70 resultados para Transtornos linfoproliferativos crônicos. Imunofenotipagem. Sistema imune. Linfoma.
Resumo:
Abstract The investigation of the web of relationships between the different elements of the immune system has proven instrumental to better understand this complex biological system. This is particularly true in the case of the interactions between B and T lymphocytes, both during cellular development and at the stage of cellular effectors functions. The understanding of the BT cells interdependency and the possibility to manipulate this relationship may be directly applicable to situations where immunity is deficient, as is the case of cancer or immune suppression after radio and chemotherapy. The work presented here started with the development of a novel and accurate tool to directly assess the diversity of the cellular repertoire (Chapter III). Contractions of T cell receptor diversity have been related with a deficient immune status. This method uses gene chips platforms where nucleic acids coding for lymphocyte receptors are hybridized and is based on the fact that the frequency of hybridization of nucleic acids to the oligonucleotides on a gene chip varies in direct proportion to diversity. Subsequently, and using this new method and other techniques of cell quantification I examined, in an animal model, the role that polyclonal B cells and immunoglobulin exert upon T cell development in the thymus, specifically on the acquisition of a broader repertoire diversity by the T cell receptors (Chapter IV and V). The hypothesis tested was if the presence of more diverse peptides in the thymus, namely polyclonal immunoglobulin, would induce the generation of more diverse T cells precursors. The results obtained demonstrated that the diversity of the T cell compartment is increased by the presence of polyclonal immunoglobulin. Polyclonal immunoglobulin, and particularly the Fab fragments of the molecule, represent the most diverse self-molecules in the body and its peptides are presented by antigen presenting cells to precursor T cells in the thymus during its development. This probably contributes significantly to the generation of receptor diversity. Furthermore, we also demonstrated that a more diverse repertoire of T lymphocytes is associated with a more effective and robust T cell immune function in vivo, as mice with a more diverse T cell receptors reject minor histocompatiblility discordant skin grafts faster than mice with a shrunken T cell receptor repertoire (Chapter V). We believe that a broader T cell receptor diversity allows a more efficient recognition and rejection of a higher range of external and internal aggressions. In this work it is demonstrated that a reduction of TCR diversity by thymectomy in wild type mice significantly increased survival of H-Y incompatible skin grafts, indicating decrease on T cell function. In addiction reconstitution of T-cell diversity in mice with a decreased T cell repertoire diversity with immunoglobulin Fab fragments, lead to a increase on TCR diversity and to a significantly decreased survival of the skin grafts (Chapter V). These results strongly suggest that increases on T cell repertoire diversity contribute to improvement of T cell function. Our results may have important implications on therapy and immune reconstitution in the context of AIDS, cancer, autoimmunity and post myeloablative treatments. Based on the previous results, we tested the clinical hypothesis that patients with haematological malignancies subjected to stem cell transplantation who recovered a robust immune system would have a better survival compared to patients who did not recover such a robust immune system. This study was undertaken by the examination of the progression and overall survival of 42 patients with mantle cell non-Hodgkin lymphoma receiving autologous hematopoietic stem cell transplantation (Chapter VI). The results obtained show that patients who recovered higher numbers of lymphocytes soon after autologous transplantation had a statistically significantly longer progression free and overall survivals. These results demonstrate the positive impact that a more robust immune system reconstitution after stem cell transplantation may have upon the survival of patients with haematological malignancies. In a similar clinical research framework, this dissertation also includes the study of the impact of recovering normal serum levels of polyclonal immunoglobulin on the survival of patients with another B cell haematological malignancy, multiple myeloma, after autologous stem cell transplantation (Chapter VII). The relapse free survival of the 110 patients with multiple myeloma analysed was associated with their ability to recover normal serum levels of the polyclonal compartment of immunoglobulin. These results suggest again the important effect of polyclonal immunoglobulin for the (re)generation of the immune competence. We also studied the impact of a robust immunity for the response to treatment with the antibody anti CD20, rituximab, in patients with non- Hodgkins lymphoma (NHL) (Chapter VIII). Patients with higher absolute counts of CD4+ T lymphocytes respond better (in terms of longer progression free survival) to rituximab compared to patients with lower number of CD4+ T lymphocytes. These observations highlight again the fact that a competent immune system is required for the clinical benefit of rituximab therapy in NHL patients. In conclusion, the work presented in this dissertation demonstrates, for the first time, that diverse B cells and polyclonal immunoglobulin promote T cell diversification in the thymus and improve T lymphocyte function. Also, it shows that in the setting of immune reconstitution, as after autologous stem cell transplantation for mantle cell lymphoma and in the setting of immune therapy for NHL, the absolute lymphocyte counts are an independent factor predicting progression free and overall survival. These results can have an important application in the clinical practice since the majority of the current treatments for cancer are immunosuppressive and implicate a subsequent immune recovery. Also, the effects of a number of antineoplastic treatments, including biological agents, depend on the immune system activity. In this way, studies similar to the ones presented here, where methods to improve the immune reconstitution are examined, may prove to be instrumental for a better understanding of the immune system and to guide more efficient treatment options and the design of future clinical trials. Resumo O estudo da rede de inter-relaes entre os diversos elementos do sistema immune tem-se mostrado um instrumento essencial para uma melhor compreenso deste complexo sistema biolgico. Tal particularmente verdade no caso das interaces entre os linfcitos B e T, quer durante o desenvolvimento celular, quer ao nvel das funes celulares efectoras. A compreenso da interdependncia entre linfcitos B e T e a possibilidade de manipular esta relao pode ser directamente aplicvel a situaes em que a imunidade est deficiente, como o caso das doenas neoplsicas ou da imunossupresso aps radio ou quimioterapia. O trabalho apresentado nesta dissertao iniciou-se com o desenvolvimento de um novo mtodo laboratorial para medir directamente a diversidade do reportrio celular (Captulo III). Redues da diversidade do reportrio dos receptores de clulas T tm sido relacionadas com um estado de imunodeficincia. O mtodo desenvolvido utiliza gene chips, aos quais hibridizam os cidos nucleicos codificantes das cadeias proteicas dos receptores linfocitrios. A diversidade calculada com base na frequncia de hibridizao do cido nucleico da amostra aos oligonucletidos presentes no gene chip. De seguida, e utilizando este novo mtodo e outras tcnicas de quantificao celular examinei, num modelo animal, o papel que as clulas policlonais B e a imunoglobulina exercem sobre o desenvolvimento linfocitrio T no timo, especificamente na aquisio de um reportrio diverso de receptores T (Captulos IV e V). Testei, ento, a hiptese de que a presena no timo de pptidos mais diversos, como a imunoglobulna policlonal, induzisse a gnese de precursores T mais diversos. Demonstrmos que a diversidade do compartimento T aumentado pela presena de imunoglobulina policlonal. A imunoglobulina policlonal, e particularmente os fragmentos Fab desta molcula, representam as molculas autlogas mais diversas presentes nos organismos vertebrados. Estes pptidos so apresentados por clulas apresentadoras de antignio s clulas precursoras T no timo, durante o desenvolvimento celular T. Tal, provavelmente, contribui para a gnese da diversidade dos receptores. Tambm demonstrmos que a presena de um reportrio mais diverso de linfcitos T se associa a um incremento da funo imunolgica T in vivo. Uma diversidade de receptores T mais extensa parece permitir um reconhecimento e rejeio mais eficientes de um maior nmero de agressores internos e externos. Demonstrmos que ratinhos com receptores de clulas T (RCT) com maior diversidade rejeitam transplantes cutneos discordantes para antignios minor de histocompatibilidade mais rapidamente do que ratinhos com um menor reportrio T (Captulo V). Por outro lado, uma reduo da diversidade do RCT, causada por timectomia de ratinhos de estirpes selvagens, mostrou aumentar significativamente a sobrevivncia de transplantes cutneos incompatveis para o antignio H-Y (antignio minor de histocompatibilidade), indicando uma diminuio da funo linfocitria T. Alm disso, a reconstituio da diversidade dos linfcitos T em ratinhos com uma diversidade de reportrio T diminuda, induzida pela administrao de fragmentos Fab de imunoglobulina, conduz a um aumento da diversidade dos RCT e a uma diminuio significativa da sobrevivncia dos enxertos cutneos (Captulo V). Estes resultados sugerem que o aumento do reportrio de clulas T contribui para uma melhoria das funes celulares T e podero ter implicaes importantes na teraputica e reconstitutio imunolgica em contexto de SIDA, neoplasias, autoimunidade e aps tratamentos mieloablativos. Baseado nos resultados anteriores, decidimos testar a hiptese clnica de que doentes com neoplasias hematolgicas sujeitos a transplantao de precursores hematopoiticos e com recuperao imunolgica precoce aps transplante teriam uma sobrevivncia mais longa do que doentes que no recuperassem to bem a sua imunidade. Analismos a sobrevivncia global e sobrevivncia sem doena de 42 doentes com linfoma no Hodgkin de clulas do manto sujeitos a transplante autlogo de precursores hematopoiticos (Captulo VI). Os resultados obtidos mostraram que os doentes que recuperaram contagens mais elevadas de linfcitos imediatamente aps o transplante autlogo, apresentaram uma sobrevivncia global e sem progresso mais longa do que doentes que no recuperaram contagens linfocitrias to precocemente. Estes resultados demonstram o efeito positivo de uma reconstitutio imunolgica robusta aps transplante de presursores hematopoiticos, sobre a sobrevivncia de doentes com neoplasias hematolgicas. Do mesmo modo, estudmos o efeito que a recuperao de nveis sricos normais de imunoglobulina policlonal tem na sobrevivncia de doentes com outras neoplasias hematolgicas de linfcitos B, como o mieloma mltiplo,aps transplante autlogo de precursos hematopoiticos (Captulo VII). A sobrevivncia livre de doena dos 110 doentes com mieloma mltiplo analizados est associada com a sua capacidade de recuperar nveis sricos normais do compartmento policlonal de imunoglobulina. Estes resultados pioneiros indicam a importncia da imunoglobulina policlonal para a gnese de competncia imunolgica. Tambm estudmos o impacto de um sistema imunitrio eficiente sobre a resposta ao tratamento com o anticorpo anti CD20, ituximab, em doentes com linfoma no Hodgkin (LNH) (Captulo VIII). Os resultados mostram que doentes com valores mais elevados de linfcitos T CD4+ respondem melhor (em termos de maior sobrevida livre de doena) ao rituximab, do que doentes com valores mais baixos. Estas observaes ilustram a necessidade de um sistema imunitrio competente para o benefcio clnico da teraputica com rituximab em doentes com LNH. Em concluso, o trabalho apresentado nesta dissertao demonstra que as clulas B e a imunoglobulina policlonal promovem a diversidade das clulas T no timo e melhoram a funo linfocitria T perifrica. Concomitantemente, tambm demonstrmos que, no contexto de reconstituio imune, por exemplo, aps transplante autlogo de precursores hematopoiticos em doentes com linfomas de clulas do manto, o nmero absoluto de linfcitos uma factor independente da sobrevivncia. Os resultados demonstram, tambm, a importncia dos valores de linfocitos T na resposta ao tratamento com rituximab no caso de doentes com LNH. O mesmo princpio se prova pelo facto de que doentes com mieloma mltiplo sujeitos a transplante autlogo de precursores hematopoiticos que recuperam valores normais sricos de imunoglobulinas policlonais, terem melhores taxas de resposta em comparao com doentes que no recuperam valores normais de imunoglobulinas policlonais. Estes resultados podem ter importantes aplicaes na prtica clnica dado que a maioria dos tratamentos de doenas neoplsicas implica imunossupresso e, subsequente, recuperao imunolgica. Estes estudos podem ser um instrumento fundamental para uma melhor compreenso do sistema imune e guiar uma escolha mais eficiente de opes teraputicas bem como contribuir para a concepo de futuros estudos clnicos.
Resumo:
A identificao e caracterizao de processos mediados por metaloproteinases de uma grande variedade de eucariotas est a avanar rapidamente, tanto a nvel molecular como celular e os muitos papis que as proteases desempenham nestes organismos esto a ser trazidas para o foco. As metaloproteinases de matriz executam tarefas de housekeeping comuns a muitos organismos, bem como funcionam a um nvel muito mais especfico no ciclo de vida dos parasitas, por exemplo. Papis pivotais foram propostos em diferentes processos, como invaso e egresso de clulas, enquistao e desenquistao, catabolismo de protenas, diferenciao, progresso do ciclo celular, citoaderncia, e ainda estimulao e evaso ao sistema imune. No presente estudo, feito o reconhecimento e a caracterizao de metaloproteinases de dois diferentes extractos de parasitas protozorios: Trypanosoma brucei brucei e Leishmania infantum. A classificao de metaloproteases foi obtida a partir da inibio diferencial da actividade destas proteases sobre diferentes substratos (gelatina e casena), tendo sido efectuada uma prospeco de inibidores selectivos com potencial para serem empregues em novas estratgias de quimioterpeutica contra estes agentes. Adicionalmente, feito um estudo bioinformtico sobre uma metaloproteinase comum aos parasitas aqui abordados, alargando o estudo a outros organismos relacionados. Os resultados obtidos demonstram a presena de metaloproteinases capazes de degradar protenas de matriz em ambos os extractos estudados, sendo possvel inibir a sua actividade com concentraes relativamente moderadas de inibidores. Alm disso, sugerem que em todos os eventos patolgicos abordados neste estudo, a presena de metaloproteinases activas estvel no seu ciclo de vida e provavelmente na progresso da patologia provocada pelos diferentes agentes em estudo. A anlise de todos os resultados e observaes poder possivelmente levar identificao e integrao de elementos comuns nos processos de invaso celular e progresso parasitria aqui abordados. Por essa razo, a compreenso destas interaces permanece um desafio importante.
Resumo:
RESUMO: O processo de glicosilao a modificao ps-traducional de protenas mais comum e est envolvido em vrios processos fisiolgicos e patolgicos. Especificamente, certos perfis glicosdeos esto correlacionados a estados especficos de diferenciao celular, e podem modular vrios eventos celulares, como sinalizao celular, migrao celular e interaes hospedeiro-patognio. Assim sendo, a glicosilao desempenha um papel crucial na modulao de vrios processos imunolgicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosdicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosdicas terminais que esto modificadas pela ligao de cido silico desempenham um papel importante em vrias funes do sistema imune, nomeadamente migrao leucocitria em contexto de inflamao e ativao de clulas imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expresso de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho est dividido em trs componentes principais: 1) A imunidade est amplamente dependente da habilidade das clulas circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligao de leuccitos Eselectina endotelial o primeiro passo. Assim, ns analismos a estrutura e funo dos ligandos de E-selectina que so expressos pelas clulas humanas mononucleares de sangue perifrico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreenso dos intervenientes moleculares que mediam a ligao dos moncitos, clulas CD4+ e CD8+T e clulas B ao endotlio vascular. Surpreendentemente, os moncitos apresentaram maior capacidade de ligao E-selectina comparativamente aos linfcitos. Esta observao pode ser explicada pelo facto de os moncitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportrio de glicoprotenas que exibem afinidade de ligao E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adio j previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populaes linfocitrias apresentam de se ligar E-selectina, est integralmente relacionada com a sua expresso de glicoprotenas com afinidade de ligao E-selectina. Enquanto que as clulas CD4+T apresentam uma elevada reatividade E-selectina, as clulas CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligao E-selectina. Esta atividade de ligao E-selectina das clulas CD4+T conferida pela expresso de HCELL, em adio s j previamente reportadas CLA e CD43E. As clulas CD8+ T no expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as clulas B no expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilao da superfcie destas clulas, levou ao dramtico aumento da expresso dos ligandos de E-selectina em todos as populaes leucocitrias, verificando-se que a criao de certos ligandos de E-selectina est dependente do tipo de clula, aps fucosilao. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o trfico das clulas mononucleares de sangue perifrico em contexto de inflamao. 2) A habilidade das clulas dendrticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamao crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analismos a estrutura e funo das molculas de adeso que mediam a migrao transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciao de moncitos (mo-DCS), obtidos quer pelo mtodos de separao imuno-magntica de clulas CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderncia ao plstico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligao Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 so expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. importante notar que a ligao do CD44 nas mo-DCs, mas no nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativao e consequente adeso da VLA-4 ao endotlio na ausncia de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se tambm anlise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de moncitos do sangue do cordo umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs no expressam qualquer glicoprotena com reatividade E-selectina. Alm disso, a exofucosilao das mo- DCs humanas utilizando uma (1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expresso de HCELL e, portanto, estas clulas apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem E-selectina em condies de fluxo hemodinmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratgias para potenciar a expresso de HCELL podero impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamao. 3) Outro obstculo para alcanar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs o estabelecimento de abordagens eficientes que podero melhorar o estado de maturao e apresentao antignica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstculo. Atravs da remoo de cido silico de superfcie celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturao de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferao de clulas T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte especfica de clulas tumorais. Em adio, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentao cruzada de antignios tumorais s clulas T citotxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma viso chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitrias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase uma nova tecnologia para melhorar a eficcia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilao e a sua manipulao podem modular a imunidade. Concretamente, atravs de uma reao de exofucosilao conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leuccitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoo dos nveis de cido silico da superfcie celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por clulas T citotxicas. ------------------------------------ ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an (1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites. 3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.
Resumo:
RESUMO:O processo de glicosilao a modificao ps-traducional de protenas mais comum e est envolvido em vrios processos fisiolgicos e patolgicos. Especificamente, certos perfis glicosdeos esto correlacionados a estados especficos de diferenciao celular, e podem modular vrios eventos celulares, como sinalizao celular, migrao celular e interaes hospedeiro-patognio. Assim sendo, a glicosilao desempenha um papel crucial na modulao de vrios processos imunolgicos. No entanto, permanece por esclarecer como as estruturas glicosdicas influenciam a imunidade. Especificamente, algumas estruturas glicosdicas terminais que esto modificadas pela ligao de cido silico desempenham um papel importante em vrias funes do sistema imune, nomeadamente migrao leucocitria em contexto de inflamao e ativao de clulas imunes. Como tal, este trabalho teve como objectivo investigar como a expresso de certos glicanos influencia componentes importantes da resposta imune inata e adaptativa. Este trabalho est dividido em trs componentes principais: 1) A imunidade est amplamente dependente da habilidade das clulas circulantes migrarem para os tecidos inflamados, sendo que a ligao de leuccitos Eselectina endotelial o primeiro passo. Assim, ns analismos a estrutura e funo dos ligandos de E-selectina que so expressos pelas clulas humanas mononucleares de sangue perifrico (PBMCs), fornecendo novos conhecimentos para a compreenso dos intervenientes moleculares que mediam a ligao dos moncitos, clulas CD4+ e CD8+T e clulas B ao endotlio vascular. Surpreendentemente, os moncitos apresentaram maior capacidade de ligao E-selectina comparativamente aos linfcitos. Esta observao pode ser explicada pelo facto de os moncitos humanos expressarem, uniformemente, um vasto reportrio de glicoprotenas que exibem afinidade de ligao E-selectina, nomeadamente: as glicoformas do CD43 (CD43E) e do CD44 (HCELL), em adio j previamente reportada glicoforma da PSGL-1 (CLA). Consistentemente, a diferente capacidade que as diversas populaes linfocitrias apresentam de se ligar E-selectina, est integralmente relacionada com a sua expresso de glicoprotenas com afinidade de ligao E-selectina. Enquanto que as clulas CD4+T apresentam uma elevada reatividade E-selectina, as clulas CD8+T e B demonstram pouca ou nenhuma capacidade de ligao E-selectina. Esta atividade de ligao E-selectina das clulas CD4+T conferida pela expresso de HCELL, em adio s j previamente reportadas CLA e CD43E. As clulas CD8+ T no expressam HCELL e apenas expressam pequenas quantidades de CLA e CD43E, enquanto que as clulas B no expressam ligandos de Eselectina. Mais, a exofucosilao da superfcie destas clulas, levou ao dramtico aumento da expresso dos ligandos de E-selectina em todos as populaes leucocitrias, verificando-se que a criao de certos ligandos de E-selectina est dependente do tipo de clula, aps fucosilao. Colectivamente, estes resultados redefinem o nosso conhecimento acerca dos mecanismos moleculares que governam o trfico das clulas mononucleares de sangue perifrico em contexto de inflamao. 2) A habilidade das clulas dendrticas (DCs) para extravasarem em locais de inflamao crucial para o sucesso da terapia com DCs. Assim, analismos a estrutura e funo das molculas de adeso que mediam a migrao transendotelial (TEM) das DCs. Para isso, foram usadas DCs geradas a partir da diferenciao de moncitos (mo-DCS), obtidos quer pelo mtodos de separao imuno-magntica de clulas CD14+ (CD14-S) ou por isolamento por aderncia ao plstico (PA-S). Os resultados obtidos indicam que as glicoformas de ligao Eselectina de PSGL-1, CD43 e CD44 so expressas pelas CD14-S mo-DCs, enquanto que as PA-S mo-DCs expressam apenas CLA. importante notar que a ligao do CD44 nas mo-DCs, mas no nas PA-S mo-DCs, desencadeia a ativao e consequente adeso da VLA-4 ao endotlio na ausncia de um gradiente de quimiocinas. Procedeu-se tambm anlise dos ligandos E-selectina expressos em mo-DCs geradas a partir de moncitos do sangue do cordo umbilical (UCB) e, inesperadamente, as UCB mo-DCs no expressam qualquer glicoprotena com reatividade E-selectina. Alm disso, a exofucosilao das mo- DCs humanas utilizando uma (1,3)-fucosiltransferase aumenta significativamente a expresso de HCELL e, portanto, estas clulas apresentam uma capacidade aumentada para se ligarem E-selectina em condies de fluxo hemodinmico. Estes resultados destacam o papel do HCELL no desencadeamento do TEM das CD14-S mo-DCs e sugerem que estratgias para potenciar a expresso de HCELL podero impulsionar o recrutamento de mo-DCs para locais de inflamao. 3) Outro obstculo para alcanar o sucesso promissor de vacinas baseadas em DCs o estabelecimento de abordagens eficientes que podero melhorar o estado de maturao e apresentao antignica das DCs. Por conseguinte, foram investigadas abordagens alternativas que podem superar este obstculo. Atravs da remoo de cido silico de superfcie celular das DCs, conseguiu-se induzir a maturao de DC humanas e de ratinhos. Notavelmente, tanto as DCs humanas como as de ratinho, ao serem desialiladas mostraram uma capacidade aumentada para induzir a proliferao de clulas T, para secretar citocinas Th1 e para induzir a morte especfica de clulas tumorais. Em adio, as DCs desialiladas apresentam uma maior capacidade de apresentao cruzada de antignios tumorais s clulas T citotxicas. Colectivamente, o presente estudo oferece uma viso chave para optimizar a capacidade das DCs em induzir respostas imunitrias anti-tumorais, e indica que o tratamento com sialidase uma nova tecnologia para melhorar a eficcia e aplicabilidade das vacinas baseadas em DCs. Coletivamente, os nossos resultados demostram como a glicosilao e a sua manipulao podem modular a imunidade. Concretamente, atravs de uma reao de exofucosilao conseguimos aumentar fortemente a capacidade de os leuccitos extravasarem para os tecidos afectados, enquanto que a remoo dos nveis de cido silico da superfcie celular das DCs, induz potentes respostas anti-tumorais mediadas por clulas T citotxicas. ---------------------------- ABSTRACT: Glycosylation is the most widely form of protein post-translational modification and is involved in many physiological and pathological processes. Specifically, certain patterns of glycosylation are associated with determined stages of cell differentiation and can modulate processes like cell-signaling and migration and host-pathogen interactions. As such, glycosylation plays a crucial role in the modulation of several immune events. However, how glycans execute this immune-modulation and, therefore, influence immunity is still poorly unknown. Specifically, some terminal sialic acid-modified determinants are known to be involved in several physiological immune processes, including leukocyte trafficking into sites of inflammation and cell immune activation. Therefore, in this work, we sought to investigate more deeply how the expression of these glycosidic structures affects events form both innate and adaptive immune responses. To this end, we divided our work into three main parts: 1) Immunity critically depends on the ability of sentinel circulating cells to infiltrate injured sites, of which leukocyte binding to endothelial E-selectin is the critical first step. Thus, we first analyzed the structure and function of the E-selectin ligands expressed on native human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), providing novel insights into the molecular effectors governing adhesion of circulating monocytes, and of circulating CD4+T, CD8+T and B cells, to vascular endothelium under hemodynamic shear conditions. Strikingly, monocytes show a higher ability to tether and roll on endothelial cells than lymphocyte subsets. This is due to the fact that human circulating monocytes uniformly display a wide repertoire of E-selectin binding glycoproteins, namely the E-selectin-binding glycoforms of CD43 (CD43E) and CD44 (HCELL), in addition to the previously described E-selectin-binding glycoform of PSGL-1 (CLA). In addition, we also observed a differential ability of the different lymphocyte subsets to bind to Eselectin under hemodynamic shear stress conditions, and these differences were highly correlated with their individual expression of E-selectin binding glycoproteins. While CD4+T cells show a robust E-selectin binding ability, CD8+T and B cells show little to no E-selectin reactivity. CD4+T cell potent Eselectin rolling activity is conferred by HCELL expression, in addition to the previously reported E-selectin-binding glycoproteins CD43E and CLA. CD8+T cells display no HCELL and low amounts of CLA and CD43E, whereas B cells lack E-selectin ligand expression. Moreover, enforced exofucosylation of cell surface of these cells noticeably increases expression of functional E-selectin ligands among all leukocytes subsets, with cell type-dependent specificity in the protein scaffolds that are modified. Taken together, these findings redefine our understanding of the molecular mechanisms governing the trafficking patterns of PBMCs that are relevant in the context of acute or chronic inflammatory conditions. 2) The ability of circulating dendritic cells (DCs) to extravasate at inflammatory sites is critical to the success of DC-based therapies. Therefore, we assessed the structure and function of adhesion molecules mediating the transendothelial migration (TEM) of human monocyte derived-DCs (mo-DCs), obtained either by CD14 positive immune-magnetic selection (CD14-S) or by plastic adherence of blood monocytes (PA-S). We report for the first time that the E-selectin binding glycoforms of PSGL-1, CD43 and CD44 are all expressed on CD14-S mo-DCs, in contrast to PA-S mo-DCs that express only CLA. Importantly, CD44 engagement on CD14-S mo-DCs, but not on PA-S mo-DCs, triggers VLA-4-dependent adhesiveness and programs TEM in absence of chemokine gradient. We also analyzed the E-selectin ligands expressed on mo-DCs generated from umbilical cord blood (UCB) monocytes, and unexpectedly, UCB mo-DCs do not express any glycoprotein with E-selectin reactivity. Furthermore, exoglycosylation of human mo-DCs using an (1,3)-fucosyltransferase significantly increases expression of HCELL, and therefore exofucosylated mo-DCs exhibit an augmented ability to bind to E-selectin under hemodynamic shear stress conditions. These findings highlight a role for HCELL engagement in priming TEM of CD14-S mo-DCs, and suggest that strategies to enforce HCELL expression could boost mo-DC recruitment to inflammatory sites.3) Another obstacle to achieve the promising success of DC-based vaccines is the establishment of efficient approaches that could successfully enhance maturation and cross-presentation ability of DCs. Therefore, we investigated an alternative approach that can overcome this problem. Through removal of sialic acid content from DC cell surface we are able to elicit maturation of both human and mouse DCs. Notably, desialylated human and murine DCs showed enhanced ability to induce autologous T cell to proliferate, to secrete Th1 cytokines and to kill tumor cells. Moreover, desialylated DCs display enhanced cross-presentation of tumor antigens to cytotoxic CD8+ T cells. Collectively, this study offers key insight to optimize the ability of DCs to boost anti-tumor immune responses, and indicates that the treatment with an exogenous sialidase is a powerful new technology to improve the efficacy and applicability of DC-based vaccines. Overall, our findings show how glycosylation and its manipulation can modulate immunity. Concretely, through an exofucosylation reaction we are able to greatly augment the ability of leukocytes to extravasate into injured tissues, while removal of sialic acid moieties from cell surface of DCs, significantly potentiate their ability to induce anti-tumor cytotoxic T cell-mediate responses.
Resumo:
A malria uma doena infecciosa com um efeito devastador nas reas afectadas. provocada pelo protozorio Plasmodium e transmitida pelo insecto vector do gnero Anopheles. As fmeas hematfagas ao alimentar-se de um hospedeiro infectado vo dar continuidade ao ciclo de vida do parasita e transmiti-lo a um novo hospedeiro na prxima refeio sangunea. O intestino mdio dos mosquitos um rgo imunocompetente, onde a presena de microrganismos vai activar o sistema imunitrio, determinando a sua capacidade vectorial. Novas abordagens de controlo biolgico de doenas transmitidas por vectores parecem ganhar terreno. P. aeruginosa uma bactria Gram-negativa, potencialmente patognica, em especial as estirpes produtoras de muco, sendo um microrganismo modelo em estudos de biofilmes. Estes so caracterizados por conferir tolerncia a antibiticos e resistncia ao sistema imune do hospedeiro. Com este trabalho pretendeu-se analisar o efeito da influncia da flora bacteriana, nomeadamente isolados de Pseudomonas aeruginosa produtores de muco e no produtores, presentes no tracto digestivo de Anopheles sp. e a sua relao com a infeco por P. berghei. Com este estudo possvel afirmar a existncia de uma proporcionalidade directa entre a taxa de infeco por P. berghei e a ausncia da Microbiota. A presena de Pseudomonas produtoras de muco no intestino mdio dos mosquitos demonstrou conferir algum grau de proteco no estabelecimento da infeco, bem como na intensidade da mesma. Contudo, mais estudos necessitam ser realizados e com um maior nmero de mosquitos, de forma a ultrapassar as limitaes impostas pelo tratamento antibacteriano. Possivelmente, a sobreposio de respostas imunes anti-bacterianas e anti-Plasmodium, vo provocar um incremento no sistema imune e limitao das infeces por Plasmodium. Biofilmes bacterianos tm demonstrado a capacidade de aderir e inibir o crescimento de protozorios Uma melhor compreenso do papel da flora microbiana face ao sistema de defesa do hospedeiro poder contribuir para o desenvolvimento de novas estratgias de controlo da transmisso da malria.
Resumo:
As ligas de NquelTitnio (NiTi) so as mais atractivas entre as ligas com memria de forma devido s suas boas propriedades funcionais juntamente com a elevada resistncia e melhor ductilidade. As transformaes de fases associadas ao efeito de memria de forma (EMF) podem ser em uma etapa, B19 (martensite) B2 (austenite), em duas ou em mltiplas etapas, incluindo a faseR intermdia dependendo da histria trmica e termomecnica da liga. As temperaturas de transformao so geralmente observadas acima da temperatura ambiente para as ligas ricas em Ti, enquanto nas ricas em Ni se situam abaixo da temperatura ambiente. O objectivo da presente dissertao foi o de investigar as modificaes nas propriedades funcionais e estruturais em uma liga de NiTi rica em Ti (49,0%at.Ni51,0%at.Ti) sujeita a diferentes tratamentos trmicos e termomecnicos de marforming e ausforming. Para melhor entender os fenmenos presentes nesta liga foi feito um paralelismo com outras duas ligas de NiTi: (i) equiatmica com EMF acima da temperatura ambiente e (ii) rica em Ni superelstica (SE) temperatura ambiente. Com o intuito de uma anlise completa das transformaes de fases foram utilizadas durante ciclos trmicos diversas tcnicas de caracterizao: Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC), Resistividade Elctrica (RE), Dilatometria (DT) e Difraco de RaiosX (DRX) convencional e por radiao sincrotro rotina e textura. Foram tambm utilizadas outras tcnicas temperatura ambiente com o intuito de observar caractersticas microestruturais (Microscopia ptica (MO) e Electrnica de Varrimento (SEM)) e mecnicas (Microdureza e UltraMicrodureza Vickers, e Traco). A liga de NiTi rica em Ti tem as suas transformaes directa e inversa fortemente afectadas pelos tratamentos termomecnicos, devido formao de faseR durante a transformao directa em duas (B2RB19) ou em mltiplas etapas (B2R, B2B19 e RB19). Os tratamentos termomecnicos conducentes sequncia de transformao B2RB19 decrescem a temperatura de fim da formao de B19 para prximo da temperatura ambiente e apresentam maior estabilidade nas temperaturas e histereses de transformao.
Resumo:
Modelou-se um Sistema de Alarme Ssmico para a Pennsula Ibrica que, em funo da situao ssmica dada, permite determinar o Grau de Alarme Ssmico, para uma regio, durante um determinado horizonte temporal.Utilizaram-se dois precursores ssmicos: as condies iniciais do modelo de simulao utilizado para gerar o processo de ocorrncias ssmicas na Pennsula Ibrica, que corresponde ao passado ssmico recente; a Sismicidade Local, ou seja o nmero de ocorrncias ssmicas de qualquermagnitude, registadas na regio em estudo, durante um perodo de tempo. Com base na Teoria dos Conjuntos Vagos, determinou-se o grau de alarme relativo a cada um dos precursores utilizados. A mdia pesada dos valores de grau de alarme origina o Grau deAlarme Ssmico. Os pesos envolvidos nessa mdia foram obtidos com recurso metodologia AHP, tomando como critrios, as percentagens de sismos previstos (ou de falhas), falsos alarmes e tempo de alarme.O Sistema desenvolvido foi calibrado com base em 12 situaes ssmicas reais ocorridas naPennsula Ibrica.
Resumo:
A presente dissertao constitui um contributo para a elaborao de um sistema de avaliao de novos projectos urbansticos de reas residenciais. Pretende-se que seja um sistema orientado para o mercado e que avalie a concepo e o planeamento das mesmas em termos de sustentabilidade, de modo a permitir uma futura certificao destes projectos e destas reas. No entanto, no se encontram excludos tecidos residenciais j existentes,inseridos no meio urbano, pois o sistema de avaliao, proposto, pode constituir um referencial aquando de operaes de renovao e da revitalizao urbana. O planeamento e a concepo de reas residenciais atractivas, igualitrias e seguras so actualmente considerados como uma estratgia fundamental para o desenvolvimento sustentvel e como uma soluo chave para o renascimento das cidades. As mudanas necessrias, particularmente ao nvel das reas residenciais, encontram-se ameaadas pela ausncia de polticas coerentes e integradas, pelas diversas perspectivas dos diferentes actores locais e pela escassez de recursos das autoridades locais para o planeamento local. Deste modo, a metodologia da dissertao compreendeu a exposio do estado do conhecimento na rea da sustentabilidade em meio urbano e as suas implicaes no planeamento e concepo das reas residenciais e a elaborao de uma metodologia de avaliao para reas residenciais sustentveis. A metodologia de avaliao proposta concerne em 63 critrios mensurveis, tanto obrigatrios como opcionais. A cada critrio opcional atribudo um determinado nmero de pontos, a pontuao final, obtida atravs da soma de pontos relativos aos critrios adoptados, determina o desempenho do projecto em termos de sustentabilidade. Por fim, efectua-se uma anlise da viabilidade do sistema de avaliao proposto e equaciona-se o seu mbito de aplicao, de forma a formular questes relativas ao planeamento e concepo de reas residenciais em Portugal e sobre o futuro das mesmas.
Resumo:
Este trabalho, cujo objectivo centra-se no desenvolvimento de um sistema primrio para medio da densidade absoluta de lquidos, compara resultados obtidos atravs de diferentes metodologias, no que diz respeito ao valor da incerteza, demonstrando assim, qual o melhor mtodo de pesagem a utilizar. A medio da densidade de lquidos efectua-se atravs do mtodo da pesagem hidrosttica, que consiste em pesar uma esfera de silicone fora do lquido (pesagem no ar) e de seguida pes-la em suspenso num lquido. Para tal, a balana hidrosttica possui um dispositivo que suspende a esfera para a sua imerso no lquido. Tambm usado o densmetro digital como mtodo de comparao com a pesagem hidrosttica. O padro de densidade utilizado foi a esfera de silicone pois os cristais de silicone so os melhores materiais, devido elevada estabilidade na determinao da densidade. A densidade do ar uma das magnitudes de influncia mais comum em metrologia, influenciando diversas reas de medida, incluindo massa, densidade do lquido, volume, entre outros. Por isso, foi importante determinar a densidade do ar medindo a temperatura, a presso e a humidade relativa e aplicando a equao CIPM. Para medies de densidade por pesagem hidrosttica, a gua destilada o lquido normalmente usado. A densidade da gua, L, foi determinada pela frmula M. Tanaka, Fujii e Masui, a uma temperatura de 20C, aproximadamente. Aps a determinao da densidade, foi estimada a incerteza associada ao valor da mensuranda, pois a incerteza que define a qualidade do resultado da densidade. A validao de um resultado, como suporte deciso, impossvel sem o conhecimento da incerteza associada ao prprio resultado. A fonte de incerteza que mais contribuiu para a incerteza global da densidade do lquido foi a massa da esfera. Considerando que o balano de incertezas influenciado por diversos factores inerentes ao prprio mtodo, realizou-se uma abordagem ao desenho de experincias, atravs da anlise de varincia (ANOVA), cuja tcnica permite determinar quais os parmetros significativos. A fonte de incerteza que mais contribuiu para a incerteza global da densidade do lquido foi Entre Ensaios. Atravs do mtodo ANOVA, verifica-se tambm que a amostra lquida estvel e homognea devido a apresentar uma incerteza pequena.
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincia e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do grau de Mestre em Engenharia Mecnica.
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do grau de Mestre em Engenharia Electrotcnica e Computadores
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do grau de Mestre em Engenharia Electrotcnica e de Computadores
Resumo:
Tese de Mestrado em Engenharia Electrotcnica e de Computadores
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obteno do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, perfil Gesto e Sistemas Ambientais
Resumo:
Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente,Perfil Engenharia Sanitria
