Soft biomaterials as a substitute for the Nucleus Pulposus

One of the largest health problems faced worldwide, when evaluated by direct (clinical) as well indirect cost (absenteeism), is the degeneration of the intervertebral disc (IVD) that leads to back pain and, potentially disability and individual´s quality of life decreasing. The intervertebral disc is a mechanical and biological complex structure, formed by a tough outer layer of fibrocartilage called Annulus Fibrosus (AF),which surrounds a soft, elastic and gelatinous core called Nucleus Pulposus (NP). These two structures are completed by two upper and lower encasing layer called Vertebral Endplates (VEP). The degeneration of the IVD is marked by the dehydration of the Nucleus Pulposus, reducing the hydrostatic pressure inside the nucleus, resulting in a loss of capability to support compressive forces, during the active period, and to regain height during the resting period. This situation will compromise the role of shock absorber by the NP and transfers these forces to the AF. This transfer will result in cracks on the AF, deteriorating the IVD, allowing the ingrowth of vessels and nerves. This project was based on the developing a protocol to test suitable NP replacements, in hope to future assessment of discrete mechanical values and characteristics for an NP replacement. For this, Nucleus pulposus samples from goat, encapsulated Hydromed gel denominated “Raviolis” and Chitosan gels, produced via wet route using an ammonium environment, were confined compressed. Chitosan was rheologically tested and swelling capability of all the three type of materials was assessed. Results showed that the Nucleus Pulposus and “Raviolis” have similar mechanical behavior, being able to swell and “build up” hydrostatic pressure after a compression stage, while the Chitosan gel did not showed that ability. Therefore, “Raviolis” are a more suitable candidate to replace the NP than Chitosan gels. It was also observed that confined compression is the key test to perform on any possible candidate to replace the NP.

Estratigrafia do Caloviano do Algarve oriental

The comparative study of the Callovian sections in eastern Algarve allowed us to demonstrate that the discontinuity surface at the base of Malm lies always over the Lower-Callovian, as opposite to what happens in western Algarve; the Bathonian-Callovian transition, continuous in western Algarve (Mareta beach) is marked, in eastern Algarve, by a generalised discontinuity of variable vertical extention. It is verified that, in eastern Algarve, the Callovian formations are always or at the nucleus of anticlinal structures, probably linked to halokinetic tectonic activity, or in large radins folds derived from compressive phases.

Molybdenum-containing proteins from Sulphate Reducing Bacteria: studying proteins with novel cofactors and revealing new features of old enzymes

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Doutor em Bioquímica, especialidade de Bioquímica-Física pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Biotoxicity assays of quantum dots in in vitro cultures of Medicago sativa and Medicago truncatula

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

The impact of CdSe/ZnS Quantum Dots in cells of Medicago sativa in suspension culture

Abstract Background: Nanotechnology has the potential to provide agriculture with new tools that may be used in the rapid detection and molecular treatment of diseases and enhancement of plant ability to absorb nutrients, among others. Data on nanoparticle toxicity in plants is largely heterogeneous with a diversity of physicochemical parameters reported, which difficult generalizations. Here a cell biology approach was used to evaluate the impact of Quantum Dots (QDs) nanocrystals on plant cells, including their effect on cell growth, cell viability, oxidative stress and ROS accumulation, besides their cytomobility. Results: A plant cell suspension culture of Medicago sativa was settled for the assessment of the impact of the addition of mercaptopropanoic acid coated CdSe/ZnS QDs. Cell growth was significantly reduced when 100 mM of mercaptopropanoic acid -QDs was added during the exponential growth phase, with less than 50% of the cells viable 72 hours after mercaptopropanoic acid -QDs addition. They were up taken by Medicago sativa cells and accumulated in the cytoplasm and nucleus as revealed by optical thin confocal imaging. As part of the cellular response to internalization, Medicago sativa cells were found to increase the production of Reactive Oxygen Species (ROS) in a dose and time dependent manner. Using the fluorescent dye H2DCFDA it was observable that mercaptopropanoic acid-QDs concentrations between 5-180 nM led to a progressive and linear increase of ROS accumulation. Conclusions: Our results showed that the extent of mercaptopropanoic acid coated CdSe/ZnS QDs cytotoxicity in plant cells is dependent upon a number of factors including QDs properties, dose and the environmental conditions of administration and that, for Medicago sativa cells, a safe range of 1-5 nM should not be exceeded for biological applications.

A regulação endócrina dos balanços de cálcio

RESUMO: As concentrações circulantes de cálcio são notavelmente constantes a despeito das variações diárias na absorção intestinal e na eliminação renal deste elemento. A regulação da calcémia é um sistema complexo que compreende vários factores controladores (a calcémia, a fosforémia, as concentrações circulantes de paratormona (PTH) e calcitriol além de muitos outros factores como hormonas esteróides em geral, outros iões como o magnésio e outros factores hormonais) e vários órgãos alvo (glândulas paratiroideias, osso, rim e intestino). As respostas dos órgãos alvo também são muito variadas. No caso mais simples, a cristalização de sais de cálcio corresponde a uma mudança de fase em que participam moléculas orgânicas que a iniciam, aceleram ou inibem. Em geral a combinação de um factor controlador com o respectivo receptor de membrana (para polipeptídeos ou iões) ou intracelular (hormonas esteróides) é apenas o primeiro passo de uma cadeia bioquímica que introduz uma enorme amplificação na resposta. A esta variedade de mecanismos de resposta correspondem grandes diferenças nos tempos de resposta que podem ser de minutos a semanas. É hoje possível “observar” (medir) com apreciável rigor nos líquidos biológicos (sangue, urina, fezes, etc.) os factores mais importantes do sistema de regulação da calcémia (cálcio, fósforo, paratormona e calcitriol) assim como administrar estes factores em experiências agudas. Esta possibilidade reflecte – se na literatura neste campo que tem vindo a crescer. O advento das técnicas da biologia molecular tem permitido a caracterização molecular de algumas das disfunções da homeostase do cálcio e é de esperar um diagnóstico fisiopatológico cada vez mais rigoroso dessas disfunções. Com o avanço dos conhecimentos nesta área que não cessa de aumentar temos cada vez maiores capacidades para fazer diagnósticos e é cada vez mais difícil interpretar com rigor os correspondentes quadros metabólicos. A análise ou síntese de sistemas complexos é a actividade mais nobre dos engenheiros que lhes permite desenhar pontes, diques, barcos, aviões ou automóveis. Com o aparecimento de computadores de médio ou grande porte foi – lhes possível utilizar descrições matemáticas não só para desenhar sistemas como ainda para interpretar eventuais falhas na sua operação. Essas descrições matemáticas consistem numa sequência de operações realizadas num computador segundo um “programa informático” que receberam a designação genérica de modelos, por analogia com as famosas leis (equações) da física que foram deduzidas a partir de um certo número de postulados e que permitem representar matematicamente processos físicos. As famosas leis de Newton são talvez os exemplos mais famosos de “modelos” de sistemas físicos. A introdução de modelos matemáticos em biologia e particularmente em medicina só se deu recentemente.MÉTODOS No trabalho que aqui se apresenta construiu - se um modelo simplificado da homeostase do cálcio destinado ao cálculo de variáveis observáveis (concentrações de cálcio, fósforo, PTH e calcitriol) de modo a poderem comparar-se valores calculados com valores observados. A escolha dos componentes do modelo foi determinada pela nossa experiência clínica e pela informação fisiopatológica e clínica publicada. Houve a preocupação de construir o modelo de forma modular de modo a ser possível a sua expansão sem grandes transformações na descrição matemática (e informática) já existente. Na sua fase actual o modelo não pode ser usado como instrumento de diagnóstico. É antes uma ferramenta destinada a esclarecer “em princípio” mecanismos fisiopatológicos. Usou – se o modelo para simular um certo número de observações publicadas e para exemplificar a sua eventual aplicação clínica na simulação de situações hipotéticas e na análise de possíveis mecanismos fisiopatológicos responsáveis por situações de hipo ou hipercalcémias. Simultaneamente fez – se uma análise dos dados acumulados relativos a doentes vistos no Serviço de Endocrinologia do Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil – Centro Regional Oncológico de Lisboa, S.A. CONCLUSÕES Numa população de 894 doentes com patologias variadas do Instituto Português de Oncologia de Lisboa os valores da calcémia tiveram uma distribuição normal unimodal com uma média de 9.56 mg/dl, e um erro padrão de 0.41 mg/dl. Estas observações sugerem que a calcémia está sujeita a regulação. A partir dos resultados publicados em que o metabolismo do cálcio foi perturbado por infusões de cálcio, calcitriol ou PTH, de estudos bioquímicos e fisiológicos sobre os mecanismos de acção de factores controladores da calcémia e do estudo do comportamento de órgãos alvo (paratiroideias, intestino, osso e rim) foi possível construir um modelo matemático de parâmetros concentrados do sistema de regulação da calcémia. As expressões analíticas usadas foram baseadas na cinética enzimática de modo a que os seus parâmetros tivessem um significado físico ou fisiológico simples. O modelo revelou apreciável robustez e flexibilidade. É estável quando não perturbado e transita entre estados estacionários quando perturbado. Na sua forma actual gera simulações que reproduzem satisfatoriamente um número apreciável de dados experimentais colhidos em doentes. Isto não significa que possa ser usado como instrumento de diagnóstico aplicável a doentes individuais. O desenho do modelo comporta a adição posterior de novas relações quando surgirem situações para as quais se revele insuficiente. A utilização exaustiva do modelo permitiu explicitar aspectos do metabolismo do cálcio que ou não estão contidas na sua formulação actual – o aparecimento de hipertrofia ou de adenomas das paratiroideias e as alterações na estrutura óssea , a participação de outros factores controladores – magnésio, ou estão insuficientemente descritas – alterações do metabolismo do fósforo nos hipoparatiroidismos. A análise dos dados relativos aos doentes do Serviço de Endocrinologia do IPO permitiu o início da caracterização dos tipos de patologia que representam e de possíveis mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Estas observações são o ponto de partida para análises futuras. São exemplos das relações encontradas: a distribuição dos doentes por dois grandes grupos conforme a calcémia é determinada pelas concentrações circulantes de PTH ou estas são determinadas pela calcémia; a distribuição sazonal das concentrações de Vit. D25. no sangue; a correlação negativa entre estas e as concentrações de PTH no sangue. Também foi possível extrair a cinética do controlo da PTH sobre a síntese de calcitriol. O estudo dos níveis circulantes de PTH no pós-operatório imediato de doentes paratiroidectomizados permitiu determinar as suas taxas de degradação metabólica. O modelo permitiu simular as relações Ca/PTH no sangue, Ca/Fracção excretada da carga tubular, Ca/P no sangue para valores normais ou altos de Ca. Foram feitas simulações de situações fisiopatológicas (em “doentes virtuais”): infusões crónicas de cálcio, PTH e calcitriol; alterações no comportamento de receptores. Estas simulações correspondem a experiências que não podem ser realizadas em humanos. São exemplos da utilização do modelo na exploração de possíveis mecanismos fisiopatológicos através da observação de resultados quantitativos inacessíveis à intuição. O modelo foi útil em duas fases do trabalho: Primeiro, durante a sua síntese implicou uma escolha criticamente selectiva de informação, sua análise quantitativa e processamento, uma explicitação rigorosa (analítica) das relações funcionais entre os controladores e as variáveis e da sua integração numa estrutura global; Segundo, a simulação de situações experimentais ou clínicas (dados do Serviço de Endocrinologia do IPO) em doentes obrigou a explicitar raciocínios fisiopatológicos habitualmente formulados em bases puramente intuitivas. Esta prática revelou comportamentos óbvios após as simulações – acção reduzida das infusões PTH (simulação de hiperparatiroidismos primários) enquanto não há inibição total da respectiva secreção, necessidade de aumento da massa secretora da paratiroideia nas insuficiências renais avançadas, etc. A síntese e utilização do modelo não implicaram uma preparação matemática avançada e foram possíveis mercê da disponibilidade de “software” interactivo especificamente desenhado para a simulação de sistemas dinâmicos em que os programas se escrevem em inglês usando a simbologia simples da álgebra elementar. A função nobre de modelos desta natureza é semelhante à dos modelos usados pelos físicos desde o século XVII: permitir explicações de carácter geral funcionando como uma ferramenta intelectual para manipulação de conceitos e para a realização de “experiências pensadas” (“thought experiments”) respeitando certos princípios físicos (princípios de conservação) que estabelecem as fronteiras da realidade. -------ABSTRACT: Calcium blood levels are remarkably constant despite great variations in calcium daily intake, intestinal absorption and renal excretion. The regulation of the calcium concentration in the blood is achieved by a complex system that includes several controller factors (mainly the serum levels of calcium, phosphorus, parathyroid hormone (PTH) and calcitriol but also of steroid hormones, ions such as magnesium and other hormonal factors) and several target organs (parathyroid glands, bone, kidney and intestine). The functional response to the controlling factors obeys a variety of kinetics. The precipitation of calcium salts is a simple phase transition in which organic molecules may provide nucleation centres or inhibit the process. The combination of a controller factor with its receptor located in the cell membrane (for peptides or ions) or in the nucleus (for steroid hormones) is only the first step of a biochemical chain that introduces a huge amplification in the response. To this great variability of response we have to add the times of response that vary from minutes to weeks. It is possible to “observe” (measure) with great accuracy in biological fluids (blood, urine, faeces, etc.) the most important factors intervening in the calcium regulation (calcium, phosphorus, PTH and calcitriol). The response of the system to acute infusions of the controlling factors has also been studied. Using molecular biology techniques it has been possible to characterize some calcium homeostasis dysfunctions and better physiopathological diagnosis are expected. With the increasingly new knowledge in this area we have better capacity to diagnose but it is harder to explain correctly the underlying metabolic mechanisms. The analysis or synthesis of complex systems is the noble activity of engineers that enables them to draw bridges, dams, boats, airplanes or cars. With the availability of medium-large frame computers it was possible to use mathematical descriptions not only to draw systems but also to explain flaws in its operations. These mathematical descriptions are generally known as models by analogy with the laws (equations) of physics that allow the mathematical description of physical processes. In practice it is not possible to find general solutions for the mathematical descriptions of complex systems but (numeric) computations for specific situations can be obtained with digital computers. The introduction of mathematical models in biology and particularly in medicine is a recent event. METHODS In this thesis a simplified model of calcium homeostasis was built that enables the computation of observable variables (concentrations of calcium, phosphorus, PTH and calcitriol) and allows the comparison between the simulation values and observed values. The choice of the model’s components was made according to our clinical experience and to the published clinical and physiopathological data. The model has a modular design that allows future expansions with minor alterations in its structure. In its present form the model cannot be used for diagnosis. It is a tool designed to enlighten physiopathological processes. To exemplify its possible clinical application in the simulation of hypothetical situations and in the analysis of possible mechanisms responsible for hypo or hypercalcemias the model was used to simulate a certain number of published observations. An analysis of clinical and laboratory data from the Endocrinology Department of the Portuguese Cancer Institute (I.P.O.F.G.-C.R.O.L.,S.A.) is also presented. CONCLUSIONS In a population of 188 patients without an identifiable disease of the calcium metabolism at the Portuguese Cancer Institute the calcemia levels had a unimodal distribution with an average of 9.56 mg/dL and a S.E.M of 0.41 mg/dL. This observation confirms that serum calcium is regulated. Using published data; in which calcium metabolism was disrupted by calcium, PTH or calcitriol infusions; from biochemical and physiological studies of the action of controller factors on the calcemia; in which the response of target organs (parathyroid glands, intestine, bone, kidney) was studied it was possible to build a mathematical model of concentrated parameters of the calcium homeostasis. Analytical expressions used were based on enzymatic kinetics. The model is flexible and robust. It is stable when not disturbed and changes between steady states when disturbed. In its present form it provides simulations that reproduce closely a number of experimental clinical data. This does not mean that it can be used as a diagnostic tool for individual patients. The exhaustive utilisation of the model revealed the need of future expansions to include aspects of the calcium metabolism not included in its present form –hypertrophy or adenomas of the parathyroid glands, bone structure changes, participation of other controller factors such as magnesium – or insufficiently described – phosphate metabolism in hypoparathyroidism. The analysis of the data collected from the I.P.O.’s Endocrinology Department allowed the initial characterization of the different pathologies represented and of their possible physiopathological mechanisms. These observations are a starting point for future analysis. As examples of the relations found were: the distribution of patients in two groups according to the dependency of calcium by PTH levels or PTH levels by calcium concentration; the seasonal distribution of the serum concentrations of D25; its negative correlation with PTH concentration. It was also possible to extract the kinetics of the control of the synthesis of calcitriol by PTH. The analysis of immediate post-surgical levels of PTH in parathyroidectomized patients allowed the determination of its metabolic clearance. The model also allowed the simulation of the relations between Ca/PTH in blood, serum Ca/Fraction of tubular load excreted and Ca/P in blood for normal and high values of calcium. Simulations were made of pathological situations (in “virtual patients”): chronic infusions of calcium, PTH and calcitriol; changes in the characteristics of receptors. These simulations are not possible in real persons. They are an example of the use of this model in exploring possible mechanisms of disease through the observation of quantitative results not accessible to simple intuition. This model was useful in two phases: Firstly, its construction required a careful choice of data, its quantitative analysis and processing, an analytical description of the relations between controller factors and variables and their integration in a global structure. Secondly, the simulation of experimental or clinical (I.P.O.’s Endocrinology Department) data implied testing physiopathological explanations that previously were based on intuition. The construction and utilisation of the model didn’t demand an advanced mathematical preparation since user-friendly interactive software was used. This software was specifically designed for the simulation of dynamic systems. The programs are written in English using elementary algebra symbols. The essential function of this type of models is identical to that of those used by physicists since the XVII century which describe quantitatively natural processes and are an intellectual tool for the manipulation of concepts and the performance of “thought experiments” based in certain physical principles (conservation principles) that are the frontiers of reality.------------------RESUMÉE: Les concentrations circulantes de calcium sont constantes même pendant des variations de l’absorption intestinale et de l’élimination rénale de cet élément. La régulation de la calcémie est un système complexe qui comprend plusieurs éléments contrôleurs (la calcémie, la phosphorémie, les concentrations circulantes de l’hormone parathyroïdienne (PTH) e du calcitriol et d’autres comme les hormones stéroïdes ou des ions comme le magnésium) et plusieurs organes (glandes parathyroïdiennes, l’os, le rein et l’intestin). Les réponses de ces organes sont variées. Dans le cas plus simple, la cristallisation des sels de calcium correspond à un changement de phase dans lequel y participent des molécules organiques que la débutent, l’accélèrent ou l’inhibent. Généralement la combinaison d’un élément contrôleur avec leur récepteur de membrane (pour les peptides ou les ions) ou intracellulaire (pour les hormones stéroïdes) n’est que le premier pas d’une chaîne biochimique qu’introduit une grande amplification de la réponse. A cette variété de réponses correspondent des grandes différences des temps de réponses qu’y vont des minuits a semaines. Il est possible « observer » (mesurer) dans les fluides biologiques (sang, urine, fèces, etc.) les éléments plus importants du système de régulation de la calcémie (calcium, phosphate, PTH et le calcitriol) et les administrer en expérimentes aigus. Cette possibilité est visible dans la littérature publiée dans ce domaine qui est en croissance permanente. L’avenir des techniques de biologie moléculaire a permis caractériser des nombreuses dysfonctions de la régulation de la calcémie et on attend un diagnostique physiopathologique de ces dysfonctions chaque fois plus rigoureuses. Les connaissances dans ce domaine s’agrandissent et on a de plus de capacités pour faire des diagnostiques et il est chaque fois plus difficile les interpréter. L’analyse ou synthèse de systèmes complexes est l’activité plus noble des ingénieurs qui les permit dessiner des ponts, bateaux, avions ou automobiles. Avec des ordinateurs de médium ou grand port il les est possible utiliser descriptions mathématiques pour dessiner les systèmes et interpréter des éventuelles fautes d’opération. Ces descriptions mathématiques sont une séquence d’opérations réalisées dans un ordinateur selon « un programme informatique » qui ont reçu la désignation générique de modèles, pour analogie avec les équations de la physique qui ont été déduits d’un nombre de postulées et qu’ont permit représenter des processus physiques en équations mathématiques. Les fameuses équations de Newton sont peut-être les exemples plus connus des systèmes physiques. L’introduction des modèles mathématiques en biologie et en particulier en médecine est un évènement récent. Dans ce travaille, on a construit un modèle simplifié de l’homéostasie du calcium pour calculer les variables observables (concentrations de calcium, phosphate, PTH et calcitriol) pour les comparer. Les choix des components a été déterminés par notre expérience clinique et par l’information physiopathologique et clinique publiée. Le modèle a été construit de façon modulaire ce que permit leur postérieur expansion sans des grandes altérations dans la description mathématique et informatique déjà existante. Dans cette forme le modèle ne peut être utilisé comme un instrument de diagnostique. Il est un outil pour éclairer la physiopathologie. Le modèle a été utilisé pour simuler un certain nombre d’observations publiées et pour exemplifier leur possible utilisation clinique dans la simulation des hypothèses et de la physiopathologie des situations d’hypo ou hypercalcémie. On a fait une analyse des éléments des procès cliniques des malades observées dans le Service d’Endocrinologie de l’IPOFG-CROL, SA. Dans une population de 894 malades avec des différentes pathologies les valeurs de calcémie on une distribution uni modale avec une Médie de 9.56 mg/dL et une erreur standard de 0.41 mg/dL. Ces observations suggèrent que la calcémie soit sujette de régulation. En utilisant des résultats de travaux publiés dans lesquels le métabolisme du calcium a été changé par des infusions de calcium, calcitriol ou PTH, des études biochimiques et physiologiques sur des mécanismes d’action des éléments contrôleurs de la calcémie et de l’étude du comportement des organes cible (parathyroïdes, intestin, rein, os), il a été possible de construire un modèle mathématique de paramètres concentrés du système de régulation de la calcémie. Les expressions analytiques utilisées ont été basées sur la cinétique enzymatique de façon à que les paramètres aient eu une signification physique ou biologique. Le modèle est stable quand il n’est pas perturbé et transit entre états stationnaires quand il est sujet a des perturbations. A ce moment il fait des simulations qui reproduisent de façon satisfaisant un nombre d’observations expérimentales. La construction du modèle permit l’addiction de nouvelles relations dans les cas ou il est insuffisant. L’utilisation exhaustive du modèle a permit expliciter des aspects du métabolisme du calcium qui y ne sont pas compris – l’hyperplasie ou la formation des adénomes des parathyroïdes, les altérations de la structure des os, la participation d’outres éléments régulateurs (magnésium), ou sont insuffisamment décrites – les altérations du métabolisme des phosphates dans l’hypoparathyroidism. L’analyse de l’information des malades du Service d’Endocrinologie a permit caractériser les pathologies représentées et leurs possibles mécanismes physiopathologiques. Ces observations sont le point de départ pour les analyses futures. Sont des exemples des relations trouvées: la distribution des malades par deux groupes: ceux dans lequel la calcémie est déterminée par la PTH ou ceux dans lesquels la PTH est déterminée par la calcémie; la distribution sazonale de la concentration de la vitamine D; la corrélation négative entre la vitamine D et la PTH. On a eu la possibilité de déduire la cinétique de control de la PTH sur la synthèse du calcitriol. L’étude des niveaux circulants de PTH sur des sujets parathyroidectomisées a permit déduire leur taux de dégradation métabolique. Le modèle a permit simuler les relations Ca/PTH dans le sang, Ca/fraction éliminée par le rein, Ca/P dans le sang pour des valeurs normales ou hautes de calcium. On a fait des simulations de situations physiopathologiques (dans “malades virtuelles”): Infusions chroniques de calcium, PTH ou calcitriol; altérations des récepteurs. Ces simulations ne peuvent pas être réalisées dans les humains. Sont des exemples d’utilisation du modèle dans l’exploration des possibles mécanismes de la physiopathologie en observant des résultats quantitatifs inaccessibles à l’intuition. Le modèle a été utile pendant deux étapes des travaux: La première, dans sa construction on a choisi l’information disponible, son analyse quantitative, l’explicitation rigoureuse (analytique) des relations fonctionnelles entre les contrôleurs et les variables et sa intégration dans une structure globale. La deuxième, la simulation de situations expérimentales ou cliniques (du Service d’Endocrinologie) a obligé d’expliciter des raisonnements physiopathologiques généralement formulés utilisant l’intuition. Cette pratique a montré des comportements – action réduite des infusions de PTH (jusqu’à l’inhibition totale de leur respective sécrétion), nécessité d’augmenter la masse sécréteuse de la parathyroïde dans les insuffisants rénales, etc. La synthèse et utilisation du modèle n’ont pas besoin d’une formation avancée en mathématique et sont possibles grâce à un programme interactif qui a été conçu pour la simulation des systèmes dynamiques dans lesquels le programme se construit en anglais en utilisant la symbolique élémentaire de l’algèbre. La fonction noble de ces modèles est semblable à celles des physiques du XVII siècle: Permettre établir explications générales en fonctionnant comme un outil intellectuel pour manipuler des concepts et pour la réalisation d’expérimentes pensées en respectant certains principes de la physique (principe de la conservation) qu’établissent les frontières de la réalité.

Mechanism of interleukin-8 induction by human cytomegalovirus UL76 protein

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

The role of Rac1-modulated gene transcription in tumorigenesis

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology

Periplasmic nitrate reductase revisited: a sulfur atom completes the sixth coordination of the catalytic molybdenum

J Biol Inorg Chem. 2008 Jun;13(5):737-53. doi: 10.1007/s00775-008-0359-6

Correlating EPR and X-ray structural analysis of arsenite-inhibited forms of aldehyde oxidoreductase

J Biol Inorg Chem (2007) 12:353–366 DOI 10.1007/s00775-006-0191-9

Analysis of the intranuclear life of nonsense transcripts

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Biologia, Especialidade de Biologia Molecular

Ground truth determination for segmentation of tomographic volumes using interpolation

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Cancer theranostics: multifunctional gold nanoparticles for diagnostics and therapy

Doctorate in Biology, Specialty in Biotechnology

Gold nanoparticles for plasmid delivery

Gene therapy presents an ideal strategy for the treatment of genetic as well as acquired diseases, such as cancer and typically involves the insertion of a functioning gene into cells to correct a cellular dysfunction or to provide a new cellular function. Gene delivery vectors are based in two models: viral and non-viral. Viral vectors have high transfection efficiency but their major barrier is immunogenicity. Since the non-viral vectors have no immunogenicity, these have been widely studied. Gold nanoparticles have been proposed as optimal delivery systems of genetic material, due their small size, high surface-to-volume ratio and the ability to be functionalized with multiple molecules. In the present work, an AuNP-based formulation was developed to deliver a plasmid in a colorectal cancer cell line, containing as reporter gene the gene encoding to EGFP. The delivery system resulted from the functionalization of 14 nm AuNP with a PEG layer (4300114 PEG chains/AuNP), which increases stability and biocompatibility of AuNPs; quaternary ammonium groups which provide positive charges that allow electrostatic binding of plasmid, which is considered the therapeutic agent to be transported into cells. The system developed was characterized by UV-vis spectroscopy, DLS, TEM and by electrophoretic mobility, yielding a formulation with 113.5 nm.Transfection efficiency of the formulation developed was evaluated through PCR and through EGFP expression by fluorescence microscopy and fluorescence spectroscopy. The internalization was observed 3h post transfection; however a low level of EGFP expression was achieved. After 24h of incubation, EGFP expression increases just 3 times compared to non-transfected cells. The commercial system (Lipofectamine) expressed EGFP 5 times more than the system developed AuNP@PEG@R4N+@pEGFP. This difference could be related to lower translocation to the nucleus.

Otimização da anisotropia fronto-calosa e ressonância magnética [1,5T] no idoso normal e com risco cérebro-vascular

RESUMO: Os mais recentes métodos de neuro imagem tal como a Ressonância Magnética (RM) permitiram obter imagens detalhadas do cérebro humano in vivo. Essas imagens revelam, muitas vezes, achados imprevistos face ao padrão normal, com elevada propensão para os indivíduos idosos e franca coexistência com fatores de risco vascular, como característica dum processo de envelhecimento normal. Embora na última década tenham surgido várias publicações sobre este assunto, ele continua ainda pouco explicado. Um pouco por todo o mundo têm emergido os programas de prevenção da doença e promoção da saúde desenvolvidos pela Saúde Pública suportadas sobretudo pelo avanço das tecnologias médicas que resultaram, entre outros impactos, num crescimento da população idosa. Estima-se, em 2030, uma composição demográfica com 20% de indivíduos acima dos 65 anos. Neste contexto, a doença microvascular cerebral é a causa mais frequente de comprometimento cognitivo vascular no idoso sendo as características senescentes na imagem por RM do tipo lesões isquémicas da Substância Branca (Leukoaraiosis) e enfartes lacunares (Status lacunar), atrofia cerebral, gliose e acumulação excessiva de ferro nos núcleos da base. Esta tese, considerando a linha de investigação de que deriva – Ciências da Vida - especialização em Medicina Clinica - Biotecnologia, reúne e reflete sobre três vertentes ligadas à RM e interdependentes em relação a uma problemática comum. A primeira trata da caracterização da Tecnologia por Ressonância Magnética existente em Portugal, a qual inclui uma avaliação exploratória da aplicação da técnica de Difusão Anisotrópica nos estudos cerebrais. As dimensões analíticas estudadas foram a Tecnológica, Sociodemográfica e Económica. Na recolha de dados recorreu-se a várias fontes de informação e a uma metodologia exploratória faseada, validada pela triangulação dos resultados. A sua análise obedeceu a critérios de estratificação e agrupamento segundo as mesmas dimensões analíticas. Otimização da anisotropia fronto-calosa e [RM 1,5T] no idoso normal e com risco cérebro-vascular A segunda descreve o estudo anátomo – radiológico que recaiu sobre parâmetros de quantificação assente na temática do cérebro do idoso em cadáver segundo uma metodologia experimental aplicada às métricas da difusão por RM. Na terceira, e última, é apresentado o estudo técnico - radiológico para avaliação e otimização da imagem ponderada em difusão em estudos clínicos associados ao cérebro do idoso “The Usual Brain Aging” ou Envelhecimento Cerebral Normal, com base metodológica assente nos critérios e indicadores estabelecidos pelo Estudo de Imagem de Roterdão (Rotterdam Scan Study - RSS). Como principais resultados obteve-se que não existem em Portugal estruturas para avaliação dos equipamentos pesados ou Agência de Avaliação das Tecnologias da Saúde para desenvolver o importante papel da produção de estudos comparativos entre os equipamentos disponíveis no mercado, a relação preço-qualidade e a sua afetação às necessidades clínico-epidemiológicas. Constatou-se que a implementação de equipamentos de RM está fortemente assente em critérios económicos carecendo de recomendações e diretivas para o uso racionalizado destas tecnologias. Quanto a dados quantitativos concluímos que a maioria dos equipamentos está instalada em instituições privadas (80,2%); a intensidade de campo magnético mais frequente é [1,5T] com 119 equipamentos; os equipamentos estão instalados maioritariamente nos distritos de Lisboa (55 unidades) e do Porto (39 unidades); o rácio médio de equipamentos por habitante em Portugal é de 1 para 65 195 habitantes; a amplitude de gradientes com maior expressão na amostra é 30-39mT/m; a maioria dos equipamentos foi instalada no intervalo temporal [2009-2012] com 59 equipamentos; apenas 6 instituições desenvolvem investigação clinica e a maioria das bobinas para estudos de crânio são do tipo Array. O estudo de otimização da técnica da difusão revelou, quanto à avaliação dos valoresb, que os mais baixos (b=500 s/mm2 e b=1000 s/mm2), apresentam maior IS e SNR sendo esta uma boa medida referente à qualidade de imagem, no entanto, os valores-b mais elevados (b=2000 s/mm2) apresentam maior CNR e CR, face aos anteriores, o Otimização da anisotropia fronto-calosa e [RM 1,5T] no idoso normal e com risco cérebro-vascular que apesar de proporcionar inferior detalhe anatómico e consequentemente inferior qualidade de imagem, num encéfalo normal, pode auxiliar na interpretação e apresentar vantagens na identificação de lesões microvasculares sempre que persistirem dúvidas em relação ao diagnóstico diferencial de doença microvascular do tipo status lacunar ou Hiperintensidades da Substância Branca. As alterações deste parâmetro são particularmente refletidas nas diferenças da avaliação da qualidade de imagem na região fronto-calos Concluímos da avaliação quantitativa da concentração média de ferro (26Fe) em todas as faixas etárias que os núcleos da base que apresentam maior concentração são, por ordem decrescente: Substância Nigra, Globus Pallidus, Putamen, Tálamo, Núcleo Rubro e Núcleo Caudado; que existe uma predominância na concentração de ferro (26Fe) no hemisfério esquerdo e que os indivíduos do género masculino apresentam mais ferro (26Fe) que os do género feminino nas faixas etárias [30-40[, [40-50[ e [50-60[. Como principal conclusão do estudo da concentração média de ferro em relação à idade destacamos que a concentração média de ferro (26Fe) é superior nos grupos etários superiores, logo aumenta com a idade, sobretudo na Substância Nigra e no Núcleo Lenticular. No estudo técnico-radiológico encontrámos evidências do aumento da difusibilidade da água na substância branca subcortical dos sujeitos idosos comparativamente aos mais jovens. Uma relação idêntica foi avaliada nos tálamos. O aumento relacionado com a idade parece ser predominantemente observado em doentes com mais de 65 anos de idade o que pode refletir alterações estruturais ligeiras associados ao envelhecimento normal. Os resultados indicam que a análise quantitativa das imagens ponderadas em difusão fornece informações, sobre a estrutura do cérebro, as quai s não estão disponíveis apenas por inspeção visual, tanto nas imagens ponderadas em difusão como em outras sequências de aplicação clínica de rotina. Para fazer face às desvantagens dos sistemas de quantificação das HSB os quais são dispendiosos, complexos, requererem tecnologia e formação específicas, recomendamos que a aplicação automatizada GUIAL, desenvolvida ao longo do nosso trabalho é de utilização elementar e prática para que seja introduzida nos sistemas de aquisição de imagem por RM com o fim de integrar o processamento de imagem nos indivíduos portadores de fatores de risco vascular. A avaliação do ADC, nesta amostra, permitiu concluir que a variação desta variável é explicada estatisticamente pela existência da condição clínica de status lacunar em ambos os hemisférios ou por outras palavras, o status lacunar influencia o valor de ADC. Embora uma pequena percentagem da variação do ADC seja explicada pelo género, o ADC nos homens foi superior ao das mulheres o que não nos surpreende, pois são também os homens onde a frequência de doença microvascular se revelou mais expressiva. Os valores do ADC, globalmente, entre os hemisférios cerebrais não mostraram alterações exceto na SB entre os idosos e não idosos. A SB da região frontal mostrou valores diminuídos na anisotropia e isotropia face às restantes áreas anatómicas. Os estudos indicam que na idade avançada existe uma maior predisposição para suscetibilidades de estrutura com status de desconexão. A classificação das HSB foi superior em indivíduos mais velhos e com status lacunar, e em menor quantidade (inferior rating de classificação) nos indivíduos idosos sem status lacunar. As alterações volumétricas foram mais frequentes no homem do que na mulher, presumivelmente devido à associação com a elevada classificação de status lacunar. Um aumento do índice de Evan correspondeu, neste estudo, ao aumento das HSB, à diminuição do volume cerebral total, à expansão ventrículo-sulcal frontal e ao aumento da medida do ângulo caloso. Estes resultados foram agravados pela classificação elevada de status lacunar nos indivíduos que apresentaram indícios de doença de pequenos vasos, com manifesto aumento dos espaços de Virchow-Robin,enfartes lacunares ou HSB. Esses resultados foram mais expressivos no género masculino do que no feminino revelando uma maior vulnerabilidade sobretudo na atrofia frontal nos homens. Por sua vez as dimensões do Corpo Caloso tornaram-se reduzidas devido à compressão dos ventrículos laterais e terceiro ventrículo. Estes indicadores tiveram expressão particularmente nos indivíduos com mais de 65 anos. ---------------------------------------------------------------------------------------------ABSTRACT: The latest neuroimaging methods, such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), have enabled detailed images of in vivo human brain. These images reveal often unexpected findings related to the normal pattern, with high predisposition for the elderly people with forthright coexistence with vascular risk factors such as characteristics of a normal aging process. Although it has been, in the last decade, several publications on this subject, it is still little explained. All over the world have emerged disease prevention programs and health promotion developed by the Public Health sector, supported mainly by the advancement of medical technologies that have resulted, among other impacts, in a growing of the elderly population. It is estimated, in 2030, a demographic composition with 20% o people over 65 years. In this context, microvascular disease is the most common cause of cognitive vascular impairment in the elderly and senescent characteristics in the MRI trough ischemic lesions of the white matter (Leukoaraiosis) and lacunar infarcts (lacunar status), cerebral atrophy, gliosis and iron accumulation in the basal ganglia in excess.This thesis, considering the research line that stems - Life Sciences - specialization in Clinical Medicine, Biotechnology, gathers and reflects on three aspects linked to MR, interdependent and related to a common problem. The first deals with the Magnetic Resonance Technology characterization in Portugal, which includes an exploratory evaluation of the implementation of Anisotropic Diffusion technique in brain studies. The analytical dimensions studied were the Technologic, Socio-demographic and Economics. Collecting data was supported by different sources of information and was applied an exploratory methodology whose results were validated by triangulation. The research method was grouped and stratified criteria under the same analytical dimensions. The second describes the anatomical study - which was focused on radiological measurement parameters, based on the brain’s specimen under an experimental methodology applied to MRI diffusion metrics. Radiological evaluation and optimization of the weighted image diffusion in clinical studies were associated with the brain of the elderly "The Usual Brain Aging" with methodological basis based on established criteria and indicators by Rotterdam Scan Study (RSS). The main results obtained reveal the inexistence frameworks in Portugal for evaluation of equipments or Agency of Health Technology to produce studies comparing the equipment available on the market, the value for money and its allocation to clinical and epidemiological needs. It was found that the implementation of MRI equipment is strongly based on economic criteria lacking recommendations and guidelines for the rationalized use of these technologies. As the quantitative data we conclude that most of the scanners are located in private clinical institutions (80,2%); the most frequent magnetic field intensity is [1.5T] with 119 scanners; the scanners are mainly installed in Lisbon (55 units) and Porto (39 units) districts; the average ratio of equipment per capita in Portugal is 1 to 65 195 people; the gradient power with higher expression in the sample is 30-39mT / m;most of the scanners were installed in the years range [2009-2012 years] with 59 equipment; only 6 clinical placements develop clinical research and the most coils for brain studies are of Array type. The optimization study of diffusion technique revealed, as the assessment of the bvalues, the lower (b = 500 s / mm2 and b = 1000 s / mm 2), promotes an increase in the SI and SNR being this measure related to a higher image quality, however the highest b values (b = 2000 s / mm 2) have a higher CNR (Contrast to Noise-Ratio) and CR (Contrast Ratio), compared to the previous ones. This may provide less anatomical details and, thus, ower image quality, of a normal brain, however can help the interpretation and have advantages in identifying microvascular injuries when doubts persist regarding the differential diagnosis of microvascular disease of lacunar or WMH (White Matter Hyperintensities) status type. Changes on this parameter are Otimização da anisotropia fronto-calosa e [RM 1,5T] no idoso normal e com risco cérebro-vascular particularly reflected in the differences of image quality evaluation in the frontocallosum anatomical area. We conclude from the quantitative assessment of the average concentration of iron (26Fe), in all age groups to the basal ganglia, that the higher concentrations are, in descending order: Nigral Substantia, Globus pallidus, Putamen, Thalamus, Rubio nucleus and Caudate nucleus; that there is a predominance in the concentration of iron (26Fe) in the left hemisphere and that male gender show higher iron (26Fe) level tha females, in the age groups [30-40 [[40-50 [and [50- 60 [. Regarding a main conclusion of the mean concentration study of iron, in terms of age we point out that the average concentration of iron (26Fe) is higher among older groups and increases with age, especially in Nigral Substantia and Lenticular Nucleus. On the technical and radiological study we found evidence of an increased in water /diffusivity in the ubcortical white matter of the elderly compared with younger subjects. A similar relationship was assessed in the Thalamus. The increase agerelated seems to be predominantly observed in patients over 65 years which may reflect minor structural changes associated with normal aging. The results indicate that quantitative analysis of diffusion weighted imaging can provide information about the structure of the brain which is not reached only by visual inspection or standard sequences applied in clinical routine. To address the disadvantages the systems of quantification of WMH which the authors state that are costly, complex, require specific technology and training, we recommend that the automated application GUIAL, developed over our work is basic and practical to use and to be introduced in MR image systems acquisition in order to integrate image processing in patients with vascular risk factors. The evaluation of the ADC showed that its variation is statistically explained by the existence of the medical condition of lacunar status, in both hemispheres, or in other words, the lacunar status influences the ADC value. Although a small percentage of the ADC variation is explained by gender, the ADC in men was higher than women which Otimização da anisotropia fronto-calosa e [RM 1,5T] no idoso normal e com risco cérebro-vascular do not surprise us, since they are also men where the frequency of microvasculardisease has proved more significant. The values of ADC, overall, between the cerebral hemispheres showed no changes but were different in WM among the elderly and non-elderly subjects.The WM's forehead showed decreased values in anisotropy and isotropy face the other anatomical areas. The studies indicate that in old age there is a greater tendency to higher susceptibility to disconnection- status framework. The classification of WMH was higher in elderly people and lacunar status, and fewer (lower classification rating) in the elderly without lacunar status. volumetric changes were more frequent in men than in women, most probably because of its association with high lacunar status rating. An increase of Evan index corresponded, in this study, to an increase in WMH, to a decreased of total brain volume, to a ventricle sulcal frontal and callous angle expansion. These results were wound up by high ranking of lacunar status in subjects who had small vessel disease, clear increase in spaces of Virchow-Robin, lacunar infarctions or WMH. These results were more significant in males than in females revealing vulnerability particularly in the frontal atrophy in men. In turn the size of Corpus Callosum because reduced due to the compression of the lateral and third ventricles. These indicators had expression particularly in individuals over 65 years.