Gammaretroviral and lentiviral vectors for gene therapy: stability and inactivation mechanisms

Dissertation presented to obtain a Ph.D degree in Engineering and Technology Sciences, Gene Therapy at the Instituto de Tecnologia Quimica e Biológica, Universidade Nova de Lisboa

Cavin 1 and cavin 2 roles on adipocyte cell function

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Bioprocess design of canine adenovirus vectors for gene therapy applications

The potential of human adenovirus vectors as vehicles for gene transfer with clinical applications in vaccination, cancer treatment and in many monogenic and acquired diseases has been demonstrated in several studies and clinical trials. However, the clinical use of these vectors can be limited by pre-existing humoral and cellular anti-capsid immunity. One way to circumvent this bottleneck while keeping the advantages of using adenovirus vectors is using non-human viruses such as Canine Adenovirus type 2 (CAV-2). Moreover, CAV-2 vectors present attractive features to develop potential treatment of neurodegenerative and ocular disorders. While the interest in CAV-2 vectors increases, scalable and robust production processes are required to meet the need for preclinical and possibly clinical uses.(...)

Improving downstream processing for viral vectors and viral vaccines

Viral vectors are playing an increasingly important role in the vaccine and gene therapy elds. The broad spectrum of potential applications, together with expanding medical markets, drives the e orts to improve the production processes for viral vaccines and viral vectors. Developing countries, in particular, are becoming the main vaccine market. It is thus critical to decrease the cost per dose, which is only achievable by improving the production process. In particular advances in the upstream processing have substantially increased bioreactor yields, shifting the bioprocess bottlenecks towards the downstream processing. The work presented in this thesis aimed to develop new processes for adenoviruses puri cation. The use of state-of-the-art technology combined with innovative continuous processes contributed to build robust and cost-e ective strategies for puri cation of complex biopharmaceuticals.(...)

Extraction automatique d´associations lexicales à partir de corpora

The automatic acquisition of lexical associations from corpora is a crucial issue for Natural Language Processing. A lexical association is a recurrent combination of words that co-occur together more often than expected by chance in a given domain. In fact, lexical associations define linguistic phenomena such as idiomes, collocations or compound words. Due to the fact that the sense of a lexical association is not compositionnal, their identification is fundamental for the realization of analysis and synthesis that take into account all the subtilities of the language. In this report, we introduce a new statistically-based architecture that extracts from naturally occurring texts contiguous and non contiguous. For that purpose, three new concepts have been defined : the positional N-gram models, the Mutual Expectation and the GenLocalMaxs algorithm. Thus, the initial text is fisrtly transformed in a set of positionnal N-grams i.e ordered vectors of simple lexical units. Then, an association measure, the Mutual Expectation, evaluates the degree of cohesion of each positional N-grams based on the identification of local maximum values of Mutual Expectation. Great efforts have also been carried out to evaluate our metodology. For that purpose, we have proposed the normalisation of five well-known association measures and shown that both the Mutual Expectation and the GenLocalMaxs algorithm evidence significant improvements comparing to existent metodologies.

Downstream processing development of enveloped viruses for clinical applications: innovative tools for rational process optimization

Dissertation presented to obtain a Ph.D. degree in Engineering and Technology Sciences, Biotechnology at the Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa

Traços da medicina na azulejaria de Lisboa

RESUMO: A presente abordagem procura estabelecer uma relação entre a Medicina e a Azulejaria. Um conjunto de composições produzidas entre o século XVII e a década de 90 do século XX, localizado na área de Lisboa e seus arredores, organiza-se em torno de oito vectores que ilustram a presença de alusões à Medicina na Azulejaria da referida área. São estes, aspectos relacionados com a higiene, marcos da história da assistência, ciclos temáticos relacionados com os quatro elementos primordiais e com os cinco sentidos, representações ligadas à ideia de morte, episódios bíblicos, referências hagiográficas e elementos ligados à acção médica, como objectos, patologias, instituições ou acontecimentos, associados à Medicina, que atestam esta relação entre Arte e Ciência, de forma geral, e entre a Azulejaria e a Medicina, de forma particular. À análise destes vectores, antecede uma resenha histórica relativa à ligação entre Arte e Ciência e um apontamento histórico acerca da história da Azulejaria. Pretende-se demonstrar esta conexão interdisciplinar e reforçar a importância da vertente humanista da Medicina, na sua história, na sua aprendizagem e na sua prática.-------------------------------------ABSTRACT: The present approach aims at establishing a relation between Medicine and Tile Art. A group of compositions produced between the 17th century and the 1990s, located in the Lisbon area and its surroundings, is organized around eight vectors that illustrate the presence of allusions to Medicine in the Tile Art in the mentioned areas. These are related with hygiene aspects, landmarks in the history of assistance, thematic cycles related with the four main elements and with the five senses, representations connected to the idea of death, biblical episodes, hagiographic references and elements connected to the medical intervention, such as objects, pathologies, institutions or events related to Medicine that testify this relation between Art and Science in a broad context, and between Tile Art and Medicine in a strict sense. Prior to the analysis of these vectors there is a historic contextualization concerning the relationship between Art and Science and a historical note about the history of Tile Art. The aim is to demonstrate the interdisciplinary relation and reinforce the importance of the humanistic side of Medicine, in its history, its learning and its practice.------------------------------------RÉSUMÉ: Cet étude vise établir une relation entre la Médecine et l’Art de l’ « Azulejaria ». Un ensemble de compositions produites entre le XVII ème siècle et le dernier quart du XX ème siècle, dans la région de Lisbonne, s’organise autour de huit axes qui illustrent des références à la médecine. Nous avons récupéré des motifs allusifs à l’hygiène, à l’histoire de l’assistance, aux cycles thématiques des quatre éléments primordiaux et des cinq sens, à la mort, aux épisodes bibliques ou hagiographiques mais aussi aux motifs qui reproduisent des objets, des pathologies, des institutions ou des évènements médicaux. Tous ces exemples mettent à jour la relation entre l’Art et la Science, en général, et entre l’ « Azulejaria» et la Médecine, en particulier. Avant d’analyser ces huit axes, nous établirons un parcours historique pour expliquer la relation entre Art et Science, ainsi qu’une brève histoire de l’ «azulejaria». Nous prétendons démontrer cette relation interdisciplinaire et renforcer l’importance de la vertu humaniste des Sciences Médicales dans son histoire, son apprentissage et sa pratique.

A Leishmaniose visceral em Portugal Continental : 1999-2009

RESUMO - As alterações climáticas alteraram a incidência e distribuição mundial de zoonoses, ao modificarem o perfil epidemiológico dos seus vectores. A leishmaniose visceral é reemergente na bacia mediterrânica, sendo o seu impacto real subestimado. Em Portugal, é endémica em três regiões, de declaração obrigatória desde 1948 e o reservatório é o canídeo. O aumento da incidência da doença no cão e a escassez de informação epidemiológica tornou pertinente investigar a realidade nacional. A partir das bases de dados das notificações e dos grupos de diagnósticos homogéneos hospitalares, foram identificados todos os casos e, consultados todos os processos clínicos dos doentes com episódios de internamento nos hospitais do continente entre 1999-2009. Ocorreram 730 internamentos para 375 indivíduos na maioria: homens, eurocaucasianos, com em média, 27 anos e, residência em Lisboa e Vale do Tejo. A sintomatologia e comorbilidades dos doentes vão de encontro ao descrito internacionalmente. A doença foi subnotificada, com uma demora média de 19 dias. A letalidade foi de 5%. A taxa de incidência média do continente foi de 0,294/100000 habitantes, sem padrão de sazonalidade. O corredor endémico de Bortman construído apresentou picos com amplitudes de 2-3 anos. O mapeamento dos doentes evidenciou casos em regiões não endémicas acompanhando a distribuição da leishmaniose canina. Seria pertinente que futuras investigações construíssem uma modelação matemática que confirmasse a tendência do corredor endémico (pico em 2011?) para accionar um sistema de alerta nos Serviços de Saúde. Seria também útil a avaliação das condições geoclimáticas das localidades com casos para evidenciar possíveis similitudes no território. -------ABSTRACT - Climate changed the incidence and worldwide distribution of zoonosis while the epidemiological profile of their vectors was changing. Visceral leishmaniasis is reemerging in the Mediterranean basin and its real impact underestimated. In Portugal, it’s endemic in three regions; the notification occurs since 1948 and dog is the reservoir. The increased incidence of the canines’ disease and the scarcity of epidemiological information relevant investigate the national reality. From Notifications and Homogeneous’ Diagnostics Groups system databases, all cases were identified and also analyze all clinical processes of inpatients’ hospitals in 1999- 2009 in Portugal. 730 admissions occurred for 375 patients. In most they were men, Caucasians, with an average of 27 years and residency in Lisboa e Vale do Tejo. The symptoms and comorbilidades patient go against described internationally. The disease was under notified, with an average delay of 19 days. Lethality was 5%. The incidence rate was 0,294/100000 inhabitants, without seasonality. The endemic’s Bortman corridor presents peak amplitudes of 2-3 years. Mapping patient’s residency shows that cases’ distribution is similar to endemic canine leishmaniasis. It would be appropriate a research to build a mathematical modeling up to confirm the trend of corridor endemic (peak in 2011?), to trigger an alert system for health services. It would also be useful to evaluate the geo-climatics conditions of localities with cases to highlight possible similarities in the territory.

Expression of antibodies and retroviralVectors from defined chromosomal sites: strategies towards reliable production systems

Dissertation presented to obtain a Ph.D. degree in Sciences of Engineering and Technology, Cell Technology, at the Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa

A framework for supporting knowledge representation – an ontological based approach

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Electrotécnica e de Computadores

Expressão em Escherichia coli de antigénios do Cell fusing agent virus (Flaviviridae: Flavivirus) como proteína de fusão

RESUMO: O Cell Fusing Agent Vírus (CFAV), considerado como o primeiro “flavivírus específicos de insectos” (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus hospedeiros, não replicando em células de vertebrados. Apesar de ter sido identificado há mais de três décadas (1975), a verdade é que muito pouco se conhece sobre a sua biologia. Dado o seu parentesco filogenético com alguns outros flavivírus encontrados naturalmente em mosquitos de diferentes géneros colhidos em diferentes regiões do globo, este vírus poderá ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto, necessitam do desenvolvimento de ferramentas básicas, tais como clones moleculares ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheçam uma ou mais proteínas codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antigénios virais produzidos de forma recombinante. Com este trabalho pretendeu-se a optimização de protocolos que permitiram a expressão e purificação parcial de quatro proteínas [duas proteínas estruturais (C e E) e duas não estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas como proteínas de fusão com “caudas” (tags) de hexahistidina nos seus extremos carboxilo. Para a expansão do CFAV foram utilizadas células Aedes albopictus (C6/36). Após a realização da extracção do RNA viral e a obtenção de cDNA, procedeu-se amplificação, por RT-PCR, das regiões codificantes das proteínas C, E, NS3hel e NS5B, utilizando primers específicos. Os quatro fragmentos de DNA foram independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expressão pET-28b e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de expressão. Após da indução, expressão e purificação das proteínas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas proteínas produzidas através do método Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced. In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E) and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein for c-terminal hexahistidine tags. For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS as expression host. After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the authenticity of these proteins produced.

Comparison of different techniques for mouse transgenesis

RESUMO: O uso de ratinhos transgénicos em neurociências aumentou consideravelmente nos últimos anos devido ao crescente interesse em compreender o cérebro e a necessidade de solucionar situações clínicas do foro neurológico e psiquiátrico. Para esse efeito, diferentes métodos de produção de animais transgénicos têm sido testados. O objectivo desta tese foi comparar métodos de integração aleatória de um transgene no genoma de ratinhos em termos de eficiência, estabilidade da integração do transgene, número de animais e de horas de trabalho necessárias para cada método. Assim, foi comparado o método mais utilizado - microinjecção pronuclear (PNMI) - com duas outras técnicas cujo desempenho foi considerado promissor – a transferência génica através dos testículos por electroporação e transfecção por lentivírus in vivo. As três técnicas foram realizadas usando um gene repórter sob o controlo de um promotor constitutivo, e depois reproduzidas usando um gene de interesse de modo a permitir obtenção de um animal capaz de ser usado em experimentação laboratorial. O transgene de interesse utilizado codifica uma proteína de fusão correspondendo a uma variante da rodopsina (channelrhodopsin) fundida à proteína enhanced yellow fluorescente protein ((EYFP) resultando num produto designado ChR2-EYFP. Este animal transgénico apresentaria expressão deste canal iónico apenas em células dopaminergicas, o que, com manipulação optogenética, tornaria possivel a activação especifica deste grupo de neurónios e, simultaneamente, a observação do impacto desta manipulação no comportamento num animal em livre movimento. Estas ferramentas são importantes na investigação básica em neurociências pois ajudam a esclarecer o papel de grupos específicos de neurónios e compreender doenças como a doença de Parkinson ou a esquizofrenia onde a função de certos tipos de neurónios de encontra alterada. Quando comparados os três métodos realizados verifica-se que usando um gene repórter PMNI resulta em 31,3% de, a de animais transgénicos obtidos, a electroporação de testículos em 0% e a injecção de lentivírus em 0%. Quando usado o gene de interesse, os resultados obtidos são, respectivamente, 18,8%, 63,9% e 0%.--------------ABSTRACT: The use of transgenic mice is increasing in all fields of research, particularly in neuroscience, due to the widespread need of animal models to solve neurological and psychiatric medical conditions. Different methodologies have been tested in the last decades in order to produce such transgenic animals. The ultimate goal of this thesis is to compare different methods of random integration of a transgene in the genome of mice in terms of efficiency, stability of the transgene integration, number of animals required and the labour intensity of each technique. We compared the most used method – pronuclear microinjection (PNMI) – with two other promising techniques – Testis Mediated Gene Transfer (TMGT) by electroporation and in vivo lentiviral transfection. The three techniques were performed using a reporter gene – green fluorescent protein (GFP), whose transcription was driven by the constitutive cytomegalovirus (CMV) promoter. These three techniques were later reproduced using the tyrosine hydroxylase promoter (TH) and the neuronal manipulator, channelrhodopsin-2 fused to the enhanced yellow fluorescent reporter protein (ChR2-EYFP). The transgenic animal we sough to produce would express the light driven channel only in dopaminergic cells, making possible to specifically activate this group of neurons, while simultaneously observe the behaviour in a freely moving animal. This is a very important tool in basic neuroscience research since it helps to clarify the role of specific groups of neurons, map circuits in the brain, and consequently understand neurological diseases such as Parkinson’s disease or schizophrenia, where the function of certain types of neurons is affected. When comparing the three methods, it was verified that using a reporter gene PNMI resulted in 31.3% of transgenic mice obtained, testis electroporation in 0% and lentiviral injection in 0%. When using the gene of interest, the results obtained were, respectively, 18.8%, 63.9% and 0%.

Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.

Development of an affinity pair “Tag-Receptor” for recombinant protein expression and purification

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Purification of complex biopharmaceuticals with new processes, advanced analytics and computer-aided process design tools

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia