilia length regulator. We disclosed a novel interaction with the acetylation / de-acetylation enzymes and raised new hypothesis as to the mechanisms of Arl13b function. We propose a new model for the Arl13b molecular mechanism of cilia length regulation where we integrate our findings with those reported in the literature. This work adds more knowledge to the Arl13b mechanism of action and therefore provides an important contribution to the cilia research field.