5 resultados para Wolbachia pipientis, dengue virus, Aedes notoscriptus, vector competence, tissue tropism
Resumo:
A dirofilariose ainda hoje uma doena pouco conhecida da populao em geral, mas com grande importncia Mdico-Veterinria e para os proprietrios de candeos domsticos de zonas endmicas. Doena que apresenta um carcter vectorial e zoontico causada pelos nemtodes do gnero Dirofilaria spp., e que tm como hospedeiros definitivos preferenciais os candeos domsticos. A nvel europeu a incidncia desta doena tem vindo a aumentar, em especial os casos de doena provocados por Dirofilaria repens. Em Portugal, os conhecimentos epidemiolgicos que temos desta parasitose resultam de um conjunto de estudos que esporadicamente tm sido realizados. Contudo, ainda existem algumas lacunas na informao existente sobre a situao actual da dirofilariose animal e humana no nosso pas. O presente trabalho procurou actualizar a prevalncia da doena canina na regio centro de Portugal, tendo para isso sido efectuado um estudo epidemiolgico, tendo-se recolhido amostras sanguneas de 308 canideos domsticos que se encontravam alojados em canis municipais e privados. Aps a anlise das amostras, recorrendo a testes parasitolgicos e imunolgicos, foi possvel detectar uma prevalncia global 15,3% para Dirofilaria immitis. Apesar do crescente aumento europeu dos casos de dirofilariose por D. repens na Europa, este estudo tal como os que o antecederam aindam no conseguiu detectar este agente etiolgico em Portugal. No presente trabalho, foi tambm usada uma abordagem molecular, o que permitiu detectar, pela primeira em Portugal, e em ces por D. immitis, a bactria endossimbionte Wolbachia pipientis, importante na patologia de certas filrias.
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RESUMO: O Cell Fusing Agent Vrus (CFAV), considerado como o primeiro flavivrus especficos de insectos (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus hospedeiros, no replicando em clulas de vertebrados. Apesar de ter sido identificado h mais de trs dcadas (1975), a verdade que muito pouco se conhece sobre a sua biologia. Dado o seu parentesco filogentico com alguns outros flavivrus encontrados naturalmente em mosquitos de diferentes gneros colhidos em diferentes regies do globo, este vrus poder ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto, necessitam do desenvolvimento de ferramentas bsicas, tais como clones moleculares ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheam uma ou mais protenas codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antignios virais produzidos de forma recombinante. Com este trabalho pretendeu-se a optimizao de protocolos que permitiram a expresso e purificao parcial de quatro protenas [duas protenas estruturais (C e E) e duas no estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas como protenas de fuso com caudas (tags) de hexahistidina nos seus extremos carboxilo. Para a expanso do CFAV foram utilizadas clulas Aedes albopictus (C6/36). Aps a realizao da extraco do RNA viral e a obteno de cDNA, procedeu-se amplificao, por RT-PCR, das regies codificantes das protenas C, E, NS3hel e NS5B, utilizando primers especficos. Os quatro fragmentos de DNA foram independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expresso pET-28b e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de expresso. Aps da induo, expresso e purificao das protenas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas protenas produzidas atravs do mtodo Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced. In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E) and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein for c-terminal hexahistidine tags. For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS as expression host. After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the authenticity of these proteins produced.
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Intracellular, vertically transmitted bacteria form complex and intimate relationships with their hosts. Wolbachia, maternally transmitted - proteobacteria, live within the cells of numerous arthropod species. Wolbachia are famous master manipulators of insect reproduction: to favour their own spread they can induce male killing, parthenogenesis or cytoplasmic incompatibility. Wolbachia can also protect various insects from pathogens, which makes them a promising tool for the control of vector-borne diseases. Mosquitoes with Wolbachia have already been released in the wild to eliminate dengue. Yet, how Wolbachia manipulate their hosts remains largely unknown.(...)
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RESUMO: O vrus chikungunya (CHIKV) um vrus de RNA, com invlucro, da famlia Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribudo por largas regies de frica e sia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhana de sintomas com outras doenas como a dengue e a malria e a persistncia de IgM especficas, dificultam o diagnstico da infeo por CHIKV. A deteo no sangue de E3, uma glicoprotena viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimtico poder melhorar o diagnstico nos pases onde as tcnicas de biologia molecular so de difcil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnstico, esta dever ser expressa em quantidade, purificada e usada para produo de anticorpos especficos. Para expressar E3 numa forma solvel, suscetvel de ser purificada num nico passo cromatogrfico sem proteases, recorreu-se estratgia da fuso com o domnio de ligao quitina (CBD)-intena (IMPACT System, NEB). A sequncia codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma protena de fuso insolvel de 64 kDa. A expresso a 12C induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-intena-E3. A aplicao de lisados celulares em colunas de quitina originou a reteno de CBD-intena-E3 na matriz. Porm, a autoclivagem da intena na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a protena E3 separada no eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de nquel permitiram a eluio de uma protena de 9 kDa, compatvel com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da protena de 9 kDa ser confirmada pela induo de anticorpos com esta preparao e reatividade daqueles com clulas infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12C and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30C, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.
