Mediterranean spotted fever and identification of new agents of rickettsioses in Portugal : epidemiological determinants, host and microbial features in portuguese patients

Resumo: a febre botonosa, também conhecida por febre escaro-nodular (FEN) é uma doença endémica nos Países da bacia do Mediterrâneo, África, Médio Oriente, Índia e Paquistão. O agente etiológico responsável por esta patologia é a bactéria Rickettsia conorii. Contudo, em alguns países, como Portugal e Itália, esta patologia é causada por duas estirpes diferentes: R conorii Malish e R conorii Israeli spotted fever strain. O principal vector e reservatório é o ixodídeo Rhipicephalus sanguineus. Mesmo com uma elevada taxa de subnotificação detectada no nosso País, a taxa incidência da FEN é de 8.4/105 habitantes (1989-2005), uma das mais altas quando comparada coom a de outros países da bacia do Mediterrâneo. De todos os distritos portugueses, Bragança e Beja são aqueles que apresentam as taxas de incidência mais elevadas, 56,8/105 habitantes e 47,4 / 105 habitantes respectivamente. Em Portugal, as alterações climáticas verificadas na última década, nomeadamente a subida das temperaturas médias anuais, parecem ter influenciado o ciclo de vida do vector e a sua dinâmica sazonal, permitindo ao R. sanguineus completar mais de um ciclo de vida por ano. Este facto, e a possibilidade deste vector se manter activo noutros meses do ano, nomeadamente nos meses de inverno, tem influenciado consequentemente o padrão de distribuição anual dos casos de FEN. A febre escaro-nodular caracteriza-se clinicamente como uma doença exantemática, com um processo de vasculite generalizado. Apesar de na generalidade ser considerada uma doença benigna (quando tratada atempadamente e com terapêutica adequada e específica)e de estarem descritos casos graves em cerca de 5-6% dos doentes, em Portugal essa percentagem aumentou e consequentemente levou a um aumento de casos fatais. Este facto tornou-se mais evidente em 1997, no Hospital Distrital de Beja e no Hospital Garcia de Orta, onde a taxa de letalidade atingiu os 32% e 18% respectivamente.Para além dos factores de co-morbilidade encontrados nos doentes mais graves, como diabetes mellitus, ou o atraso na instituição da terapêutica específica, foi colocada de que a estirpe R. conorii Israel spotted fever strain pudesse ser mais virulenta ou então estivesse associada a diferentes manifestações clínicas que dificultassem o diagnóstico clínico e a instituição atempada da terapêutica. Houve ainda a necessidade de avaliar alguns parâmetros imunológicos dos doentes e tentar identificar que factores, nomeadamente que citoquinas, poderiam estar envolvidos na resposta a uma infecção por R.conorii.Face a estas questões foi avaliada e comparada a epidemiologia, manifestações clínicas e laboratoriais de 140 doentes (71 infectados com R. conorii Malish e 69 infectados com R. conorii Israel spotted fever strain). Concluiu-se que existe uma sobreposição de manifestações clinicas entre os dois grupos de doentes, mas que a percentagem da escara de inoculação é significativamente inferior em doentes infectados com R. conorii Israel spotted fever strain. Dos resultados mais importantes encontrados neste estudo concluiu-se que a estirpe R. conorii Malish e é demonstrado, pela primeira vez, estatisticamente que o alcoolismo é um factor de risco para a morte de doentes com FEN. Associadas a factores de um mau prognósitco da doença, estão as manifestações gastrointestinais, que poderão ser ou não reflexo de alterações do sistema nervoso central, e ainda a alteração de parâmetros laboratoriais como a presença de hiperbilirubinemia e aumento dos valores da ureia.A maior parte dos estudos realizados sobre os mecanismos da resposta imunitária à infecção por R. conorii e as interacções hospedeiro - agente etiológico têm sido elucidados com base em modelos animais. Poucos estudos têm sido efectuados em doentes e nenhum estudo prévio tinha sido realizado no sentido de avaliar localmente (escara/pele) quais os mediadores ou outras moléculas envolvidas na resposta imunitária às rickettsioses. Foi avaliado o nível de expressão génica de RNA mensageiro (RNAm)de diferentes citoquinas em amostras de pele de doentes com FEN pela técnica de PCR em tempo real.Os resultados deste estudo mostraram que, quando comparado com o grupo controlo, os 23 doentes analisados apresentavam níveis estatisticamente significativos, mais elevados de expressão génica de interferão (IFN-γ, Tumor necrosis factor (TFN-α, interleucina 10 (IL-10, RANTES (regulated by activation, normal T-cell-expressed and secreted chemokine)e indolamina 2-3 desoxigenase (IDO),uma enzima envolvida no controlo e limitação do crescimento intracelular das rickettsias, através da degradação do triptofano. Seis dos 23 doentes apresentaram ainda niveis de expressão elevados de óxido nítrico indutível (iNOS)que actua como microbicida. Encontrou-se uma correlação positiva entre a expressão de RNAm de TNF-α, γ, iNOS e IDO e os casos menos graves de FEN sugerindo um tipo de resposta imunitária tipo Th1, i.e. com papel protector na resposta à infecção.Verificou-se também que os valores de expressão genética do RNAm de IL-10, estavam inversamente correlacionados com a expressão do RNAm de TNF-α e IFN-γ. Os casos menos graves de FEN parecem assim envolver um balanço entre a resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória. Já os níveis de expressão génica do RNAm de IL-10 estavam inversamente correlacionados com a expressão RNAm de TNF-α e IFN-γ. Os casos menos graves de FEN parecem assim envolver um balanço entre uma resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória. Já os níveis de expressão RNAm da quimoquina RANTES foram estatisticamente mais elevados em doentes graves.Nesta dissertação é ainda descrita uma nova rickettsiose presente em Portugal, causada pela bactéria R. sibirica mongolitimonae, que foi identificada laboratorialmente por isolamento do agente, e por detecção do DNA em biopsia de pele. A presença deste agente foi ainda corroborada pela detecção em paralelo do mesmo agente no ixodídeos como R. africae like e em pulgas como R. felis e R.typhi alertam para a possibilidade de existência de outras rickettsioses que possam estar diagnosticadas em Portugal. Abstract: Mediterranean spotted fever (MSF), a tick-borne disease caused by Rickettsia conorii, is widley distributed in the Old World, being endemic in the southern Europe, Africa, Middle East, India and Pakistan. In Portugal two strains cause disease: R.conorii Malish and R.conorii Israeli spotted fever.Rhipicephalus sanguineus, the brown dog tick, is considered the main vector and reservoir. MSF is characterized by seasonality, and most of cases are encountered in late spring and summer, peaking in July and August. However, CEVDI/INSA laboratory has observed that the incidence of MSF cases has changed during winter season.The increasing annual averages of air temperatures and warmer and drier winters might have influenced the dynamics of the life cycle and activity of R. sanguineus, and indirectley the number MSF cases during the so called MSF off-season.In the period of 1989-2005, the incidence rate of MSF was 8.4/105 inhabitants, one of the highest rates compared with other endemic countries. In the Portugal during the same period, the highest incidence rates were reported in the districts of Bragança, with 56.8/105 inhabitants, and Beja, with 47.4/105 inhabitants. Severe cases of MSF are reported in 6% of the patients, but it seems that this pattern of disease in Portugal has been changing.This factor became more evident in 1997, with a reported case fatality rate of 32% and 18% in patients with MSF admited at Beja and Garcia Orta Hospitals, respectively. Although it was found that diabetes mellitus and delay in therapy have been implicated as a risk factor for death, the hypothesis was considered, that the new ISF strain isolated from Portugueses patients in the same year (1997)causes different or atypical clinical conorii Malish strain. The local (skin biopsies) immune response to R. conorii infection was also evaluated.A prospective study was performed to characterized epidemiological, clinical, laboratory features and determined risk factors for a fatal outcome. One hundred forty patients (51% patients were infected with Rickettsia conorii Malish stain and 49% with Israeli spotted fever strain)with diagnosis documented with identification of the causative rickettsial strain were admitted to 13 Portugueses Hospitals during 1994-2006.Comparison of the clinical manifestations of MSF caused by Malish and ISF strains revealed tremendous overlap that would not permit clinical recognition of the strain envolved, but an eschar was observed in a significantly higher percentage of patients with Malish than ISF strain.A fatal outcome was significantly more likely for patients with ISF strain infection meaning that ISF strain was more virulent than Malish strain, and also alcoholism was a host risk factor for a fatal outcome.The pathophysiology of a fatal outcome involved significantly greater incidence of petechial rash, gastrointestinal symptoms, confusion/obtundation, dehydration, tachypnea, hepatomegaly, leukocytosis, coagulopathy, azotemia, hyperbilirubinemia, and elevated hepatic enzymes and creatine kinase. Multivariate analysis revealed that acute renal failure and hyperbilirubinemia were most strong associated with a fatal oucome of infections with both strains.The immune response to R. conorii infection determined with both strains. The immune response to R. conorii infection determined by the expression levels of inflammatory and immune mediators in skin biopsies collected from untreated patients with Mediterranean spotted fever reveal that intralesional expression of mRNA of TNF-α, IFN-γ, IL-10, RANTES, and indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO)an enzyme involved in limiting rickettsial growth by tryptophan degradation, were elevated in skin of MSF patients compared to controls. Six patients had elevated levels of inducible nitric oxide synthase (NOS2, a source microbicidal nitric oxide.Positive correlations among TNF-α, IFN-γ, NOS2,IDO and mild-to-moderate disease suggested that type 1 polarization plays a protective role. Significantly high levels of intralesional IL-10 were inversely correlated with IFN-γ and TNF-α. The chemokine RANTES was significantly higher in patients with several MSF. It seems that MSF patients with mild-to-moderate disease have a strong and balanced intralesional pro-inflammatory and anti-inflammatory response, while severe disease is associated with higher chemokine expression.Whether these findings are simply a correlate of mild and severe disease or contribute to anti-rickettsial immunity and pathogenesis remains to be determined.In this dissertation is also described a new rickettsiois present in Portugal caused by R.sibirica mongolitimonae strain, identified based on agent isolation and DNA detection by PCR technique in a skin biopsy.The presence of this agent corroborated by its detection also in Rhipicephalus pusillus tick. Also, pathogenic tick and flea-borne rickettsial agents such as R. africae strain detected in Rhipicephalus bursa tick, and R.felis and R.typhi detected in different fleas species raise the alert for the possible existence of other rickettsioses in Portugal that might be underdiagnosed.

Strategies of the African swine fever virus to manipulate innate immunity

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Vigilância activa de eventos após vacinação

A vigilância de efeitos indesejáveis após a vacinação é complexa. Existem vários actores de confundimento que podem dar origem a associações espúrias, meramente temporais mas que podem provocar uma percepção do risco alterada e uma consequente desconfiança generalizada acerca do uso das vacinas. Com efeito as vacinas são medicamentos complexos com características únicas cuja vigilância necessita de abordagens metodológicas desenvolvidas para esse propósito. Do exposto se entende que, desde o desenvolvimento da farmacovigilância se tem procurado desenvolver novas metodologias que sejam concomitantes aos Sistemas de Notificação Espontânea que já existem. Neste trabalho propusemo-nos a desenvolver e testar um modelo de vigilância de reacções adversas a vacinas, baseado na auto-declaração pelo utente de eventos ocorridos após a vacinação e testar a capacidade de gerar sinais aplicando cálculos de desproporção a datamining. Para esse efeito foi constituída uma coorte não controlada de utentes vacinados em Centros de Saúde que foram seguidos durante quinze dias. A recolha de eventos adversos a vacinas foi efectuada pelos próprios utentes através de um diário de registo. Os dados recolhidos foram objecto de análise descritiva e análise de data-mining utilizando os cálculos Proportional Reporting Ratio e o Information Component. A metodologia utilizada permitiu gerar um corpo de evidência suficiente para a geração de sinais. Tendo sido gerados quatro sinais. No âmbito do data-mining a utilização do Information Component como método de geração de sinais parece aumentar a eficiência científica ao permitir reduzir o número de ocorrências até detecção de sinal. A informação reportada pelos utentes parece válida como indicador de sinais de reacções adversas não graves, o que permitiu o registo de eventos sem incluir o viés da avaliação da relação causal pelo notificador. Os principais eventos reportados foram eventos adversos locais (62,7%) e febre (31,4%).------------------------------------------ABSTRACT: The monitoring of undesirable effects following vaccination is complex. There are several confounding factors that can lead to merely temporal but spurious associations that can cause a change in the risk perception and a consequent generalized distrust about the safe use of vaccines. Indeed, vaccines are complex drugs with unique characteristics so that its monitoring requires specifically designed methodological approaches. From the above-cited it is understandable that since the development of Pharmacovigilance there has been a drive for the development of new methodologies that are concomitant with Spontaneous Reporting Systems already in place. We proposed to develop and test a new model for vaccine adverse reaction monitoring, based on self-report by users of events following vaccination and to test its capability to generate disproportionality signals applying quantitative methods of signal generation to data-mining. For that effect we set up an uncontrolled cohort of users vaccinated in Healthcare Centers,with a follow-up period of fifteen days. Adverse vaccine events we registered by the users themselves in a paper diary The data was analyzed using descriptive statistics and two quantitative methods of signal generation: Proportional Reporting Ratio and Information Component. themselves in a paper diary The data was analyzed using descriptive statistics and two quantitative methods of signal generation: Proportional Reporting Ratio and Information Component. The methodology we used allowed for the generation of a sufficient body of evidence for signal generation. Four signals were generated. Regarding the data-mining, the use of Information Component as a method for generating disproportionality signals seems to increase scientific efficiency by reducing the number of events needed to signal detection. The information reported by users seems valid as an indicator of non serious adverse vaccine reactions, allowing for the registry of events without the bias of the evaluation of the casual relation by the reporter. The main adverse events reported were injection site reactions (62,7%) and fever (31,4%).

Gas emissions on rice culture and its importance on air quality

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente Perfil Gestão de Sistemas Ambientais

Legionella em meio hospitalar : qual a eficácia dos programas de prevenção nos hospitais da Região de Lisboa e Vale do Tejo : manutenção, limpeza e desinfeção de sistemas e

RESUMO - A legionella em meio hospitalar tem sido alvo de preocupação e de várias discussões, sendo esta uma bactéria patogénica que coloniza vários tipos de ambientes aquáticos (naturais e artificiais). Estas bactérias têm a particularidade de se desenvolver em meio aquático mas a infeção apenas é transmitida através de aerossóis de água contaminada, ou seja, por via aérea. Não se transmitindo de pessoa para pessoa. Pelas suas características os sistemas de arrefecimento de ar, nomeadamente as torres de arrefecimento, condensadores evaporativos, humidificadores e sistemas de ar condicionado, são fontes importantes de disseminação da legionella. Assim surge a necessidade da existência de programas de prevenção, que deverão ter em conta uma adequada manutenção, limpeza e desinfeção. Dada a quantidade de frequentadores assim como da especificidade dos mesmos, em meio hospitalar é particularmente importante a eficácia destes sistemas. Ou seja, os sistemas de arrefecimento em hospitais devem, para além de garantir o conforto térmico, ser responsáveis por manter a qualidade do ar e reduzir os riscos existentes a ele associados. O presente estudo pretende conhecer a verdadeira eficácia dos programas de manutenção e vigilância da Legionella, apenas nos sistemas de arrefecimento. Trata-se então de um estudo exploratório, descritivo recolha desta informação in-loco dos sistemas em estudo, de X hospitais da cidade de Lisboa. Na metodologia serão utilizadas grelhas de observação e resultados de colheita de água dos locais de maior risco. A realização deste estudo visa obter um retrato do panorama existente e contribuir para o início de novos estudos epidemiológicos.

Evaluation of pathogenic potential of Aeromonas spp. strains using in vitro methodologies

Dissertation to obtain a Master Degree in Molecular Genetics and Biomedicine

Extension and patterning of the vertebrate body

Dissertation presented to obrain the Ph.D degree in Biology. Developmental Biology

Role of Notch signaling on the differentiation of early lymphoid progenitors cells: a view throughout the development of the embryonic chicken thymus and spleen

Dissertação para a obtenção do grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Manipulation of host cell functions by Salmonella: the role of the bacterial effector protein SteA

Salmonella enterica serovars are Gram-negative facultative intracellular bacterial pathogens that infect a wide variety of animals. Salmonella infections are common in humans, causing usually typhoid fever and gastrointestinal diseases. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), which is a leading cause of human gastroenteritis, has been extensively used to study the molecular pathogenesis of Salmonella, because of the availability of sophisticated genetic tools, and of suitable animal and tissue culture models mimicking different aspects of Salmonella infections.(...)