Ecophysiology of Ruditapes decussatus

The physiological responses of the clam R. decussatus from the Ria Formosa, southern Portugal, were examined in relation to normoxia, hypoxia (11, 6, 3 and 1.2 kPa) and anoxia; acute elevation of temperature (at 20, 27 and 32 °C), and its effect on the resistance to air exposure (at 20, 28 and 35 °C); current velocity (0.6, 3, 8 17, 24 and 36 cm. s-1) and turbidity (10, 100 and 300 mg. l-1 dry weight of particulate matter), and the efficiency of this species in retaining particles of different size (at 10 and 100 mg. l-1); and to copper contamination considering both short-term acute exposure to high levels (0.1-10 mg Cu. l-1) and chronic environmental levels (0.01 mg Cu. l-1). Clearance rates, respiration rates, absorption efficiency and excretion rates were assessed through the physiological energetics in terms of the energy budget and scope for growth (SFG). Stress independent respiration rates (R) and clearance rates (CR) were observed in relation to hypoxia down to 12 kPa and 6 kPa, respectively. Anoxic rates were 3.6 % of normoxic rates. Scope for growth was greatly reduced under extreme hypoxia (14 % of SFG in normoxia). Respiration rate was temperature independent in the range 20-32 °C but the decline in clearance rate resulted in negative SFG at 32 °C. Gaping during air exposure and the maintenance of faster aerobic metabolism led to 100 % mortality in 20 hours at 35 °C, 4 days at 28 °C and 5 days at 20 °C. Low current velocities (≤ 8 cm. s-1) supported high clearance rates. Shear stresses ≥ 0.9 Pa induced sediment movement and disturbed the feeding processes resulting in decreased clearance rates (at 36 cm. s-1, is 10 % of maximum CR). The observed ability of jetting out depleted water at a different level than the one of the inhalant current results is an important adaptation of clams to the slow currents of sheltered environments. Ingestion at high seston concentrations (> 100 mg. l-1) is controled by reducing the amount filtered, lowering CR (to 30 % of CR at low seston loads) and producing pseudofeces. Observed efficient retention of particles (70-100 %) in the range 3 to 8 μm is beneficial when algal cells are diluted by fine silt particles as it is likely to occur in the clams natural environment. R. decussatus in the short term escaped the exposure to copper by valve closure and therefore acute tests are not applicable to adult clams of this species. At environmental levels chronic exposure to copper did not induce lethal effects during the exposure period (20 days), but scope for growth was reduced to c. 30 %, indicating sustained impairment of physiological functions. The sensitivity of the physiological energetics and the integrated scope for growth measurement in assessing stress effects caused by natural environmental factors was highlighted.

Production of recombinant protein hLIF in static and dynamic systems of animal cell culture

Thesis for the Degree of Master of Science in Biotechnology Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Effects of molybdate and tungstate on expression levels and biochemical characteristics of formate dehydrogenases produced by desulfovibrio alaskensis NCIMB 13491

Journal of Bacteriology. 2011 Jun; Vol. 193 issue 12 pages 2917-2923

Influência do ciclo menstrual na fracção exalada de óxido nítrico

RESUMO:A determinação da fracção exalada de óxido nítrico (FENO) é amplamente utilizada como um biomarcador da inflamação eosinofílica das vias aéreas. Alguns estudos sugerem que a produção de óxido nítrico (NO) é influenciada pelas variações cíclicas hormonais na mulher,porém os dados não são consensuais. Deste modo, o objectivo do nosso estudo foi avaliar como varia a FENO ao longo do ciclo menstrual. Com esta finalidade, avaliamos um grupo de 20 voluntárias, em idade fértil, com ciclo menstrual regular, não fumadoras, que não utilizavam contraceptivos hormonais, nem suplementos alimentares e/ou medicamentosos e que não se encontravam grávidas, nem a amamentar. Todas referiram não ter conhecimento de qualquer patologia que afecte a FENO. A existência de atopia foi controlada através de testes cutâneos por prick, tendo-se excluído as participantes que apresentaram testes positivos. Realizamos quatro visitas de estudo, com base na periodicidade do ciclo de cada participante, nas quais, efectuamos a determinação da FENO, a quantificação dos níveis plasmáticos de óxido nítrico e nitratos (NO/NO3 -) e o doseamento hormonal de 17 -estradiol e progesterona. As avaliações realizaram-se no período da manhã, em jejum absoluto, tendo respeitado uma dieta pobre em nitratos no dia anterior e abstido da prática de exercício vigoroso uma hora antes da avaliação. Com este trabalho, verificamos um aumento significativo da FENO na fase secretora (17.97 ppb ± 5.8) comparativamente com a fase menstrual e proliferativa (16.48 ppb ± 3.6 e 15.95 ppb ±2.8, respectivamente). Não observamos variações significativas dos níveis plasmáticos de NO/NO3 - ao longo do ciclo. Constatamos uma correlação positiva entre a FENO e os níveis plasmáticos de NO/NO3 - durante a ovulação e verificamos que, para a nossa amostra, os níveis hormonais de estradiol e progesterona não são preditores do valor da FENO, nem dos níveis plasmáticos de NO/NO3-. Os resultados deste trabalho mostram uma variação da FENO ao longo do ciclo, ainda assim, mantendo-se os seus valores dentro do intervalo de referência, reforçando a fiabilidade deste biomarcador.--ABSTRACT:The determination of fractional exhaled nitric oxide (FENO) is widely used as a biomarker of eosinophilic airway inflammation. Some studies suggest that nitric oxide (NO) is influenced by cyclical hormonal changes in women, but those are not consensual. The aim of our study was to assess how FENO varies throughout the menstrual cycle. With this purpose, we studied a group of 20 volunteers within childbearing age, with regular menstrual cycle, non-smokers, who were not taking any medications including hormonal contraception and food supplements and who were not pregnant or breast-feeding. All participants reported not being aware of any condition that could affect the FENO. The presence of atopy was controlled by a skin prick test, having been excluded participants with positive test. We conducted four study visits, based on the periodicity of the cycle of each participant. In each visit, we made the determination of the FENO, the quantification of plasmatic levels of nitric oxide and nitrates (NO/NO3 -) and the blood levels of hormone estradiol-17 and progesterone. The evaluations occurred at morning, after overnight fasting. The participants were request to follow a low-nitrate diet in the previous day and refrained from vigorous exercise, for at least one hour before the visit We found a significant increase of FENO on secretory phase (17.97 ppb ± 5.8) compared with the menstrual and proliferative phase (16.48 ppb ± 3.6 and 15.95 ppb ± 2.8, espectively). No significant variations were found throughout the menstrual cycle in plasmatic levels of NO/NO3 -. We found a positive correlation between FENO and plasmatic levels of NO/NO3 - during ovulation. Finally, in our sample, the levels of oestradiol and progesterone are not predictors of FENO value nor of plasmatic levels of NO/NO3-. This study shows a variation of FENO over the menstrual cycle, nevertheless, the values remain within the reference range, reinforcing the reliability of this biomarker.

A terapia ocupacional como recurso para idosos institucionalizados: um estudo de avaliação das necessidades ocupacionais

RESUMO: O envelhecimento populacional está associado a necessidades de saúde, incluindo aspectos ligados à realização das actividades quotidianas e à vertente ocupacional em geral.O presente estudo procurou identificar as necessidades ocupacionais de uma amostra de idosos institucionalizados e avaliar alterações no desempenho ocupacional e na satisfação após participação num programa de actividades terapêuticas. A amostra foi constituída por 20 indivíduos, com uma média de idades de 86,2 anos (DP=6,0), maioritariamente do sexo feminino e viúvos, com níveis de escolaridade diversos, sem défice cognitivo grave, provenientes de duas instituições para idosos em Lisboa. Os instrumentos utilizados foram entrevista de caracterização sócio-demográfica. Mini- Mental State Examination. Índice de Katz e Medida Canadiana de Desempenho Ocupacional. Após a participação no programa de actividades, oito indivíduos mantiveram as notas de desempenho e de satisfação na Medida Canadiana; cinco apresentaram aumento em ambas as notas; para dois, o desempenho permaneceu inalterado e o grau de satisfação diminuiu; finalmente, três deixaram de ter pelo menos um problema no desempenho, destacando-se um indivíduo que deixou de ter problemas para se alimentar, tornando-se independente nesta área. Comparando as avaliações iniciais e as reavaliações pósintervenção, não se registaram diferenças significativas nas pontuações de desempenho nem de satisfação da Medida Canadiana. Em conclusão, muitos dos participantes do estudo referiram um desempenho deficiente em muitas actividades ocupacionais que valorizavam, assim como um grau elevado de insatisfação em relação a esse desempenho. Apesar de ter tido algum impacto nas necessidades ocupacionais dos participantes, o programa de actividades não pareceu trazer benefícios generalizados nesta pequena amostra.------------ABSTRACT:The aging process in institutionalized populations has implications that encompass various issues related to health, including occupational development and the performance of daily activities. It was this study’s objective to identify the occupational needs of a sample of institutionalized elderly and to identify the existence of changes in occupational performance and satisfaction after participation in a program of therapeutic activities. The sample consisted of 20 individuals (mostly female and widowed) from two nursing homes in Lisbon, having various levels of education and an average age of 86,2 years (SD=6,0) as well as the ability of verbal expression without severe cognitive deficit. The instruments used were a structured interview for socio-demographic characterization, the Mini Mental State Examination, the Katz Index and the Canadian Occupational Performance Measure. We found that older respondents claimed that the performance of daily activities constituted a problem. They stated that the activities of self-care and leisure were the most problematic, that they had negative self-perceptions regarding their own performance, and that they were dissatisfied with this performance of their daily activities. After participating in program activities, eight respondents experienced no change in their respective grades of performance and satisfaction, five showed increases in both grades and, for two respondents, the performance remained unchanged while the satisfaction level showed a decline. Three stopped having at least one problem in performance, and one participant even stopped referring feeding problems, having become independent in this area. Regarding the evolution of the Canadian Measure performance and satisfaction scores (before versus after the intervention), we found no significant differences. In conclusion, most participants stated that they were performing badly in what concerned the occupational activities they valued the most. The same applies to low levels of satisfaction regarding that performance. In this small sample, and despite some benefits, the program of therapeutic activities did not prove to be significantly effective.

Epigenetics and behavioural plasticity: drosophila euchromatin histone metiltransferase and foraging

A thesis submitted in fulfillment of the requirements for the degree of Masters in Molecular Genetics and Biomedicine

Regulation of PLK4 levels and activity to ensure centriole number control

Dissertation presented to obtain a Ph.D degree in Cellular Biology

DNA damage induced by acrylamide: roe of genetic polymorphisms in DNA damage levels

RESUMO:Em 1994 a acrilamida (AA) foi classificada pela IARC como um provável cancerígeno para o homem. Para além da utilização de AA em numerosas aplicações industriais, a AA está também presente numa grande variedade de alimentos ricos em amido e processados a temperaturas elevadas. Esta exposição através da ingestão de produtos alimentares despoletou elevadas preocupações ao nível do risco para a saúde pública e poderá implicar um risco adicional para o aparecimento de cancro. A glicidamida (GA), o metabolito epóxido formado a partir da oxidação da AA provavelmente através do citocromo P450 2E1, é considerada por vários estudos, o principal responsável pela carcinogenicidade da AA. Actualmente existe uma escassez de resultados relativamente aos mecanismos de genotoxicidade da AA e GA em células de mamífero. Por este motivo, o objectivo deste estudo centra-se na avaliação das consequências genéticas da exposição à AA e GA, recorrendo-se para tal ao uso de células de mamífero como modelo. Tendo como base este objectivo avaliou-se a citotoxicidade da AA e GA, através do ensaio do MTT, e realizaram-se dois testes citogenéticos, o teste das aberrações cromossómicas (CAs) e o teste da troca de cromátides irmãs (SCEs), de modo a avaliar as lesões de DNA induzidas por estes compostos em células de hamster Chinês V79. Os resultados globalmente mostraram que a GA é mais citotóxica e clastogénica do que a AA. No âmbito deste trabalho, foi também efectuada a quantificação de aductos específicos de DNA, nomeadamente N7-(2-carbamoil-2-hidroxietil)guanina (N7-GA-Gua) e N3-(2-carbamoil-2-hidroxietil)adenina (N3-GA-Ade). Os resultados obtidos permitem afirmar que os níveis de N7-GA-Gua e a concentração de GA apresentam uma relação linear dose-resposta. Foi também identificada uma óptima correlação entre os níveis de N7-GA-Gua e a frequência de troca de cromátides irmãs. Adicionalmente, e de forma a compreender os mecanismos de toxicidade da AA, estudaram-se os mecanismos dependentes da modulação do glutationo reduzido (GSH), nomeadamente da butionina sulfoximina (BSO), um inibidor da síntese de GSH, do GSH-monoetil estér (GSH-EE), um composto permeável nas células e que é intra-celularmente hidrolisado a GSH e ainda do GSH adicionado exogenamente ao meio de cultura, em células V79. Os resultados obtidos reforçaram o papel da modulação do GSH nos efeitos de citotoxicidade e clastogenicidade da AA. Para além dos estudos efetuados com células V79, procedeu-se também à determinação da frequência de SCEs, à quantificação de aductos específicos de DNA, bem como ao ensaio do cometa alcalino em amostras de dadores saudáveis expostos à AA e GA. Tanto os resultados obtidos através do ensaio das SCE, como pela quantificação de aductos específicos de DNA, ambos efectuados em linfócitos estimulados, originaram resultados comparáveis aos obtidos anteriormente para as células V79, reforçando a ideia de que a GA é bastante mais genotóxica do que a AA. Por outro lado, os resultados obtidos pelo ensaio do cometa para exposição à AA e GA mostraram que apenas esta última aumenta o nível das lesões de DNA. Outro objectivo deste trabalho, foi a identificação de possíveis associações existentes entre as lesões de DNA, quantificadas através do ensaio das SCEs e do cometa, e biomarcadores de susceptibilidade, tendo em conta os polimorfismos genéticos individuais envolvidos na destoxificação e nas vias de reparação do DNA (BER, NER, HRR e NHEJ) em linfócitos expostos à GA. Tal permitiu identificar associações entre os níveis de lesão de DNA determinados através do ensaio das SCEs, e os polimorfismos genéticos estudados, apontando para uma possível associação entre o GSTP1 (Ile105Val) e GSTA2 (Glu210Ala) e a frequência de SCEs. Por outro lado, os resultados obtidos através do ensaio do cometa sugerem uma associação entre as lesões de DNA e polimorfismos da via BER (MUTYH Gln335His e XRCC1 Gln39Arg) e da via NER (XPC Ala499val e Lys939Gln), considerando os genes isoladamente ou combinados. Estes estudos contribuem para um melhor entendimento da genotoxicidade e carcinogenicidade da AA e GA em células de mamífero, bem como da variabilidade da susceptibilidade individual na destoxificação e reparação de lesões de DNA provocadas pela exposição a estes xenobióticos alimentares. ----------- ABSTRACT:Acrylamide (AA) has been classified as a probable human carcinogen by IARC. Besides being used in numerous industrial applications, AA is also present in a variety of starchy cooked foods. This AA exposure scenario raised concerns about risk in human health and suggests that the oral consumption of AA is an additional risk factor for cancer. A considerable number of findings strongly suggest that the reactive metabolite glycidamide (GA), an epoxide generated presumably by cytochrome P450 2E1, plays a central role in AA carcinogenesis. Until now there are a scarcity of results concerning the mechanisms of genotoxicity of AA and GA in mammalian cells. In view of that, the study described in this thesis aims to unveil the genetic consequences of AA and GA exposure using mammalian cells as a model system. With this aim we evaluated the cytotoxicity of AA and GA using the MTT assay and subsequently performed two cytogenetic end-points: chromosomal aberrations (CAs) and sister chromatid exchanges (SCEs), in order to evaluate DNA damage induced by these compounds in V79 Chinese hamster cell line. The results showed that GA was more cytotoxic and clastogenic than AA. Within the scope of this thesis the quantification of specific DNA adducts were also performed, namely N7-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)guanine (N7-GA-Gua) and N3-(2-carbamoyl-2-hydroxyethyl)adenine (N3-GA-Ade). Interestingly, the GA concentration and the levels of N7-GA-Gua presented a linear dose-response relationship. Further, a very good correlation between the levels of N7-GA-Gua and the extent of SCEs were observed. In order to understand the mechanisms of AA-induced toxicity, the modulation of reduced glutathione (GSH)-dependent mechanisms were studied, namely the evaluation of the effect of buthionine sulfoximine (BSO), an effective inhibitor of GSH synthesis, of GSH-monoethyl ester (GSH-EE), a cell permeable compound that is intracellularly hydrolysed to GSH and also of GSH endogenously added to culture medium,z in V79 cell line. The overall results reinforced the role of GSH in the modulation of the cytotoxic and clastogenic effects induced by AA.Complementary to the studies performed in V79 cells, SCEs, specific DNA-adducts and alkaline comet assay in lymphocytes from healthy donors exposed to AA and GA were also evaluated. Both, the frequency of SCE and the quantification of specific GA DNA adducts, produced comparable results with those obtained in V79 cell line, reinforcing the idea that GA is far more genotoxic than AA. Further, the DNA damaging potential of AA and GA in whole blood leukocytes evaluated by the alkaline comet assay, showed that GA, but not AA, increases DNA damage. Additionally, this study aimed to identify associations between DNA damage and biomarkers of susceptibility, concerning individual genetic polymorphisms involved in detoxification and DNA repair pathways (BER, NER, HRR and NHEJ) on the GA-induced genotoxicity assessed by the SCE assay and by the alkaline comet assay. The extent of DNA damage determined by the levels of SCEs induced by GA seems to be modulated by GSTP1 (Ile105Val) and GSTA2 (Glu210Ala) genotypes. Moreover, the results obtained from the comet assay suggested associations between DNA damage and polymorphisms of BER (MUTYH Gln335His and XRCC1 Gln399Arg) and NER (XPC Ala499Val and Lys939Gln) genes, either alone or in combination. The overall results from this study contribute to a better understanding of the genotoxicity and carcinogenicity of AA and GA in mammalian cells, as well as the knowledge about the variability in individual susceptibility involved in detoxification and repair of DNA damage due to these dietary xenobiotics.

Corporate social responsibility levels and firm performance: Evidence from countries in crisis

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Finance from the NOVA – School of Business and Economics

Variation in protein expression levels in cell populations

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Systems Biology

Young adults' preferences and satisfaction levels in Duty-free shopping in airports

This study aims to explore and understand what young adults’ duty free shoppers (18-26 years old) want and are getting from travel retail shopping on airport environments and to evaluate their satisfaction levels with the service. It has important managerial contributions since it is an important target in a fast growing market. An online survey was conducted with 188 young adults and its results show that young adults’ are somewhat satisfied with the overall service on duty free stores mainly in what concerns quality of the products and physical evidence of the stores. Results also show that the majority of buyers within this segment are price driven and strongly influenced by promotions associated with price reductions, and do not seem very satisfied with respect to that. Keywords: Young

Impact of carbon/nitrogen feeding strategy on polyhydroxyalkanoates production using mixed microbial cultures

Polyhydroxyalkanoates (PHA) production using mixed microbial cultures (MMC) requires a multi-stage process involving the microbial selection of PHA-storing microorganisms, typically operated in sequencing batch reactors (SBR), and an accumulation reactor. Since low-cost renewable feedstocks used as process feedstock are often nitrogen-deficient, nutrient supply in the selection stage is required to allow for microbial growth. In this context, the possibility to uncouple nitrogen supply from carbon feeding within the SBR cycle has been investigated in this study. Moreover, three different COD:N ratios (100:3.79, 100:3.03 and 100:2.43) were tested in three different runs which also allowed the study of COD:N ratio on the SBR performance. For each run, a synthetic mixture of acetic and propionic acids at an overall organic load rate of 8.5 gCOD L-1 d-1 was used as carbon feedstock, whereas ammonium sulfate was the nitrogen source in a lab-scale sequence batch reactor (SBR) with 1 L of working volume. Besides, a sludge retention time (SRT) of 1 d was used as well as a 6 h cycle length. The uncoupled feeding strategy significantly enhanced the selective pressure towards PHA-storing microorganisms, resulting in a two-fold increase in the PHA production (up to about 1.3 gCOD L-1). A high storage response was observed for the two runs with the COD:N ratios (gCOD:gN) of 100:3.79 and 100:3.03, whereas the lowest investigated nitrogen load resulted in very poor performance in terms of polymer production. In fact, strong nitrogen limitation caused fungi to grow and a very poor storage ability by microorganisms that thrived in those conditions. The COD:N ratio also affected the polymer composition, indeed the produced poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) showed a variable HV content (1-20 %, w/w) among the three runs, lessening as the COD:N increased. This clearly suggests the possibility to use the COD:N ratio as a tool for tuning polymer properties regardless the composition of the feedstock.

On the function of the floccular complex of the vertebrate cerebellum: implications in paleoneuroanatomy

The cerebellum floccular complex lobes (FCLs) are housed in the FCL fossa of the periotic complex. There is experimental evidence indicating that the FCLs integrate visual and vestibular information, responsible for the vestibulo-ocular reflex, vestibulo-collic reflex, smooth pursuit and gaze holding. Thus, the behavior of extinct animals has been correlated with FCLs dimension in multiple paleoneuroanatomy studies. Here I analyzed braincase endocasts of a representative sample of Mammalia (48 species) and Aves (59 species) rendered using tomography and image segmentation and tested statistical correlations between the floccular complex volume, ecological and behavioral traits to assess various previously formulated paleobiological speculations. My results demonstrate: 1) there is no significant correlation between relative FCL volume and body mass; 2) there is no significant correlation between relative FCL and optic lobes size in birds; 3) average relative FCL size is larger in diurnal than in nocturnal birds but there is no statistically significant difference in mammals; 4) feeding strategies are related with different FCL size patterns in birds, but not in mammals; 5) locomotion type is not related with relative FCL size in mammals; 6) agility is not significantly correlated with FCL size in mammals. I conclude that, despite the apparent relation between FCL size and ecology in birds, the cerebellum of tetrapods is a highly plastic structure and may be adapted to control different functions across different taxonomic levels. For example, the european mole (Talpa europaea) which is fossorial and practically blind, has a FCL fossae relative size larger than those of bats, which are highly maneuverable. Therefore, variation in FCL size may be better explained by a combination of multiple factors with relation to anatomical and phylogenetic evolutionary constraints.

The role of s-nitrosothiols and rho-kinase 1 in glucose and lipid metabolism

RESUMO: Na sociedade contemporânea a diabetes tipo 2 e a obesidade estão a aumentar exponencialmente, representando um grave problema de saúde pública. De acordo com a IDF “A diabetes e a obesidade são o principal problema de saúde pública do século XXI’. Para além destas duas patologias, a prevalência de esteatose hepática não-alcoólica (NAFLD), entre a população obesa e diabética, é de cerca de 90%. O aumento da obesidade, diabetes e NAFLD tem uma forte correlação com o aumento do consumo de gorduras e açúcares, acompanhado de um decréscimo acentuado da actividade física. A obesidade, diabetes e NAFLD tem sido escrupolosamente investigada mas as terapêuticas disponíveis continuam a ser muito limitadas. Tendo em conta o número crescente e alarmante de obesos e diabéticos o conhecimento detalhado da patofisiologia da obesidade, diabetes e NAFLD, tendo em vista a necessidade extrema de desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, é da mais elevada urgência. O fígado é reconhecido como um orgão primordial no controlo da homeostase. No estado pós-prandial, o fígado converte a glucose em glicogénio e lípidos. Em contraste, no estado de jejum, o fígado promove a produção de glucose. Sistemas neuronais e hormonais, bem como o estado metabólico do fígado, controlam de forma muito precisa a alternância entre os diferentes substratos metabólicos, dependente do estado prandial. A insulina tem um papel central no controlo do metabolismo energético no fígado; se, por um lado, inibe a produção hepática de glucose e corpos cetónicos, por outro, promove a glicólise e a lipogénese. O metabolismo energético no fígado é também regulado por vários factores de transcrição e co-reguladores que, por sua vez, são regulados pela insulina, glucagina e outras hormonas metabólicas. Em conjunto, todos estes factores e reguladores vão controlar de forma muito estreita a gluconeogénese, a β-oxidação e a lipogénese, no fígado. Para além dos já conhecidos reguladores do metabolismo hepático, novas moléculas têm sido estudadas como tendo um papel fundamental na regulação do metabolismo energético no fígado. Qualquer desequilíbrio no metabolismo hepático vai contribuir para a insulino-resistência, NAFLD e diabetes tipo 2. O principal objectivo do trabalho de investigação aqui apresentado é o contributo para o estudo detalhado da patogénese da diabetes e obesidade, num contexto de dietas ricas em açúcares e gorduras, e com a perspectiva de explorar novas estratégias terapêuticas. Os objectivos específicos deste trabalho eram: primeiro, determinar se o tratamento com glutationo (GSH) e óxido nítrico (NO) era suficiente para melhorar a insulino-resistência associada ao elevado consumo de sacarose; segundo, determinar o papel da Rho-kinase 1 (ROCK1) na regulação do metabolismo hepático da glucose e dos lípidos; e terceiro, estudar o efeito do metilsulfonilmetano (MSM) em doenças metabólicas associadas à obesidade. Na primeira parte deste trabalho de investigação foram utilizados ratos Wistar machos sujeitos a uma dieta rica em sacarose (HS). Tal como esperado, estes animais apresentavam insulino-resistência e hiperinsulinémia. A dieta HS levou ao aumento dos níveis hepáticos de NO e ao decréscimo dos níveis de GSH no fígado. Em jejum, a administração intraportal de GSH e NO, a animais saudáveis promoveu um aumento significativo da sensibilidade à insulina. Também nestes animais, a administração intravenosa de S-nitrosotióis, compostos orgânicos que contém um grupo nitroso acoplado a um átomo de enxofre de um tiol, promoveu o aumento significativo da sensibilidade à insulina. Pelo contrário, em animais sujeitos à dieta HS, as doses padrão de GSH + NO e de S-nitrosotióis não conseguiram promover o aumento da sensibilidade à insulina. No entanto, ao aumentar a dose de S-nitrosotióis administrados por via intravenosa, foi possível observar o aumento da sensibilidade à insulina dependente da dose, indicando um possível papel dos S-nitrosotióis como sensibilizadores de insulina. O estudo detalhado do papel dos S-nitrosotióis na via de sinalização da insulina revelou que há um aumento da fosforilação do receptor da insulina (IR) e da proteína cinase B (Akt), sugerindo um efeito dos S-nitrosotióis nesta via de sinalização. Os resultados apresentados nesta primeira parte sugerem que os S-nitrosotióis promovem a correcta acção da insulina, podendo vir a ser importantes alvos terapêuticos. Na segunda parte deste trabalho de investigação utilizámos murganhos, com uma delecção específica da ROCK1 no fígado, e sujeitos a uma dieta rica em lípidos (HFD). Foi possível concluir que a ausência da ROCK1 no fígado previne a obesidade, melhora a sensibilidade à insulina e protege contra a esteatose hepática. A ausência de ROCK1 no fígado levou a um decréscimo significativo da expressão génica de genes associados à lipogénese, com uma diminuição acentuada do fluxo metabólico associado a esta via. Pelo contrário, a sobreexpressão de ROCK1, exclusivamente no fígado, promove a insulino-resistência e a esteatose hepática no contexto de obesidade induzida pela dieta. Para além disto, a delecção da ROCK1 no fígado de animais obesos e diabéticos, os murganhos deficientes em leptina, corroborou os dados obtidos no primeiro modelo animal, com a franca melhoria da hiperglicémia, hiperinsulinémia e esteatose hepática. Os dados que compõem esta parte do trabalho de investigação sugerem que a ROCK1 tem um papel crucial na regulação do metabolismo lipídico. Na terceira e última parte deste trabalho de investigação foi investigado o efeito do composto metilsulfunilmetano (MSM), um composto organosulfúrico naturalmente presente em plantas e utilizado também como suplemento dietético, em murganhos obesos e insulino-resistentes, por exposição a uma dieta rica em lípidos (DIO). O tratamento com MSM melhorou a insulino-resistência e protegeu contra a esteatose hepática. O conteúdo hepático em triglicéridos e colesterol também diminuíu de forma significativa nos animais DIO sujeitos ao tratamento com MSM, bem como a expressão génica associada à lipogénese. Para além disto, o tratamento com MSM levou a uma diminuição da expressão génica associada à inflamação. De realçar que o tratamento com MSM levou a uma melhoria do perfil hematopoiético destes animais, tanto na medula óssea como no sangue. Para comprovar o efeito benéfico do MSM na obesidade e insulino-resistência utilizámos murganhos deficientes no receptor da leptina, e por isso obesos e diabéticos, tendo observado um perfil semelhante ao obtido para murganhos sujeitos a uma dieta rica em lípidos e tratados com MSM. Concluímos, através dos dados recolhidos, que o MSM como suplemento pode ter efeitos benéficos na hiperinsulinémia, insulino-resistência e inflamação que caracterizam a diabetes tipo 2. Em resumo, os dados obtidos neste trabalho de investigação mostram que os S-nitrosotióis podem ter um papel importante como sensibilizadores da insulina, promovendo um aumento da sensibilidade à insulina num contexto de dietas ricas em sacarose. Para além disto, estudos in vitro, sugerem que os S-nitrosotióis regulam, especificamente, a via de sinalização da insulina. Este trabalho teve também como objectivo o estudo da ROCK1 como regulador do metabolismo da glucose e dos lípidos no fígado. Através do estudo de animais com uma delecção ou uma sobreexpressão da ROCK1 no fígado mostrou-se que esta tem um papel crucial na patogénese da obesidade e diabetes tipo 2, especificamente através do controlo da lipogénese de novo. Finalmente, foi também objectivo deste trabalho, explorar o efeito do MSM em animais DIO e deficientes em leptina. O tratamento com MSM protege de forma evidente contra a obesidade e insulino-resistência, com especial enfâse para a capacidade que esta molécula demonstrou ter na protecção contra a inflamação. Em conjunto os vários estudos aqui apresentados mostram que tanto os S-nitrosotióis como a ROCK1 têm um papel na patogénese da obesidade e diabetes tipo 2 e que a utilização de MSM como suplemento às terapêuticas convencionais pode ter um papel no tratamentos de doenças metabólicas.-------------------------------ABSTRACT: In modern western societies type 2 diabetes and obesity are increasing exponentially, representing a somber public concern. According to the International Diabetes Federation (IDF) ‘Diabetes and Obesity are the biggest public health challenges of the 21st century’. Aside from these the prevalence of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), among the diabetic and obese population, is as high as 90%. It is now well established that the increase in obesity, diabetes and NAFLD strongly correlates with an increase in fat and sugar intake in our diet, alongside physical inactivity. The pathogenesis of obesity, diabetes and NAFLD has been thoroughly studied but the treatment options available are still narrow. Considering the alarming number in the obese and diabetic population the complete understanding of the pathogenesis, keeping in mind that new therapeutic strategies need to be attained, is of the highest urgency. The liver has been well established as a fundamental organ in regulating whole-body homeostasis. In the fed state the liver converts the glucose into glycogen and lipids. Conversely, in the fasted state, glucose will be produced in the liver. Neuronal and hormonal systems, as well as the hepatic metabolic states, tightly control the fast to fed switch in metabolic fuels. Insulin has a central role in controlling hepatic energy metabolism, by suppressing glucose production and ketogenesis, while stimulating glycolysis and lipogenesis. Liver energy metabolism is also regulated by various transcription factors and coregulators that are, in turn, regulated by insulin, glucagon and other metabolic hormones. Together, these regulators will act to control gluconeogenesis, β-oxidation and lipogenesis in the liver. Aside from the well-established regulators of liver energy metabolism new molecules are being studied has having a role in regulating hepatic metabolism. Any imbalance in the liver energy metabolism is a major contributor to insulin resistance, NAFLD and type 2 diabetes. The overall goal of this research work was to contribute to the understanding of the pathogenesis of diabetes and obesity, on a setting of high-sucrose and high-fat diets, and to explore potential therapeutic options. The specific aims were: first, to determine if treatment with glutathione (GSH) and nitric oxide (NO) was sufficient to ameliorate insulin resistance induced by high-sucrose feeding; second, to determine the physiological role of rho-kinase 1 (ROCK1) in regulating hepatic and lipid metabolism; and third, to study the effect of methylsulfonylmethane (MSM) on obesity-linked metabolic disorders. In the first part of this research work we used male Wistar rats fed a high-sucrose (HS) diet. As expected, rats fed a HS diet were insulin resistant and hyperinsulinemic. HS feeding increased hepatic levels of NO, while decreasing GSH. In fasted healthy animals administration of both GSH and NO, to the liver, was able to increase insulin sensitivity. Intravenous administration of S-nitrosothiols, organic compounds containing a nitroso group attached to the sulfur atom of a thiol, in fasted control animals also increased insulin sensitivity. Under HS feeding the standard doses of GSH + NO and S-nitrosothiols were unable to promote an increase in insulin sensitivity. However, the intravenous administration of increasing concentrations of S-nitrosothiols was able to restore insulin sensitivity, suggesting that S-nitrosothiols have an insulin sensitizing effect. Investigation of the effect of S-nitrosothiols on the insulin signaling pathway showed increased phosphorylation of the insulin receptor (IR) and protein kinase B (Akt), suggesting that S-nitrosothiols may have an effect on the insulin signaling pathway. Together, these data showed that S-nitrosothiols promote normal insulin action, suggesting that they may act as potential pharmacological tools. In the second part of this research work we used liver-specific ROCK1 knockout mice fed a high-fat (HF) diet. Liver-specific deletion of ROCK1 prevented obesity, improved insulin sensitivity and protected against hepatic steatosis. Deficiency of ROCK1 in the liver caused a significant decrease in the gene expression of lipogenesis associated gene, ultimately leading to decreased lipogenesis. Contrariwise, ROCK1 overexpression in the liver promoted insulin resistance and hepatic steatosis in diet-induced obesity. Furthermore, liver-specific deletion of ROCK1 in obese and diabetic mice, the leptin-deficient mice, improved the typical hyperglycemia, hyperinsulinemia and liver steatosis. Together, these data identify ROCK1 as a crucial regulator of lipid metabolism. In the third and final part of this research work we investigated the effect of MSM, an organosulfur compound naturally found in plants and used as a dietary supplement, on diet-induced obese (DIO) and insulin resistant mice. MSM treatment ameliorated insulin resistance and protected against hepatosteatosis. Hepatic content in triglycerides and cholesterol was significantly decreased by MSM treatment, as well as lipogenesis associated gene expression. Furthermore, MSM treated mice had decreased inflammation associated gene expression in the liver. Importantly, FACS analysis showed that MSM treatment rescued the inflammatory hematopoietic phenotype of DIO mice in the bone marrow and the peripheral blood. Moreover, MSM treatment of the obese and diabetic mice, the leptin-deficient mice, resulted in similar effects as the ones observed for DIO mice. Collectively, these data suggest that MSM supplementation has a beneficial effect on hyperinsulinemia, insulin resistance and inflammation, which are often found in type 2 diabetes. In conclusion, this research work showed that S-nitrosothiols may play a role as insulin sensitizers, restoring insulin sensitivity in a setting of high-sucrose induced insulin resistance. Furthermore, in vitro studies suggest that S-nitrosothiols specifically regulate the insulin signaling pathway. This research work also investigated the role of hepatic ROCK1 in regulation of glucose and lipid metabolism. Using liver-specific ROCK 1 knockout and ROCK1 overexpressing mice it was shown that ROCK1 plays a role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes, specifically through regulation of the de novo lipogenesis pathway. Finally, this research work aimed to explore the effect of MSM in DIO and leptin receptor-deficient mice. MSM strongly protects against obesity and insulin resistance, moreover showed a robust ability to decrease inflammation. Together, the individual studies that compose this dissertation showed that S-nitrosothiols and ROCK1 play a role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes and that MSM supplementation may have a role in the treatment of metabolic disorders.