Carbon prices. Dynamic analysis of European and Californian markets

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Alterações Climáticas e Políticas de Desenvolvimento Sustentável

Macroeconomic effects of monetary policy in the Eurozone

To study the macroeconomic effects of unconventional monetary policy across the different countries of the eurozone, I develop an identification scheme to disentangle conventional from non-conventional policy shocks, using futures contracts on overnight interest rates and the size of the European Central Bank balance sheet. Setting these shocks as endogenous variables in a structural vector autoregressive (SVAR) model, along with the CPI and the employment rate, estimated impulse response functions of policy to macroeconomic variables are studied. I find that unconventional policy shocks generated mixed effects in inflation but had a positive impact on employment, with the exception of Portugal, Spain, Greece and Italy where the employment response is close to zero or negative. The heterogeneity that characterizes the responses shows that the monetary policy measures taken in recent years were not sufficient to stabilize the economies of the eurozone countries under more severe economic conditions.

Conectividade efectiva em epilepsia

A epilepsia é uma das mais comuns patologias que afectam o cérebro humano e caracteriza-se por uma actividade cerebral oscilatória desordenada e excessiva que prejudica gravemente a qualidade de vida do doente. Com o objectivo de detectar o percurso da actividade cerebral anormal a ressonância magnética, em conjunto com a técnica de electroencefalografia (EEG) têm evoluído no sentido de tornar a identificação do foco epiléptico e respectivas vias de propagação mais clara e fácil para o neurocirurgião. Esta detecção pode recorrer ao efeito BOLD (do inglês “Blood Oxygenation Level Dependent”) para, de forma indirecta, obter um mapa de activação neuronal da zona em estudo contribuindo para uma possível intervenção cirúrgica à área epiléptica. No entanto, para chegar a uma conclusão definitiva sobre este mapa neuronal é necessário ter em conta que diferentes regiões podem apresentar HRFs (do inglês “Hemodynamic Response Functions”) diferentes, influenciando o resultado de qualquer análise se este facto não for tido em conta. Na presente dissertação foi aplicado um método de cálculo de influência causal entre regiões do cérebro humano a dados de epilepsia obtidos através da técnica EEG+fMRI. Foram utilizadas técnicas de conectividade efectiva (causalidade de Granger) usando um pacote de software (PyHRF) para estimar com precisão a HRF da região em estudo e permitir a desconvolução do sinal antes do cálculo de conectividade. Foi demonstrada a utilidade desta contribuição metodológica para a caracterização topográfica e dinâmica de uma crise epiléptica.

Carbon monoxide, autophagy and cytoprotection in response to cerebral ischemia

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Humoral response towards high density lipoprotein : a new mechanism for atherogenesis

RESUMO:Aterosclerose é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo ocidental. É responsável, direta ou indiretamente, pela maior percentagem de gastos com a saúde na maioria dos países europeus. A “teoria lipídica” da aterosclerose, que se baseia na dislipidemia como causa primária para a doença vascular tem algumas implicações práticas importantes: permite a definição de linhas de orientação e protocolos simples e ainda estabelece alvos terapêuticos que podem ser atingidos na maior parte dos casos com a atual intervenção farmacológica. A associação da aterosclerose com o sistema imunológico (a “teoria imunológica”), forneceu por sua vez novas formas de explorar os mecanismos envolvidos e abriu novas perspetivas para um conhecimento mais completo da doença. No entanto, levanta dificuldades evidentes no que diz respeito às possibilidades terapêuticas. De todos os intervenientes no processo aterosclerótico (bioquímicos, imunológicos e anatómicos), as lipoproteínas de elevada densidade (HDL) são atualmente reconhecidas como um dos fatores mais importantes na aterogénese. Isto é baseado no reconhecimento das múltiplas propriedades anti-aterogénicas das HDL como por exemplo: a anti-oxidante, a anti-inflamatória e a antitrombótica, bem como o seu importante papel na melhoraria da função endotelial. Atualmente, é consensual que as funções anti-aterogénicas das HDL vão além do seu papel no transporte reverso do colesterol (RCT) e a importância das HDL no processo aterosclerótico baseia-se não apenas no seu papel protetor impedindo a formação da placa de ateroma, mas também na estabilização destas, prevenindo a sua ruptura e, consequentemente o evento trombótico. Como fundamentais no processo aterosclerótico estão reconhecidos dois principais conjuntos de eventos: um caracterizado por alterações no metabolismo das lipoproteínas que resultam em lipoproteínas pró-inflamatórias e pró-oxidantes que interagem com os componentes celulares da parede arterial e que conduzem à formação da placa de ateroma; o outro evento é a resposta imunológica desencadeada contra um novo conjunto de antigénios que por sua vez leva à produção de citoquinas pró-inflamatórias. Dada a complexidade da HDL e das suas múltiplas funções estas lipoproteínas tornaram-se um potencial alvo para a resposta auto-imune, e cujas consequências podem explicar algumas das associações identificados em estudos clínicos e epidemiológicos. Contudo esta interação entre o sistema imunológico e HDL nunca foi exaustivamente estudada. Portanto, pomos a hipótese de que em condições oxidativas e pró-inflamatórias, um aumento do antigénio (HDL) conduz a um consequente acréscimo na produção de anticorpos anti-HDL (aHDL) responsáveis pela alteração quantitativa e / ou qualitativa das HDL. O conceito de que estes anticorpos podem contribuir tanto para a evolução a longo prazo do processo aterosclerótico, como para o desencadeamento de eventos clínicos pode também explicar a heterogeneidade encontrada em cada doente e nos grandes estudos clínicos, no que diz respeito aos fatores de risco e outcomes clínicos. Para além disso, a confirmação desta hipótese pode permitir explicar porque é que as intervenções terapêuticas atualmente em desenvolvimento para aumentar os níveis de HDL, não conseguem mostrar a tão esperada redução do risco vascular. O objetivo geral desta tese foi identificar e caracterizar a resposta humoral contra os componentes da HDL, e avaliar possíveis mecanismos que possam contribuir para a modificação das propriedades anti-aterogénicas das HDL. Para alcançar este objetivo investigou-se: 1) A presença de anticorpos aHDL em doentes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) e em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como os doentes com doença arterial coronária (CAD), acidente vascular cerebral isquémico (IS) e diabetes tipo 2; 2) Os principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL e a associação entre os títulos de anticorpos aHDL e diferentes características clínicas destas doenças; 3) As modificações das funções normais associadas às HDL, em particular da função anti-oxidante e anti-inflamatória; 4) A atividade biológica dos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes através de um conjunto de experiências in vitro de inibição da atividade da paraoxonase 1 (PON1) e da expressão de moléculas de adesão em culturas de células endoteliais. Para tal foi necessário estabelecer um método de isolamento dos anticorpos. Os anticorpos aHDL isolados do soro de doentes foram utilizados de forma a identificar as potenciais alterações dos sistemas celulares utilizados; 5) O efeito de fármacos usados no tratamento das dislipidemias, em particular o ácido nicotínico e as estatinas, na variação dos títulos de anticorpos aHDL através de ensaios clínicos randomizados, controlados com placebo e em dupla ocultação. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas imunológicas (como por exemplo, enzyme-linked immunoabsorbent assay - ELISA, ensaio imunoturbidimetrico e cromatografia de imuno-afinidade) técnicas bioquímicas (tais como a quantificação de atividade enzimática por espectrofotometria e por luminescência), experiências com cultura de células e citometria de fluxo. Os nossos resultados mostram que: 1) A presença de anticorpos aHDL, e mais especificamente anticorpos contra alguns do seus principais componentes como a apolipoproteína A-I (ApoA-I, principal apolipoproteína presente nas HDL) e a PON1 (o enzima que mais contribui para a propriedade anti-oxidante das HDL), quer em doentes com doenças auto-imunes, como o SLE, quer em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como CAD, IS e diabetes tipo 2. Os doentes apresentaram títulos de anticorpos IgG aHDL, aApoA-I e aPON1 significativamente mais elevados do que controlos saudáveis com a mesma idade e sexo. 2) A correlação positiva estatisticamente significativa entre os títulos de aHDL e aApoA-I e aPON1 sugere que estes sejam dois dos principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL. Os anticorpos encontrados nestes doentes estão associados com a diminuição da atividade da PON1 e a uma redução da capacidade anti-oxidante total (TAC) do soro, um aumento dos biomarcadores de disfunção endotelial (como por exemplo dos metabolitos do óxido nítrico - NO2- e NO3-, as moléculas de adesão vascular e intracelular - VCAM-1 e ICAM-1 e os níveis de 3-nitrotirosina). Nos doentes com SLE os títulos destes estão associados a um aumento do dano cardiovascular e à atividade global da doença avaliados pelas escalas SLICC/ACR DI e BILAG score, respetivamente. Enquanto que nos doentes com diabetes tipo 2 estes anticorpos estão associados com um aumento dos níveis de glicemia em jejum (FGP) e hemoglobina glicada (HbA1c). 3) Após se ter estabelecido um método de isolamento dos anticorpos que permite isolar quantidades significativas de anticorpos do soro de doentes sem perder a sua especificidade, foi identificada a capacidade dos anticorpos isolados do soro de doentes inibirem de uma forma dependente da concentração a atividade da PON1 até um máximo de 70% no caso dos doentes com SLE e ente 7-52% no caso dos anticorpos isolados de doentes com CAD e IS. 4) O efeito anti-inflamatório das HDL na inibição da produção de VCAM-1 induzida por citoquinas (como o TNF-) foi revertido em mais de 80% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 5) A angiogenesis induzida por HDL através do aumento do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) foi anulada em 65% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 6) Os atuais agentes farmacológicos disponíveis para aumentar as concentrações de HDL-C estão associados a um aumento dos títulos de anticorpos.-------- ABSTRACTAtherosclerosis is the major cause of morbidity and mortality in the western world. It is also responsible, directly or indirectly, for the highest percentage of health costs in most European countries. Despite the use of new technologies for the diagnosis of vascular disease and regardless of the major advances in treatment, the atherosclerosis-related clinical burden is still raising. The “lipid theory” of atherogenesis, which identifies dyslipidemia as the primary cause of this vascular disease has some important practical implications: it allows the definition of simple guidelines and establishes therapeutic targets which can be generally met with current pharmacologic intervention. The association between atherosclerosis an the immune system (the immune concept) has in turn provided new ways of exploring the mechanisms involved in this condition and has opened new perspectives in the understanding of the disease. However, it raises obvious difficulties when it comes to treatment options. Of all the players (biochemical, immunological and anatomical) involved in this matter, high-density lipoproteins (HDL) are currently recognised as one of the most important factors in atherogenesis. This is based on the recognition of HDL's multiple anti-atherogenic properties: anti-oxidant, anti-inflammatory and antithrombotic, as well as its capacity to improve endothelial function. Nowadays, it is widely recognized that the anti-atherogenic functions of HDL go beyond reverse cholesterol transport (RCT), and the importance of HDL is based not just on its ability to reduce atheroma formation but also on its ability to stabilise plaques, therefore preventing their rupture and ultimately thrombosis. Two main set of events have been recognised as fundamental in atherogenesis: one, characterized by lipoprotein metabolism alterations, resulting in pro-inflammatory and pro-oxidative lipoproteins, which interact with the normal cellular elements of the arterial wall leading to atheroma formation; the other, the immune cellular response towards new sets of antigens which lead to the production of pro-inflammatory cytokines. Given to HDL complexity and multiple functions this lipoprotein has became a potential target for an auto-immune response, the consequences of which may explain some of the association identified in epidemiological and clinical studies, though the interaction between the immune system and HDL has never been thoroughly addressed. Therefore, we hypothesized that under oxidative and pro-inflammatory conditions, the increase in the antigen (HDL) would lead to a consequent increase in the production of anti-HDL (aHDL) antibodies be responsible for quantitative and/or qualitative changes of HDL. The concept that these antibodies may contribute either to the long-term evolution of atherosclerosis or to the triggering of clinical events may also explain the heterogeneity found in individual patients and in large cohorts regarding risk factors and clinical outcomes. Moreover this may be a major breakthrough in understanding why therapeutic interventions that increase HDL levels, failed to show the anticipated reduction in vascular risk. The overall aims of this thesis were to identified and characterize the humoral response towards HDL components and to evaluate the possible mechanisms that may contribute to the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL. To achieve this objective we investigated: 1) the presence of aHDL antibodies in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and in patients with atherosclerosis-related clinical events, such as coronary artery disease (CAD), ischemic stroke (IS) and type 2 diabetes; 2) the association between the titres of aHDL antibodies and different clinical features of these diseases; 3) the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL; 4) the biologic effect of aHDL antibodies isolated from serum of patients on the anti-oxidant and anti-inflammatory properties of HDL; 5) the effect of different pharmacologic treatments for dyslipidemia on the prevalence and activity of aHDL antibodies. The methodologies used in this work included immunologic-related techniques (e.g. enzyme-linked immunoabsorbent assay – ELISA, immunoturbidimetric immunoassay and immunoaffinity chromatography), biochemical techniques (enzymatic assays with quantification by spectrophotometry and luminescence methods), cell culture experiments and flow cytometry. Our results indicate that: 1) The titres of IgG aHDL, anti-apolipoprotein A-I (aApoA-I) and anti-paraoxonase 1 (aPON1) antibodies were higher in patients with SLE, CAD, IS and type 2 diabetes when compared with age and sex matched healthy controls. 2) The antibodies found in these patients were associated with decreased PON1 activity, (the enzyme responsible for most of the anti-oxidant effect of HDL), reduced total anti-oxidant capacity (TAC) of serum and increased biomarkers of endothelial dysfunction (nitric oxide metabolites, adhesion molecules, nitrotyrosine). In patients with SLE the antibody titres were associated with an increase in disease-related cardiovascular damage and activity whereas in patients with type 2 diabetes they were directly related with the fasting glucose plasma (FGP) levels and the glycosylated haemoglobin (HbA1c). 3) The antibodies isolated from serum of our patients, directly inhibited HDL-associated PON1 activity in a dose dependent way ranging from 7 to 52%. 4) The anti-inflammatory effect of HDL, measured by the percentage of inhibition of the cytokine-induced production of vascular adhesion molecules (VCAM-1), was reduced in more than 80% by aHDL antibodies isolated from our patients. 5) The HDL-induced angiogenesis by increasing vascular endothelial growth factor (VEGF) levels was abrogated in 65% by the antibodies isolated from serum of patients. 6) The current available pharmacologic agents for increasing HDL-C concentrations were associated with an increase in the titres of IgG aApoA-I antibodies. This increase was higher in the extended release niacin when compared to statins probably due to their dampening effect on oxidative stress. In conclusion, aHDL antibodies are present in different pathologic conditions. aHDL antibodies represent a family of self-reacting immunoglobulins, of which ApoA-I and PON1 might be the most relevant targets. These antibodies are biologically active, interfering with the HDL anti-oxidant and anti-inflammatory properties and, consequently, with the atherosclerotic process. The pathogenic potential of these antibodies may lead to the identification of a new biomarker for vascular disease, whilst presenting itself as a novel target for a different treatment approach which may redefine the treatment strategies and clinical trials design for HDL interventions in the future.

Novel functions of the cohesin accessory factor dPDS5 uncover a new meiotic checkpoint

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology.

Unravelling the role of alpha 2,6 sialic acid on mouse dentritic cells functions

RESUMO: As células dendríticas (CDs) são fundamentais na imunomodulação e iniciação de respostas imunes adaptativas, enquanto os ácidos siálicos (Sias) são potenciais imunomoduladores. Estas células expressam níveis elevados da sialiltransferase ST6Gal-1, que transfere Sias para a posição terminal de oligossacáridos. De facto, a maturação de CDs está associada a uma diminuição da sialilação na sua superfície celular. Apesar de ter função biológica desconhecida, a forma solúvel, extracelular de ST6Gal-1 aumenta em cancros e inflamação. Ainda assim, esta foi recentemente identificada como moduladora da hematopoiese. Considerando o importante papel das CDs na iniciação de respostas anticancerígenas, uma ligação entre a sialilação extrínseca induzida por ST6Gal-1 extracelular e o seu papel na modulação de CDs deve ser identificada. Neste trabalho hipotetizou-se que a sialilação α2,6 extrínseca de CDs diminui o seu perfil de maturação mediante ativação por lipopolissacarídeo (LPS). O objetivo principal foi sialilar extrinsecamente em α2,6 CDs da medula óssea de murganhos, avaliando os seus perfis de maturação e de libertação de citocinas, após estimulação com LPS (por Citometria de Fluxo e ELISA, respetivamente). Ao contrário da hipótese, o perfil celular não foi modulado, usando várias abordagens. Por outro lado, a consequência da falta de α2,6 Sias na maturação de CDs foi avaliada analisando: 1) CDs da medula óssea de murganhos tratadas com sialidase, 2) CDs da medula óssea e 3) CDs das vias aéreas, ambas de murganhos deficientes em ST6Gal-1, comparando com a estirpe selvagem. Estes resultados sugerem que a perta total de α2,6 Sias se relaciona com o aumento da expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe II. Apesar de controverso, é provável existirem mecanismos inerentes à ativação por LPS, reduzindo a eficácia de ST6Gal-1 extracelular. Por outro lado, a modificação no perfil de CDs de murganhos deficientes em ST6Gal-1 poderá relacionar-se com uma predisposição para um estado inflamatório severo. Com isto, o trabalho desenvolvido abriu futuras linhas de investigação, nomeadamente explorar outros fatores envolvidos na (de)sialilação α2,6 de CDs, podendo ter impacto em imunoterapia com uso de CDs.--------------------------ABSTRACT: Dendritic cells (DCs) are vital for immunomodulation and the initiation of adaptive immune responses, whereas sialic acids (Sias) are potential immunomodulators. These cells express high levels of sialyltransferase ST6Gal-1, responsible for transferring Sias to the terminal position of oligosaccharide chains. Indeed, DCs’ maturation is associated with decreased cell surface sialylation. Although its biological significance is unknown, the soluble, extracellular form of ST6Gal-1 increases in cancers and inflammation. However, extracellular ST6Gal-1 was recently identified as modulator of hematopoiesis. Considering that DCs play a crucial role in the initiation of a productive anti-cancer immune response, a link between extrinsic sialylation by the extracellular ST6Gal-1 on DC function needs to be investigated. We hypothesize that extrinsic α2,6 sialylation of DCs diminishes their maturation features upon lipopolysaccharide (LPS) stimulation. The main goal was to extrinsically α2,6 sialylate mice bone marrow derived DCs (BMDCs) and to evaluate their maturation and cytokine profiles upon LPS stimulation (by Flow Cytometry and ELISA, respectively). Unlike the hypothesis, we observed that BMDCs’ profile is not modulated, even using several approaches. In contrast, the consequence of lacking cell surface α2,6 Sias in DC maturation was assessed by analysing: 1) sialidase treated BMDCs, 2) BMDCs from mice lacking ST6Gal-1 and 3) DCs from mice airways, comparing wild type with ST6Gal-1 knockout mice. These results suggest that overall lack in α2,6 Sias is related with increased expression of major histocompatibility class II (MHC-II). Although appearing to be controversial findings, other intracellular mechanisms might be occurring upon LPS-induced BMDC activation, probably reducing extracellular ST6Gal-1 effect. In opposite, the modification observed in DC profile of ST6Gal-1 knockout mice might be related to its predisposition to a more severe inflammatory status. With this, the developed work opened future lines of investigation, namely exploring other factors involved in α2,6 (de)sialylation of DC, which might have influence in immunotherapy using DCs.

On the initial conditions in continuous-time fractional linear systems

Signal Processing, Vol. 83, nº 11

A regulated response to mitochondrial dysfunction modulates longevity and rates of living

Aging is a long-standing biological question of tremendous social and cultural importance. Despite this, only in the last 15 years has biology started to make significant progress in understanding the underlying mechanisms that regulate aging. This progress stemmed mainly from the use of model organisms, which allowed the discovery of several genes directly modulating longevity. Interestingly, several of these longevity genes are necessary for normal mitochondrial function, and disruption of their activity delays the aging process. This is somewhat paradoxical, considering the importance of cellular respiration for energy production and viability of eukaryotic organisms. One possible rationalization for this is that by decreasing cellular respiration, reactive oxygen species (ROS) generation is also reduced, and in that way, cellular decay and aging are delayed.(...)

Accumulation, responses and genotoxicity of trace elements in octopus vulgaris

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Bioquímica pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Time-domain optimization of amplifiers based on distributed genetic algorithms

Thesis presented in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in the subject of Electrical and Computer Engineering

Immune reconstitution after autologous hematopoietic stem cell transplantation

Abstract The investigation of the web of relationships between the different elements of the immune system has proven instrumental to better understand this complex biological system. This is particularly true in the case of the interactions between B and T lymphocytes, both during cellular development and at the stage of cellular effectors functions. The understanding of the B–T cells interdependency and the possibility to manipulate this relationship may be directly applicable to situations where immunity is deficient, as is the case of cancer or immune suppression after radio and chemotherapy. The work presented here started with the development of a novel and accurate tool to directly assess the diversity of the cellular repertoire (Chapter III). Contractions of T cell receptor diversity have been related with a deficient immune status. This method uses gene chips platforms where nucleic acids coding for lymphocyte receptors are hybridized and is based on the fact that the frequency of hybridization of nucleic acids to the oligonucleotides on a gene chip varies in direct proportion to diversity. Subsequently, and using this new method and other techniques of cell quantification I examined, in an animal model, the role that polyclonal B cells and immunoglobulin exert upon T cell development in the thymus, specifically on the acquisition of a broader repertoire diversity by the T cell receptors (Chapter IV and V). The hypothesis tested was if the presence of more diverse peptides in the thymus, namely polyclonal immunoglobulin, would induce the generation of more diverse T cells precursors. The results obtained demonstrated that the diversity of the T cell compartment is increased by the presence of polyclonal immunoglobulin. Polyclonal immunoglobulin, and particularly the Fab fragments of the molecule, represent the most diverse self-molecules in the body and its peptides are presented by antigen presenting cells to precursor T cells in the thymus during its development. This probably contributes significantly to the generation of receptor diversity. Furthermore, we also demonstrated that a more diverse repertoire of T lymphocytes is associated with a more effective and robust T cell immune function in vivo, as mice with a more diverse T cell receptors reject minor histocompatiblility discordant skin grafts faster than mice with a shrunken T cell receptor repertoire (Chapter V). We believe that a broader T cell receptor diversity allows a more efficient recognition and rejection of a higher range of external and internal aggressions. In this work it is demonstrated that a reduction of TCR diversity by thymectomy in wild type mice significantly increased survival of H-Y incompatible skin grafts, indicating decrease on T cell function. In addiction reconstitution of T-cell diversity in mice with a decreased T cell repertoire diversity with immunoglobulin Fab fragments, lead to a increase on TCR diversity and to a significantly decreased survival of the skin grafts (Chapter V). These results strongly suggest that increases on T cell repertoire diversity contribute to improvement of T cell function. Our results may have important implications on therapy and immune reconstitution in the context of AIDS, cancer, autoimmunity and post myeloablative treatments. Based on the previous results, we tested the clinical hypothesis that patients with haematological malignancies subjected to stem cell transplantation who recovered a robust immune system would have a better survival compared to patients who did not recover such a robust immune system. This study was undertaken by the examination of the progression and overall survival of 42 patients with mantle cell non-Hodgkin lymphoma receiving autologous hematopoietic stem cell transplantation (Chapter VI). The results obtained show that patients who recovered higher numbers of lymphocytes soon after autologous transplantation had a statistically significantly longer progression free and overall survivals. These results demonstrate the positive impact that a more robust immune system reconstitution after stem cell transplantation may have upon the survival of patients with haematological malignancies. In a similar clinical research framework, this dissertation also includes the study of the impact of recovering normal serum levels of polyclonal immunoglobulin on the survival of patients with another B cell haematological malignancy, multiple myeloma, after autologous stem cell transplantation (Chapter VII). The relapse free survival of the 110 patients with multiple myeloma analysed was associated with their ability to recover normal serum levels of the polyclonal compartment of immunoglobulin. These results suggest again the important effect of polyclonal immunoglobulin for the (re)generation of the immune competence. We also studied the impact of a robust immunity for the response to treatment with the antibody anti CD20, rituximab, in patients with non- Hodgkin’s lymphoma (NHL) (Chapter VIII). Patients with higher absolute counts of CD4+ T lymphocytes respond better (in terms of longer progression free survival) to rituximab compared to patients with lower number of CD4+ T lymphocytes. These observations highlight again the fact that a competent immune system is required for the clinical benefit of rituximab therapy in NHL patients. In conclusion, the work presented in this dissertation demonstrates, for the first time, that diverse B cells and polyclonal immunoglobulin promote T cell diversification in the thymus and improve T lymphocyte function. Also, it shows that in the setting of immune reconstitution, as after autologous stem cell transplantation for mantle cell lymphoma and in the setting of immune therapy for NHL, the absolute lymphocyte counts are an independent factor predicting progression free and overall survival. These results can have an important application in the clinical practice since the majority of the current treatments for cancer are immunosuppressive and implicate a subsequent immune recovery. Also, the effects of a number of antineoplastic treatments, including biological agents, depend on the immune system activity. In this way, studies similar to the ones presented here, where methods to improve the immune reconstitution are examined, may prove to be instrumental for a better understanding of the immune system and to guide more efficient treatment options and the design of future clinical trials. Resumo O estudo da rede de inter-relações entre os diversos elementos do sistema immune tem-se mostrado um instrumento essencial para uma melhor compreensão deste complexo sistema biológico. Tal é particularmente verdade no caso das interacções entre os linfócitos B e T, quer durante o desenvolvimento celular, quer ao nível das funções celulares efectoras. A compreensão da interdependência entre linfócitos B e T e a possibilidade de manipular esta relação pode ser directamente aplicável a situações em que a imunidade está deficiente, como é o caso das doenças neoplásicas ou da imunossupressão após radio ou quimioterapia. O trabalho apresentado nesta dissertação iniciou-se com o desenvolvimento de um novo método laboratorial para medir directamente a diversidade do reportório celular (Capítulo III). Reduções da diversidade do reportório dos receptores de células T têm sido relacionadas com um estado de imunodeficiência. O método desenvolvido utiliza “gene chips”, aos quais hibridizam os ácidos nucleicos codificantes das cadeias proteicas dos receptores linfocitários. A diversidade é calculada com base na frequência de hibridização do ácido nucleico da amostra aos oligonucleótidos presentes no “gene chip”. De seguida, e utilizando este novo método e outras técnicas de quantificação celular examinei, num modelo animal, o papel que as células policlonais B e a imunoglobulina exercem sobre o desenvolvimento linfocitário T no timo, especificamente na aquisição de um reportório diverso de receptores T (Capítulos IV e V). Testei, então, a hipótese de que a presença no timo de péptidos mais diversos, como a imunoglobulna policlonal, induzisse a génese de precursores T mais diversos. Demonstrámos que a diversidade do compartimento T é aumentado pela presença de imunoglobulina policlonal. A imunoglobulina policlonal, e particularmente os fragmentos Fab desta molécula, representam as moléculas autólogas mais diversas presentes nos organismos vertebrados. Estes péptidos são apresentados por células apresentadoras de antigénio às células precursoras T no timo, durante o desenvolvimento celular T. Tal, provavelmente, contribui para a génese da diversidade dos receptores. Também demonstrámos que a presença de um reportório mais diverso de linfócitos T se associa a um incremento da função imunológica T in vivo. Uma diversidade de receptores T mais extensa parece permitir um reconhecimento e rejeição mais eficientes de um maior número de agressores internos e externos. Demonstrámos que ratinhos com receptores de células T (RCT) com maior diversidade rejeitam transplantes cutâneos discordantes para antigénios minor de histocompatibilidade mais rapidamente do que ratinhos com um menor reportório T (Capítulo V). Por outro lado, uma redução da diversidade do RCT, causada por timectomia de ratinhos de estirpes selvagens, mostrou aumentar significativamente a sobrevivência de transplantes cutâneos incompatíveis para o antigénio H-Y (antigénio minor de histocompatibilidade), indicando uma diminuição da função linfocitária T. Além disso, a reconstituição da diversidade dos linfócitos T em ratinhos com uma diversidade de reportório T diminuída, induzida pela administração de fragmentos Fab de imunoglobulina, conduz a um aumento da diversidade dos RCT e a uma diminuição significativa da sobrevivência dos enxertos cutâneos (Capítulo V). Estes resultados sugerem que o aumento do reportório de células T contribui para uma melhoria das funções celulares T e poderão ter implicações importantes na terapêutica e reconstitutição imunológica em contexto de SIDA, neoplasias, autoimunidade e após tratamentos mieloablativos. Baseado nos resultados anteriores, decidimos testar a hipótese clínica de que doentes com neoplasias hematológicas sujeitos a transplantação de precursores hematopoiéticos e com recuperação imunológica precoce após transplante teriam uma sobrevivência mais longa do que doentes que não recuperassem tão bem a sua imunidade. Analisámos a sobrevivência global e sobrevivência sem doença de 42 doentes com linfoma não Hodgkin de células do manto sujeitos a transplante autólogo de precursores hematopoiéticos (Capítulo VI). Os resultados obtidos mostraram que os doentes que recuperaram contagens mais elevadas de linfócitos imediatamente após o transplante autólogo, apresentaram uma sobrevivência global e sem progressão mais longa do que doentes que não recuperaram contagens linfocitárias tão precocemente. Estes resultados demonstram o efeito positivo de uma reconstitutição imunológica robusta após transplante de presursores hematopoiéticos, sobre a sobrevivência de doentes com neoplasias hematológicas. Do mesmo modo, estudámos o efeito que a recuperação de níveis séricos normais de imunoglobulina policlonal tem na sobrevivência de doentes com outras neoplasias hematológicas de linfócitos B, como o mieloma múltiplo,após transplante autólogo de precursos hematopoiéticos (Capítulo VII). A sobrevivência livre de doença dos 110 doentes com mieloma múltiplo analizados está associada com a sua capacidade de recuperar níveis séricos normais do compartmento policlonal de imunoglobulina. Estes resultados pioneiros indicam a importância da imunoglobulina policlonal para a génese de competência imunológica. Também estudámos o impacto de um sistema imunitário eficiente sobre a resposta ao tratamento com o anticorpo anti CD20, ituximab, em doentes com linfoma não Hodgkin (LNH) (Capítulo VIII). Os resultados mostram que doentes com valores mais elevados de linfócitos T CD4+ respondem melhor (em termos de maior sobrevida livre de doença) ao rituximab, do que doentes com valores mais baixos. Estas observações ilustram a necessidade de um sistema imunitário competente para o benefício clínico da terapêutica com rituximab em doentes com LNH. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta dissertação demonstra que as células B e a imunoglobulina policlonal promovem a diversidade das células T no timo e melhoram a função linfocitária T periférica. Concomitantemente, também demonstrámos que, no contexto de reconstituição imune, por exemplo, após transplante autólogo de precursores hematopoiéticos em doentes com linfomas de células do manto, o número absoluto de linfócitos é uma factor independente da sobrevivência. Os resultados demonstram, também, a importância dos valores de linfocitos T na resposta ao tratamento com rituximab no caso de doentes com LNH. O mesmo princípio se prova pelo facto de que doentes com mieloma múltiplo sujeitos a transplante autólogo de precursores hematopoiéticos que recuperam valores normais séricos de imunoglobulinas policlonais, terem melhores taxas de resposta em comparação com doentes que não recuperam valores normais de imunoglobulinas policlonais. Estes resultados podem ter importantes aplicações na prática clínica dado que a maioria dos tratamentos de doenças neoplásicas implica imunossupressão e, subsequente, recuperação imunológica. Estes estudos podem ser um instrumento fundamental para uma melhor compreensão do sistema imune e guiar uma escolha mais eficiente de opções terapêuticas bem como contribuir para a concepção de futuros estudos clínicos.

Reducing the number of membership functions in linguistic variables

Dissertation presented at Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia in fulfilment of the requirements for the Masters degree in Mathematics and Applications, specialization in Actuarial Sciences, Statistics and Operations Research

Studies on resistance and response to vancomycin in Enterococcus faecalis: a last resort antibiotic

Dissertation presented to obtain a Ph.D. degree in Biochemistry by Instituto de Tecnologia Química e Biológica Universidade Nova de Lisboa.