Contribuição para o estudo da anexina V na apoptose celular em concentrados de eritrócitos

A hemoterapia moderna baseia-se na utilização correcta dos diversos componentes sanguíneos, associados a um maior controle de qualidade do sangue, o que a torna mais segura e, actualmente, muitos doentes sao beneficiados pois, a transfusão de componentes sanguineos, em situaçoes várias, está na linha da frente na manutenção da vida e em casos extremos, o último recurso que salva vidas. A qualidade e a segurança nas transfusões de sangue são grandes preocupações da área médica, autoridades de saúde e doente1. O sangue obtido pelos Centros de Sangue provem de dadores voluntários, dotados de uma enorme sensibilidade social, que periodicamente assumem uma postura benevola e altruista e consequentemente mantêm os bancos de sangue providos de um produto imprescindivel no tratamento de diversas patologias. O produto final disponível – concentrado de eritrócitos (CE´s), plasma e concentrado plaquetário – tem de assumir um carácter seguro e viável de modo a que os riscos para o doente sejam diminutos2. O controlo de qualidade aplicado a todo o sangue doado realiza provas de conformidade nas unidades com especificações previamente definidas, sendo a hémolise um dos parâmetros importantes na avaliação da qualidade dos concentrados de eritrócitos, pois, pode ocasionar implicações clinicas para o receptor. Para além disso a avaliação da concentração de hemoglobina (Hg) no sangue doado mostra-se um controlo imprescindivel que salvaguarda a qualidade e segurança do componente a transfundir3;4.Até se obter um CE há todo um processo moroso e de responsabilidade vital. Todo o sangue obtido passa por várias etapas fundamentais até à obtenção do componente pretendido (analise, produção e armazenamento). Os CE’s obtidos quando armazenados, num ambiente de refrigeração, têm uma vida útil de 42 dias. Após este período, o sangue deve ser inutilizado por se verificar alterações bioquímicas, biomecânicas, e imunológicas nos CE’s e por consequência a sua instabilidade vital no que ao tratamento de patologias, para as quais este componente está indicado, diz respeito5. Foi realizado um estudo experimental com o objetivo de avaliar a contribuição da Anexina V na apoptose celular nos concentrados de eritrócitos, constatando a degradação dos mesmos ao longo de todo o período de armazenamento e validar o paradigma que a ciência preconiza: “Os CE’s após os 42 dias armazenados, em condições específicas (2 a 6º centígrados), são inviaveis para transfundir”6;7. A avaliação dos níveis de apoptose por citometria de fluxo é geralmente realizada por métodos que utilizam Anexina V como marcador vital, que se associa aos resíduos de fosfatidilserina, externalizados no início do processo apoptótico. A Anexina V é uma proteína humana endógena dependente do ião Ca+2, amplamente distribuída intracelularmente em altas concentrações na placenta e em concentrações mais baixas nos eritrócitos, plaquetas e monócitos. Apresenta como principal característica a capacidade de se ligar à fosfatidilserina, um fosfolipído presente na camada interna da bicamada lipídica, que durante a apoptose celular é translocada para a camada externa da membrana celular. A determinação da Anexina V é normalmente utilizada para verificar se as células são viáveis, apoptóticas ou necróticas por meio de diferenças na integridade da membrana plasmática. Assim, ao conjugar a Anexina V ao FITC (Isotiocianato de fluoresceína) é possível identificar e quantificar as células apoptóticas por citometria de fluxo7. Numa amostra de 15 CE’s, a qual foi induzida a hemólise, verificou-se, por citometria de fluxo, que a viabilidade deste componente se desvanesce ao longo do tempo, confirmando assim que o tratamento, manuseamento e armazenamento do sangue compromete a vitalidade terapeutica deste insubstituivel produto vital.

Desenvolvimento de métodos moleculares para detecção de Theileria annulata

Dissertação para a obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Efeito dos factores do hospedeiro e parasitários na susceptibilidade à Malária e gravidade da Doença

A malária é considerada como a doença parasitária mais séria em humanos, infectando cerca de 5 a 10% da população mundial, estimando-se entre 300 a 600 milhões de casos e mais de dois milhões de mortes, anualmente. Apesar da severidade da doença, a compreensão da variabilidade da resposta do hospedeiro à infecção (traduzida desde a infecção silenciosa até formas crónicas da doença, passando por quadros clínicos potencialmente fatais), continua a ser um dos grandes desafios da investigação médica. Vários factores genéticos parasitários ou do hospedeiro, estado imune e níveis de exposição, contribuem para esta variabilidade, mas a sua importância relativa para a carga total da doença tem sido pouco estudada. Entre outros, é possível salientar como fontes importantes de variabilidade na susceptibilidade à malária e gravidade da doença, factores intrínsecos ao hospedeiro tais como polimorfismos genéticos relacionados com as células sanguíneas e factores parasitários como a composição da(s) população(ões) parasitária(s) presentes na infecção. Factores do hospedeiro humano relacionados com as células sanguíneas (drepanocitose e deficiência na glucose-6-fosfato desidrogenase - G6PD) têm sido tradicionalmente estudados e relacionados com a gravidade da malária causada por Plasmodium falciparum. Relativamente às populações parasitárias, das cinco espécies que infectam humanos, P. falciparum continua a ser responsável pela malária grave, apesar de muito recentemente alguma gravidade ser atribuída a Plasmodium vivax. Sabe-se que nas mesmas áreas outras espécies coexistem em muito maior prevalência, contrariando o que se pensava há algum tempo. Apesar de poucos estudos terem focado o tema das infecções mistas, existem alguns relatos de que eventuais interacções entre as diferentes espécies presentes simultaneamente no mesmo hospedeiro poderem afectar a susceptibilidade à doença. Com o objectivo geral de avaliar o efeito e a contribuição destes factores na susceptibilidade e gravidade da malária, analisando e comparando três grupos (estudo de caso-controlo) doentes com malária grave (MG), doentes com malária não-complicada (Mnc) e indivíduos infectados assintomáticos (IA), realizámos em Angola de 2007 a 2010, um estudo em sete das 18 províncias com distintos níveis de endemicidade. Foram obtidas 1.416 amostras de sangue periférico de 1.198 indivíduos assintomáticos e 218 doentes. O DNA obtido a partir destes isolados foi utilizado para detecção da presença de variantes genéticos relacionados com os eritrócitos (drepanocitose – análise do gene HBB, deficiência G6PD – análise do gene G6PD, antigénio Duffy-análise do gene DARC) e identificação das espécies de Plasmodium presentes, através de nested-PCR mediante a amplificação dos genes que codificam a subunidade menor do RNA ribossomal. Os resultados demonstraram prevalências superiores às anteriormente descritas em relação às seguintes espécies parasitárias: P. falciparum 98,2% vs 92,0% e Plasmodium malariae 10,7% vs 1,0% e inferior em relação a P. vivax 2,5% vs 7,0%. Foi reconfirmada a presença de Plasmodium ovale (descrita anteriormente), mas não publicada em documentos oficiais e relatada pela primeira vez em Angola a presença de infecções mistas (duplas e triplas) (15,7%) e de infecção por P. vivax em indivíduos Duffy-negativos (dados publicados). Relativamente aos polimorfismos relacionados com os genes HBB e G6PD e provável associação com a protecção à malária, os nossos resultados confirmam a associação do traço falciforme (heterozigotia HbS), com a protecção à doença (OR = 0,30; IC 95% 0,18-0,49; p<0,001). Contudo, não foi encontrada, quer nos indivíduos hemizigóticos, quer nos heterozigóticos para o alelo G6PD (A-) nenhuma evidência para a protecção a malária (MG e Mnc) (OR = 1,69; IC 95% 0,91-3,13; p=0,096). Os resultados desta investigação requerem um estudo mais aprofundado, com uma dimensão amostral maior, necessário à confirmação da nossa observação.

Espectroscopia de impedância aplicada à caracterização de células parasitadas numa plataforma de microfluídica

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Caraterização estatística dos valores percentuais de sangue do grupo AB0 colhido pelo Centro Regional de Sangue de Lisboa e respetivo emparelhamento com a distribuição a nível hospitalar

RESUMO: A Medicina Transfusional está a mudar rapidamente em resposta a um número de diferentes catástrofes, patologias e novas técnicas da ciência. Por detrás de uma transfusão de sangue existe todo um conjunto de procedimentos, técnicas e atuações que salvaguardam o rigor e segurança científicas resultando numa maior eficiência na diminuição da morbilidade/mortalidade humana. Todo o processo de colheita, análise, processamento e distribuição de concentrados de eritrócitos comporta um capital elevado em termos da economia para a saúde e os requisitos básicos de uma gestão de qualidade, na área da saúde em geral e da hemoterapia em particular, tem de compreender, com rigor, estas condições de gestão parceria de forma a evitar um aumento nos custos da saúde. Para identificar as discrepâncias nos pedidos efetuados pelos Hospitais Públicos e Privados ao Centro de Sangue e Transplantação de Lisboa, no que diz respeito ao Sistema AB0 dos concentrados de Eritrócitos, foi feito um estudo quantitativo, com fins descritivos simples, aos 95 984 concentrados de eritrócitos enviados às 32 Instituições de Saúde da abrangência do CST de Lisboa. Tendo em conta o Sistema AB0 RhD, confirma-se que o grupo sanguíneo prevalente, tanto na população portuguesa como nos dadores de sangue que efetuaram a sua dádiva de sangue em 2011, é o grupo A Rh+. Observou-se no entanto que o grupo sanguíneo mais pedido e enviado pertence ao grupo 0 Rh positivo. Assim, apurou-se que existe uma disparidade, mesmo que pouco acentuada, nos pedidos efetuados pelos Hospitais Públicos e Privados ao Centro de Sangue e Transplantação de Lisboa no que configura ao Sistema AB0 dos concentrados de eritrócitos. Os Hospitais Públicos Sem Serviço de Colheita de Sangue e os Hospitais Privados são responsáveis por este desencontro de valores. No que se refere às inutilizações por prazo de validade ressalva-se que os desaproveitamentos de CE’s não são tão acentuados como se esperaria numa primeira fase de estudo. No entanto, e em termos económicos, se existem inutilizações por prazo de validade, existe igualmente despojo financeiro. Por detrás de cada unidade inutilizada existe um alto investimento que será desperdiçado por carência de solicitação. De forma a minimizar gastos e a salvaguardar um Banco de Sangue capaz de suportar qualquer eventualidade de rutura de stock estão patentes propostas de estratégias capazes de impedir constrangimentos diários e futuros no que diz respeito à disponibilidade de sangue e componentes sanguíneos.--------------ABSTRACT: The Transfusion Medicine it is changing fast in response to a number of different catastrophes, disease and new techniques of science. From behind a blood transfusion there is a whole set of procedures, techniques and actions that safeguard the safety and scientific rigor resulting in greater efficiency in reducing morbidity / mortality human. The entire process of procurement, testing, processing and distribution of concentrated erythrocytes involves a high capital in terms of the economy to health and the basic requirements of a quality management in healthcare in general and hemotherapy in particular has to understand with rigor, this partnership in order to avoid an increase in health costs. In order to identify discrepancies in the orders placed by the Government and Private Hospitals Center Blood and Transplant Lisbon regarding the AB0 system of concentrated erythrocytes was made a quantitative study with simple descriptive purposes to 95,984 erythrocytes concentrates sent to 32 Health Institutions of the scope of CST Lisbon. Having regard to the system AB0 blood group RhD prevalent both in the Portuguese population as blood donors, who made his blood donation in 2011, confirms that belong to group A Rh +. It was found that blood group most requested and sent belongs to group 0 Rh positive. Thus, it was found that there is a disparity, even a little sharp, requests made by the Government and Private Hospitals Blood Center and Transplantation in Lisbon that configures the system AB0 erythrocyte concentrates. The Public Hospitals without Blood Harvest and Private Hospitals are responsible for this clash of values. With regard the expiry date by disables proviso that the wastes of CE's are not as sharp as one would expect in a first phase of the study. However, in economic terms, if there is disables by expiry date, there is also financial squandering. Behind every unused unit is a high investment to be wasted by shortage of request. To minimize costs and safeguarding a Blood Bank can support any event of rupture of stock patents are proposed strategies to prevent future and diaries constraints with regard to the availability of blood and blood components.

Efeito da Minociclina em Mus Musculus Infectados com Trypanosoma brucei brucei

As patologias provocadas tanto em humanos como em outros mamíferos, pelo parasita hemoflagelado Trypanosoma brucei são um verdadeiro flagelo em África, ma-tando milhares de pessoas e cabeças de gado todos os anos. No caso da terapêutica hu-mana, todas as drogas foram implementadas em meados do século XX, sem novas pa-tentes desde 1981. Urge portanto a descoberta de novas moléculas, que em esquema monoterapêutico ou em associação, possam de alguma forma intervir no controlo do parasita ou contra a inflamação provocada pelas sucessivas ondas de parasitémia. Em estudos anteriores a minociclina, tetraciclina de 2ª geração, provou ser eficaz na protecção do sistema nervoso central (SNC) de ratos infectados com Trypanosoma brucei brucei (T.b.brucei), diminuindo a passagem pela barreira hemato-encefálica (BHE) de leucócitos e parasitas. No presente estudo, o efeito dessa droga parece estar relacionado com uma maior resistência à perda de vários componentes hematológicos como eritrócitos, leucócitos ou granulócitos em amostras de animais com vinte dias (20 DPI) de progressão de infecção com o parasita. Também as parasitémias são substanci-almente mais baixas (cerca de dez vezes menores) nos animais tratados em 20 DPI. Em termos das citocinas interleucina 4 (IL-4), interferão gama (IFN-γ) e óxido nítrico (NO), parece existir um padrão de secreção diferente nos animais tratados e não tratados. A IL-4 parece neste caso estar associada a um perfil anti-inflamatório; o NO, importante no controlo do parasita, existe em maiores quantidades nos animais tratados, ao contrá-rio do IFN-γ com quantidades mais elevadas nos animais controlos. Esta última citocina está escrita na literatura como factor de crescimento parasitário. A expressão de metaloproteinases é aparentemente superior no baço quando comparada com tecido hepático, contudo sem aparentes diferenças entre os dois grupos persisitindo um sistema de dupla banda compreendidas entre r de 30 e 40 kDa, valores de massa molecular, na maioria dos animais dos dois grupos. As metaloproteinases po-dem se endógenas do hospedeiro, mas com elevada possibilidade de serem secretadas pelo parasita no seu processo de invasão tecidular.

Interaction of malaria parasites with host late endocytic and autophagic pathways is essential for Plasmodium liver stage development

RESUMO: A Malária é causada por parasitas do género Plasmodium, sendo a doença parasitária mais fatal para o ser humano. Apesar de, durante o século passado, o desenvolvimento económico e a implementação de diversas medidas de controlo, tenham permitido erradicar a doença em muitos países, a Malária continua a ser um problema de saúde grave, em particular nos países em desenvolvimento. A Malária é transmitida através da picada de uma fêmea de mosquito do género Anopheles. Durante a picada, os esporozoítos são injetados na pele do hospedeiro, seguindo-se a fase hepática e obrigatória do ciclo de vida. No fígado, os esporozoítos infetam os hepatócitos onde se replicam, dentro de um vacúolo parasitário (VP) e de uma forma imunitária silenciosa, em centenas de merozoitos. Estas novas formas do parasita são as responsáveis por infetar os eritrócitos, iniciando a fase sanguínea da doença, onde se os primeiros sintomas se manifestam, tais como a característica febre cíclica. A fase hepática da doença é a menos estudada e compreendida. Mais ainda, as interações entre o VP e os organelos da células hospedeira estão ainda pouco caracterizados. Assim, neste estudo, as interações entre os organelos endocíticos e autofágicos da célula hospedeira e o VP foram dissecados, observando-se que os anfisomas, que são organelos resultantes da intersecção do dois processos de tráfego intracelular, interagem com o parasita. Descobrimos que a autofagia tem também uma importante função imunitária durante a fase hepática inicial, ao passo, que durante o desenvolvimento do parasita, já numa fase mais tardia, o parasita depende da interação com os endossomas tardios e anfisomas para crescer. Vesiculas de BSA, EGF e LC3, foram, também, observadas dentro do VP, sugerindo que os parasitas são capazes de internalizar material endocítico e autofágico do hospedeiro. Mais ainda, mostramos que esta interação depende da cinase PIKfyve, responsável pela conversão do fosfoinositidio-3-fosfato no fosfoinositidio-3,5-bifosfato, uma vez que inibindo esta cinase o parasita não é capaz de crescer normalmente. Finalmente, mostramos que a proteína TRPML1, uma proteína efetora do fosfoinositidio-3,5-bifosfato, e envolvida no processo de fusão das membranas dos organelos endocíticos e autofágicos, também é necessária para o crescimento do parasita. Desta forma, o nosso estudo sugere que a membrana do VP funde com vesiculas endocíticas e autofágicas tardias, de uma forma dependente do fositidio-3,5-bifosfato e do seu effetor TRPML1, permitindo a troca de material com a célula hospedeira. Concluindo, os nossos resultados evidenciam que o processo autofágico que ocorre na célula hospedeira tem um papel duplo durante a fase hepática da malaria. Enquanto numa fase inicial os hepatócitos usam o processo autofágico como forma de defesa contra o parasita, já durante a fase de replicação o VP funde com vesiculas autofágicas e endocíticas de forma a obter os nutrientes necessários ao seu desenvolvimento.--------- ABSTRACT: Malaria, which is caused by parasites of the genus Plasmodium, is the most deadly parasitic infection in humans. Although economic development and the implementation of control measures during the last century have erradicated the disease from many areas of the world, it remains a serious human health issue, particularly in developing countries. Malaria is transmitted by female mosquitoes of the genus Anopheles. During the mosquito blood meal, Plasmodium spp. sporozoites are injected into the skin dermis of the vertebrate host, followed by an obligatory liver stage. Upon entering the liver, Plasmodium parasites infect hepatocytes and silently replicate inside a host cell-derived parasitophorous vacuole (PV) into thousands of merozoites. These new parasite forms can infect red blood cells initiating the the blood stage of the disease which shows the characteristic febrile malaria episodes. The liver stage is the least characterized step of the malaria infection. Moreover, the interactions between the Plasmodium spp. PV and the host cell trafficking pathways are poorly understood. We dissected the interaction between Plasmodium parasites and the host cell endocytic and autophagic pathways and we found that both pathways intersect and interconnect in the close vicinity of the parasite PV, where amphisomes are formed and accumulate. Interestingly, we observed a clearance function for autophagy in hepatocytes infected with Plasmodium berghei parasites at early infection times, whereas during late liver stage development late endosomes and amphisomes are required for parasite growth. Moreover, we found the presence of internalized BSA, EGF and LC3 inside parasite vacuoles, suggesting that the parasites uptake endocytic and autophagic cargo. Furthermore, we showed that the interaction between the PV and host traffic pathways is dependent on the kinase PIKfyve, which converts the phosphoinositide PI(3)P into PI(3,5)P2, since PIKfyve inhibition caused a reduction in parasite growth. Finally, we showed that the PI(3,5)P2 effector protein TRPML1, which is involved in late endocytic and autophagic membrane fusion, is also required for parasite development. Thus, our studies suggest that the parasite parasitophorous vacuole membrane (PVM) is able to fuse with late endocytic and autophagic vesicles in a PI(3,5)P2- and TRPML1-dependent manner, allowing the exchange of material between the host cell and the parasites, necessary for the rapid development of the latter that is seen during the liver stage of infection. In conclusion, we present evidence supporting a specific and essential dual role of host autophagy during the course of Plasmodium liver infection. Whereas in the initial hours of infection the host cell uses autophagy as a cell survival mechanism to fight the infection, during the replicative phase the PV fuses with host autophagic and endocytic vesicles to obtain nutrients required for parasite growth.

Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Avaliação longitudinal das concentrações solúveis de CD40L e de marcadores hemorreológicos na doença inflamatória aguda

Actualmente a sepsis continua a ser uma das principais causas de morte durante o internamento em Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). Apesar dos recentes avanços a nível terapêutico existem ainda lacunas por preencher nomeadamente ao nível da identificação de biomarcadores que permitam um melhoramento do prognóstico tendo em conta a necessidade de identificação de doentes de maior risco. Este estudo foi realizado com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da influência de alterações na microcirculação na sepsis. Para tal foram analisados diversos parâmetros hemorreológicos, como a deformabilidade e agregação eritrocitárias, NO e GSNO eritrocitário. Foi também avaliada a relação de tais parâmetros com a inflamação e trombose através da avaliação da concentração sérica de sCD40L. O estudo incidiu sobre doentes com choque séptico (n=22) e indivíduos saudáveis (n=34). Os doentes com sepsis foram monitorizados na admissão na UCI, 24 e 72 horas depois. Verificaram-se variações longitudinais nos valores de agregação eritrocitária, cujos valores aumentam ao longo do tempo de internamento, até atingirem às 72h valores significativamente diferentes do grupo controlo. Uma tendência inversa apresenta os valores de GSNO eritrocitário, os quais estão aumentados nos doentes em choque séptico aquando da admissão à UCI, diminuindo para valores semelhantes ao grupo controlo. Observaram-se também variações nas concentrações de sCD40L, tendo sido registada uma diminuição ao longo do tempo tornando-se evidente às 72 horas após o internamento. Apesar de preliminares, a comparação entre doentes sobreviventes e não-sobreviventes permitiu inferir uma possível relação do aumento de sCD40L e diminuição de NO e GSNO eritrocitários na admissão com um pior prognóstico. Estes resultados vêm fundamentar a ideia de que existe realmente uma relação entre as alterações a nível da microcirculação e a sepsis.