Obstrução brônquica máxima induzida em crianças asmáticas: análise dos indicadores de susceptibilidade brônquica aumentada à metacolina

Rev. Port. de Pneumologia. 1997,1:p. 5-37.

Avaliação da lesão genética induzida por exposição a radiação ionizante na população Portuguesa

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Desenvolvimento de microgéis híbridos para a sua aplicação em tratamentos de hipertermia magnética

A adição de nanopartículas magnéticas a polímeros termossensíveis permite desenvolver sistemas híbridos com possíveis aplicações biomédicas no âmbito do diagnóstico e/ou da terapia. A variedade de aplicações ao nível biomédico advêm da capacidade de resposta a vários estímulos, podendo tornar estes sistemas multifuncionais. O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de microgéis híbridos termossensíveis com capacidade de resposta tanto à temperatura como ao campo magnético aplicado. Os microgéis híbridos sintetizados por polimerização por emulsão sem tensioativo (polimerização por precipitação) são constituídos por poli (N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) reticulado e quitosano (CS), sendo a componente inorgânica composta por nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (IONPs), previamente sintetizadas por precipitação química. Foram sintetizados microgéis com diferentes percentagens (%m/m) de CS: 2, 10, 15, 20 e 40; bem como com diferentes percentagens (%m/m) de IONPs: 5 e 10%. Os microgéis sintetizados foram caracterizados de forma a otimizar o seu processo de produção. Para tal foi avaliada a sua estrutura, as propriedades físico-químicas e magnéticas e a capacidade de inchamento dos diferentes microgéis produzidos. Por último, foi avaliado o potencial destes microgéis híbridos funcionarem como agentes de hipertermia magnética. Confirmou-se que os microgéis obtidos apresentam uma morfologia esférica com diâmetros médios inferiores a um micrómetro. A introdução tanto do CS como das IONPs não alterou a termossensíbilidade dos microgéis, embora tenha provocado uma diminuição nas suas capacidades de inchamento. Verificou-se ainda que o encapsulamento das nanopartículas de óxido de ferro não alterou as propriedades superparamagnéticas das mesmas. Estes dados, em conjunto com os resultados de hipertermia magnética, revelam um potencial para a aplicação destes microgéis híbridos em hipertermia magnética.

Estudo numérico do fenómeno de vibração induzida por vórtices num cilindro com 1 grau de liberdade em OpenFoam

Esta dissertação tem o intuito de validar o código numérico OpenFoam para problemas de fenómeno de vibração induzida por desprendimento de vórtices num cilindro circular com um grau de liberdade transversal ao escoamento. Na primeira parte é simulado o escoamento em torno de um cilindro circular fixo, e na segunda parte o escoamento em torno do cilindro oscilatório. O número de Reynolds é 200 para todas as simulações e o movimento do cilindro é descrito segundo um sistema massa-mola e massa-mola-amortecedor. Para o movimento do cilindro utilizou-se o solver sixDoFRigidDisplacement e para a resolução de problemas de malha móvel o solver displacementLaplacian. O código numérico utilizado para o caso do cilindro fixo foi pimpleFoam e para o caso do cilindro oscilatório o pimpleDyMFoam. As simulações foram feitas através da resolução das equações de Navier-Stokes num domínio computacional bidimensional. Na simulação do escoamento em redor do cilindro fixo, os coeficientes de arrasto e sustentação e o número de Strouhal foram calculados e comparados com resultados da literatura. Os resultados estão próximos da realidade, no entanto observa-se que a dimensão da malha é muito importante para a precisão dos mesmos. Na simulação do escoamento em torno do cilindro oscilatório foram calculados os coeficientes de arrasto e sustentação e deslocamento do cilindro, para os sistemas massa-mola e massa-mola-amortecedor. Para os dois sistemas foi apresentada e comparada a evolução destes resultados em função da velocidade reduzida e por fim foram comparados. Observa-se que o fator de amortecimento afeta as respostas do cilindro, dependo da velocidade reduzida. Os resultados obtidos em ambos os estudos foram satisfatórios e conclui-se que o código OpenFoam é uma boa ferramenta para resolver problemas com o fenómeno de vibração induzida por vórtices.

Contributo para a avaliação da ecocompatibilidade de novos materiais para a construção civil

No âmbito da avaliação da ecocompatibilidade de novos materiais para a construção civil, foram realizados diversos estudos, destinados à avaliação dos potenciais tóxicos e ecotóxicos desses materiais. Estes estudos foram enquadrados pelo projecto europeu VALOMAT, o qual foi financiado pela Comissão Europeia, através do programa Brite-Euram III. Os novos materiais, desenvolvidos pela empresa Inertec, basearam-se na valorização de escórias de centrais de incineração de RSU e destinaram-se a duas aplicações distintas: a) Enchimento de minas ou pedreiras abandonadas ou em fim de vida; b) Construções, no sub-solo, de paredes diafragma. Os estudos realizados, no âmbito da presente dissertação, foram efectuados em cinco fases distintas. Na primeira fase, procedeu-se ao estudo das propriedades químicas e ecotoxicológicas intrínsecas de seis amostras de escórias brutas. Utilizou-se o ensaio de lixiviação descrito na norma europeia EN 12457-2. Os lixiviados produzidos foram caracterizados recorrendo a 21 parâmetros químicos e quatro indicadores biológicos. Os resultados obtidos permitiram verificar que as escórias apresentaram níveis tóxicos e ecotóxicos muito diferenciados. A ordenação dos níveis tóxicos e ecotóxicos, por recurso a um índice químico e a um índice ecotoxicológico, e a sua integração num sistema de critérios múltiplos de decisão permitiram seleccionar cinco amostras de escórias como as mais adequadas para o desenvolvimento dos novos materiais.Na segunda fase do trabalho, procedeu-se à avaliação dos potenciais tóxicos e ecotóxicos intrínsecos de 14 materiais monolíticos, desenvolvidos pela empresa Inertec. Os materiais foram submetidos a um processo de segmentação prévio (dimensão das partículas: <4 mm). Posteriormente, foram submetidos ao ensaio de lixiviação descrito na norma europeia EN 12457-2. Os lixiviados foram caracterizados de modo semelhante ao que foi indicado para as escórias brutas. Os resultados obtidos indicaram que os níveis tóxicos e ecotóxicos dos materiais destinados ao enchimento de antigas minas ou pedreiras foram superiores aos determinados para os materiais destinados à construção de paredes diafragma. Com base nos índices químico e ecotoxicológico, foi possível ordenar as amostras dos materiais, em função dos níveis tóxicos e ecotóxicos crescentes. A integração destes resultados num sistema de critérios múltiplos de decisão permitiu seleccionar seis formulações como as mais adequadas para as duas aplicações acima referidas. A terceira fase dos estudos teve como objectivo a avaliação dos potenciais tóxicos e ecotóxicos dos materiais seleccionadas na fase anterior, sem alteração prévia das suas matrizes monolíticas. Para o efeito utilizou-se o ensaio de lixiviação descrito na norma francesa NF X31-211. Os resultados obtidos permitiram concluir que os níveis de emissão de substâncias químicas e os níveis de ecotoxicidade dos novos materiais foram inferiores aos determinados na avaliação dos potenciais tóxico e ecotóxico intrínsecos. Os materiais foram classificados como quimicamente estáveis. Os diferentes níveis tóxicos e ecotóxicos destes materiais permitiram seleccionar três formulações para os ensaios seguintes. A quarta fase envolveu o estudo do comportamento químico dos novos materiais, sob condições de actividade microbiológica induzida no agente lixiviante (ensaio de biolixiviação). Foi desenvolvida uma nova metodologia para o ensaio de biolixiviação, tendo por base alguns trabalhos de biodeterioração, biolixiviação e biodegradação, realizados por outras equipas. Os resultados obtidos permitiram concluir que o comportamento químico dos novos materiais não foi alterado por acção da actividade microbiológica. Na última fase do trabalho, procedeu-se ao estudo dos potenciais tóxico e ecotóxico dos novos materiais, em ensaios de lixiviação de longo prazo, sob três cenários diferentes de exposição ambiental (norma europeia ENV 12920). Foram construídos dez pilotos experimentais, à escala laboratorial, que foram operados sob condições diferentes, em função dos cenários de exposição ambiental. Ao longo do tempo de ensaio, os lixiviados dos pilotos foram recolhidos e analisados sob o ponto de vista químico e ecotoxicológico. Os níveis tóxicos e ecotóxicos dos lixiviados dos novos materiais foram relativamente reduzidos e diferenciados, para cada um dos materiais e para cada cenário de exposição.

Produção e caracterização de silício policristalino e sua aplicação a TFTS

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia dos Materiais, especialidade Microelectrónica e Optoelectrónica, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Resinas epoxídicas - estudos de envelhecimento acelerado e sua aplicação em conservação e restauro de vidro

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Conservação e Restauro

Estudos sobre o comportamento mecânico e estrutural das anteparas nºs 3 e 17 dos salva-vidas da classe vigilante

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Mecânica

Hepatic parasympathetic nerve dysfunction involved in the deregulation of postprandial whole-body insulin sensitivity:a road to diabetes and associated pathologies

FCM: UC Fisiologia - Teses de Doutoramento

Fast-to-fed shift in glucose homeostasis: clues to an earlier detection of human prediabetic states

FCM: UC Bioquímica I - PhD Thesis

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em Áreas Endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Immune reconstitution after autologous hematopoietic stem cell transplantation

Abstract The investigation of the web of relationships between the different elements of the immune system has proven instrumental to better understand this complex biological system. This is particularly true in the case of the interactions between B and T lymphocytes, both during cellular development and at the stage of cellular effectors functions. The understanding of the B–T cells interdependency and the possibility to manipulate this relationship may be directly applicable to situations where immunity is deficient, as is the case of cancer or immune suppression after radio and chemotherapy. The work presented here started with the development of a novel and accurate tool to directly assess the diversity of the cellular repertoire (Chapter III). Contractions of T cell receptor diversity have been related with a deficient immune status. This method uses gene chips platforms where nucleic acids coding for lymphocyte receptors are hybridized and is based on the fact that the frequency of hybridization of nucleic acids to the oligonucleotides on a gene chip varies in direct proportion to diversity. Subsequently, and using this new method and other techniques of cell quantification I examined, in an animal model, the role that polyclonal B cells and immunoglobulin exert upon T cell development in the thymus, specifically on the acquisition of a broader repertoire diversity by the T cell receptors (Chapter IV and V). The hypothesis tested was if the presence of more diverse peptides in the thymus, namely polyclonal immunoglobulin, would induce the generation of more diverse T cells precursors. The results obtained demonstrated that the diversity of the T cell compartment is increased by the presence of polyclonal immunoglobulin. Polyclonal immunoglobulin, and particularly the Fab fragments of the molecule, represent the most diverse self-molecules in the body and its peptides are presented by antigen presenting cells to precursor T cells in the thymus during its development. This probably contributes significantly to the generation of receptor diversity. Furthermore, we also demonstrated that a more diverse repertoire of T lymphocytes is associated with a more effective and robust T cell immune function in vivo, as mice with a more diverse T cell receptors reject minor histocompatiblility discordant skin grafts faster than mice with a shrunken T cell receptor repertoire (Chapter V). We believe that a broader T cell receptor diversity allows a more efficient recognition and rejection of a higher range of external and internal aggressions. In this work it is demonstrated that a reduction of TCR diversity by thymectomy in wild type mice significantly increased survival of H-Y incompatible skin grafts, indicating decrease on T cell function. In addiction reconstitution of T-cell diversity in mice with a decreased T cell repertoire diversity with immunoglobulin Fab fragments, lead to a increase on TCR diversity and to a significantly decreased survival of the skin grafts (Chapter V). These results strongly suggest that increases on T cell repertoire diversity contribute to improvement of T cell function. Our results may have important implications on therapy and immune reconstitution in the context of AIDS, cancer, autoimmunity and post myeloablative treatments. Based on the previous results, we tested the clinical hypothesis that patients with haematological malignancies subjected to stem cell transplantation who recovered a robust immune system would have a better survival compared to patients who did not recover such a robust immune system. This study was undertaken by the examination of the progression and overall survival of 42 patients with mantle cell non-Hodgkin lymphoma receiving autologous hematopoietic stem cell transplantation (Chapter VI). The results obtained show that patients who recovered higher numbers of lymphocytes soon after autologous transplantation had a statistically significantly longer progression free and overall survivals. These results demonstrate the positive impact that a more robust immune system reconstitution after stem cell transplantation may have upon the survival of patients with haematological malignancies. In a similar clinical research framework, this dissertation also includes the study of the impact of recovering normal serum levels of polyclonal immunoglobulin on the survival of patients with another B cell haematological malignancy, multiple myeloma, after autologous stem cell transplantation (Chapter VII). The relapse free survival of the 110 patients with multiple myeloma analysed was associated with their ability to recover normal serum levels of the polyclonal compartment of immunoglobulin. These results suggest again the important effect of polyclonal immunoglobulin for the (re)generation of the immune competence. We also studied the impact of a robust immunity for the response to treatment with the antibody anti CD20, rituximab, in patients with non- Hodgkin’s lymphoma (NHL) (Chapter VIII). Patients with higher absolute counts of CD4+ T lymphocytes respond better (in terms of longer progression free survival) to rituximab compared to patients with lower number of CD4+ T lymphocytes. These observations highlight again the fact that a competent immune system is required for the clinical benefit of rituximab therapy in NHL patients. In conclusion, the work presented in this dissertation demonstrates, for the first time, that diverse B cells and polyclonal immunoglobulin promote T cell diversification in the thymus and improve T lymphocyte function. Also, it shows that in the setting of immune reconstitution, as after autologous stem cell transplantation for mantle cell lymphoma and in the setting of immune therapy for NHL, the absolute lymphocyte counts are an independent factor predicting progression free and overall survival. These results can have an important application in the clinical practice since the majority of the current treatments for cancer are immunosuppressive and implicate a subsequent immune recovery. Also, the effects of a number of antineoplastic treatments, including biological agents, depend on the immune system activity. In this way, studies similar to the ones presented here, where methods to improve the immune reconstitution are examined, may prove to be instrumental for a better understanding of the immune system and to guide more efficient treatment options and the design of future clinical trials. Resumo O estudo da rede de inter-relações entre os diversos elementos do sistema immune tem-se mostrado um instrumento essencial para uma melhor compreensão deste complexo sistema biológico. Tal é particularmente verdade no caso das interacções entre os linfócitos B e T, quer durante o desenvolvimento celular, quer ao nível das funções celulares efectoras. A compreensão da interdependência entre linfócitos B e T e a possibilidade de manipular esta relação pode ser directamente aplicável a situações em que a imunidade está deficiente, como é o caso das doenças neoplásicas ou da imunossupressão após radio ou quimioterapia. O trabalho apresentado nesta dissertação iniciou-se com o desenvolvimento de um novo método laboratorial para medir directamente a diversidade do reportório celular (Capítulo III). Reduções da diversidade do reportório dos receptores de células T têm sido relacionadas com um estado de imunodeficiência. O método desenvolvido utiliza “gene chips”, aos quais hibridizam os ácidos nucleicos codificantes das cadeias proteicas dos receptores linfocitários. A diversidade é calculada com base na frequência de hibridização do ácido nucleico da amostra aos oligonucleótidos presentes no “gene chip”. De seguida, e utilizando este novo método e outras técnicas de quantificação celular examinei, num modelo animal, o papel que as células policlonais B e a imunoglobulina exercem sobre o desenvolvimento linfocitário T no timo, especificamente na aquisição de um reportório diverso de receptores T (Capítulos IV e V). Testei, então, a hipótese de que a presença no timo de péptidos mais diversos, como a imunoglobulna policlonal, induzisse a génese de precursores T mais diversos. Demonstrámos que a diversidade do compartimento T é aumentado pela presença de imunoglobulina policlonal. A imunoglobulina policlonal, e particularmente os fragmentos Fab desta molécula, representam as moléculas autólogas mais diversas presentes nos organismos vertebrados. Estes péptidos são apresentados por células apresentadoras de antigénio às células precursoras T no timo, durante o desenvolvimento celular T. Tal, provavelmente, contribui para a génese da diversidade dos receptores. Também demonstrámos que a presença de um reportório mais diverso de linfócitos T se associa a um incremento da função imunológica T in vivo. Uma diversidade de receptores T mais extensa parece permitir um reconhecimento e rejeição mais eficientes de um maior número de agressores internos e externos. Demonstrámos que ratinhos com receptores de células T (RCT) com maior diversidade rejeitam transplantes cutâneos discordantes para antigénios minor de histocompatibilidade mais rapidamente do que ratinhos com um menor reportório T (Capítulo V). Por outro lado, uma redução da diversidade do RCT, causada por timectomia de ratinhos de estirpes selvagens, mostrou aumentar significativamente a sobrevivência de transplantes cutâneos incompatíveis para o antigénio H-Y (antigénio minor de histocompatibilidade), indicando uma diminuição da função linfocitária T. Além disso, a reconstituição da diversidade dos linfócitos T em ratinhos com uma diversidade de reportório T diminuída, induzida pela administração de fragmentos Fab de imunoglobulina, conduz a um aumento da diversidade dos RCT e a uma diminuição significativa da sobrevivência dos enxertos cutâneos (Capítulo V). Estes resultados sugerem que o aumento do reportório de células T contribui para uma melhoria das funções celulares T e poderão ter implicações importantes na terapêutica e reconstitutição imunológica em contexto de SIDA, neoplasias, autoimunidade e após tratamentos mieloablativos. Baseado nos resultados anteriores, decidimos testar a hipótese clínica de que doentes com neoplasias hematológicas sujeitos a transplantação de precursores hematopoiéticos e com recuperação imunológica precoce após transplante teriam uma sobrevivência mais longa do que doentes que não recuperassem tão bem a sua imunidade. Analisámos a sobrevivência global e sobrevivência sem doença de 42 doentes com linfoma não Hodgkin de células do manto sujeitos a transplante autólogo de precursores hematopoiéticos (Capítulo VI). Os resultados obtidos mostraram que os doentes que recuperaram contagens mais elevadas de linfócitos imediatamente após o transplante autólogo, apresentaram uma sobrevivência global e sem progressão mais longa do que doentes que não recuperaram contagens linfocitárias tão precocemente. Estes resultados demonstram o efeito positivo de uma reconstitutição imunológica robusta após transplante de presursores hematopoiéticos, sobre a sobrevivência de doentes com neoplasias hematológicas. Do mesmo modo, estudámos o efeito que a recuperação de níveis séricos normais de imunoglobulina policlonal tem na sobrevivência de doentes com outras neoplasias hematológicas de linfócitos B, como o mieloma múltiplo,após transplante autólogo de precursos hematopoiéticos (Capítulo VII). A sobrevivência livre de doença dos 110 doentes com mieloma múltiplo analizados está associada com a sua capacidade de recuperar níveis séricos normais do compartmento policlonal de imunoglobulina. Estes resultados pioneiros indicam a importância da imunoglobulina policlonal para a génese de competência imunológica. Também estudámos o impacto de um sistema imunitário eficiente sobre a resposta ao tratamento com o anticorpo anti CD20, ituximab, em doentes com linfoma não Hodgkin (LNH) (Capítulo VIII). Os resultados mostram que doentes com valores mais elevados de linfócitos T CD4+ respondem melhor (em termos de maior sobrevida livre de doença) ao rituximab, do que doentes com valores mais baixos. Estas observações ilustram a necessidade de um sistema imunitário competente para o benefício clínico da terapêutica com rituximab em doentes com LNH. Em conclusão, o trabalho apresentado nesta dissertação demonstra que as células B e a imunoglobulina policlonal promovem a diversidade das células T no timo e melhoram a função linfocitária T periférica. Concomitantemente, também demonstrámos que, no contexto de reconstituição imune, por exemplo, após transplante autólogo de precursores hematopoiéticos em doentes com linfomas de células do manto, o número absoluto de linfócitos é uma factor independente da sobrevivência. Os resultados demonstram, também, a importância dos valores de linfocitos T na resposta ao tratamento com rituximab no caso de doentes com LNH. O mesmo princípio se prova pelo facto de que doentes com mieloma múltiplo sujeitos a transplante autólogo de precursores hematopoiéticos que recuperam valores normais séricos de imunoglobulinas policlonais, terem melhores taxas de resposta em comparação com doentes que não recuperam valores normais de imunoglobulinas policlonais. Estes resultados podem ter importantes aplicações na prática clínica dado que a maioria dos tratamentos de doenças neoplásicas implica imunossupressão e, subsequente, recuperação imunológica. Estes estudos podem ser um instrumento fundamental para uma melhor compreensão do sistema imune e guiar uma escolha mais eficiente de opções terapêuticas bem como contribuir para a concepção de futuros estudos clínicos.

Caracterização da função do monóxido de azoto e glutationo hepáticos na sensabilidade periférica à insulina

xi RESUMO A acção da insulina no músculo esquelético depende de um reflexo parassimpático hepático que conduz à libertação de uma substância hepática sensibilizadora da insulina, designada por HISS, responsável por cerca de 55% do efeito hipoglicemiante da insulina. A acção da HISS é finamente regulada pelo monóxido de azoto (NO) hepático e pelo estado prandial, aumentando no período pós-prandial imediato e diminuindo progressivamente com as horas de jejum. A secreção da HISS pode ser inibida cirúrgica ou farmacologicamente, quer por desnervação selectiva do plexo anterior hepático, quer por administração de atropina, quer por inibição do sintase do NO (NOS) hepático. O objectivo geral do trabalho apresentado nesta dissertação foi a caracterização da via de transdução de sinal que conduz à libertação da HISS. O modelo utilizado neste estudo foi o rato Wistar. A sensibilidade à insulina foi avaliada através do teste rápido de sensibilidade à insulina (RIST). A primeira hipótese de trabalho testada foi que a sequência de eventos que conduzem à secreção da HISS inicia-se com a activação do sistema parassimpático hepático seguida de activação do NOS hepático com subsequente produção de NO e activação do guanilato ciclase (GC). Observou-se que a administração de um dador de NO reverteu a resistência à insulina induzida, quer por inibição do NOS hepático, quer por antagonismo dos receptores muscarínicos com atropina. Em contraste, a resistência à insulina produzida por inibição do NOS hepático não foi revertida por administração intraportal de acetilcolina (ACh). Constatou-se que a inibição do GC hepático diminuiu a sensibilidade à insulina. Estes resultados sugerem que: a ACh libertada no fígado induz a síntese de NO hepático que conduz à libertação da HISS, que por sua vez é modulada pelo GC hepático. A libertação da HISS em resposta à insulina é regulada pelo estado prandial. Uma vez que os níveis hepáticos de glutationo (GSH) se encontram, tal como a HISS, diminuídos no estado de jejum e aumentados após a ingestão de uma refeição, testou-se a hipótese de que o GSH hepático está envolvido na secreção da HISS. Observou-se que a depleção do GSH hepático induziu resistência à insulina, comparável à obtida após inibição do NOS hepático. Estes resultados suportam a hipótese de que o GSH hepático desempenha um papel crítico na acção periférica da insulina. Considerando que, no estado de jejum, tanto os níveis de GSH hepático como os níveis de NO hepático são baixos, testou-se a hipótese de que a co-administração intraportal de um dador de GSH e de um dador de NO promove um aumento da sensibilidade à insulina no estado de jejum, devido ao restabelecimento do mecanismo da HISS. Observou-se que a administração sequencial de dadores de GSH e de NO no fígado provocou um aumento na sensibilidade à insulina, dependente da dose de dador de GSH administrada. Concluiu-se portanto que ambos, GSH e NO, são essenciais para que o mecanismo da HISS esteja completamente funcional. O GSH e o NO reagem para formar um S-nitrosotiol, o S-nitrosoglutationo (GSNO). Os resultados supra-mencionados conduziram à formulação da hipótese de que a secreção/acção da HISS depende da formação de GSNO. Observou-se que a administração intravenosa de S-nitrosotióis (RSNOs) aumentou a sensibilidade à insulina, em animais submetidos a um período de jejum, ao contrário da administração intraportal destes fármacos, o que RSNOs têm uma acção periférica, mas não hepática, na sensibilidade à insulina. Os resultados obtidos conduziram à reformulação da hipótese da HISS, sugerindo que a ingestão de uma refeição activa os nervos parassimpáticos hepáticos levando à libertação de ACh no fígado que, por sua vez activa o NOS. Simultaneamente, ocorre um aumento dos níveis de GSH hepático que reage com o NO hepático para formar um composto nitrosado, o GSNO. Este composto mimetiza a acção hipoglicemiante da HISS no músculo esquelético. SUMMARY Insulin action at the skeletal muscle depends on a hepatic parasympathetic reflex that promotes the release of a hepatic insulin sensitizing substance (HISS) from the liver, which contributes 55% to total insulin action. HISS action is modulated by hepatic nitric oxide (NO) and also by the prandial status so as to, in the immediate ostprandial state, HISS action is maximal, decreasing with the duration of fasting. HISS secretion may be inhibited by interruption of the hepatic parasympathetic reflex, achieved either by surgical denervation of the liver or by cholinergic blockade with atropine, or by prevention of hepatic NO release, using NO synthase (NOS) antagonists. The main objective of this work was to characterize the signal transduction pathways that lead to HISS secretion by the liver. Wistar rats were used and insulin sensitivity was evaluated using the rapid insulin sensitivity test (RIST). The first hypothesis tested was that the sequence of events that lead to HISS secretion starts with an increase in the hepatic parasympathetic tone, followed by the activation of hepatic NOS and subsequent triggering of guanylate cyclase (GC). We observed that insulin resistance produced either by muscarinic receptor antagonism with atropine or by hepatic NOS inhibition was reversed by the intraportal administration of an NO donor. In contrast, intraportal acetylcholine (ACh) did not restore insulin sensitivity after NOS inhibition. We also observed that GC inhibition lead to a decrease in insulin sensitivity.These results suggest that the release of ACh in the liver activates hepatic NO synthesis in order to allow HISS secretion, through a signaling pathway modulated by GC. HISS release in response to insulin is controlled by the prandial status. The second hypothesis tested was that glutathione (GSH) is involved in HISS secretion since the hepatic levels of GSH are, like HISS action, decreased in the fasted state and increased after ingestion of a meal. We observed that hepatic GSH depletion led to insulin resistance of the same magnitude of that observed after inhibition of hepatic NOS. These results support the hypothesis that hepatic GSH is crucial in peripheral insulin action. Since, in the fasted state, both hepatic GSH and NO levels are low, we tested the hypothesis that intraportal o-administration of a GSH donor and an NO donor enhances insulin sensitivity in fasted Wistar rats, by restoring HISS secretion. We observed that GSH and NO increased insulin sensitivity in a GSH dose-dependent manner. We concluded that HISS secretion requires elevated levels of both GSH and NO in the liver. GSH and NO react to form a S-nitrosothiol, S-nitrosoglutathione (GSNO). The last hypothesis tested in this work was that HISS secretion/ action depends on the formation of GSNO. We observed that intravenous administration of -nitrosothiols (RSNOs) increased insulin sensitivity in animals fasted for 24 h, in contrast with the intraportal administration of the drug. This result suggests that RSNOs enhanced insulin sensitivity through a peripheral, and not hepatic, mechanism. The results obtained led to a restructuring of the HISS hypothesis, suggesting that the ingestion of a meal triggers the hepatic parasympathetic nerves, leading to the release of Ach in the liver, which in turn activates NOS. Simultaneously, hepatic GSH levels increase and react with NO to form a nitrosated compound, GSNO. S-nitrosoglutathione mimics HISS hypoglycaemic action at the skeletal muscle.

Schistosomose em modelo murino: estudo sobre granuloma hepático causado por ovos de Schistosoma mansoni

A schistosomose é uma doença parasitária que afecta cerca de 200 milhões de pessoas, com alta prevalência nos trópicos e que origina um grave problema de saúde pública. Ao longo da infecção, o sistema imunitário tenta de várias formas combater a presença do parasita. Inicialmente ocorre uma resposta imune mediada por células do tipo Th1, com o progresso da infecção, a resposta é substituída por uma resposta do tipo Th2 induzida durante a formação de granulomas. Este surge como resposta à presença de produtos tóxicos libertados pelos ovos do parasita retido nos tecidos. O fígado é o principal alvo do depósito de ovos, sofrendo alterações fisiopatológicas, e histológicas. O Mus musculus tem sido muito utilizados na infecção experimental por Schistosoma mansoni, para melhor se conhecer o papel da resposta imunitária na formação de granulomas hepáticos. No decorrer da infecção o granuloma sofre alterações desencadeadas pelas citocinas que o sistema imunitário produz. Estas alterações dividem-se em cinco fases: reacção inicial, exsudativa, exsudativa-produtiva, produtiva e involutiva granuloma. O presente trabalho, estudou as alterações sofridas pelo granuloma hepático (quantidade, dimensão e fase do granuloma), em três diferentes períodos de infecção (55, 90 e 125 dias) no modelo animal Mus musculus infectado com Schistosoma. mansoni, estirpe SmBh distribuídos por três grupos experimentais com diferente número de cercárias (50, 80, e 100). Verificou-se que ao longo da infecção a quantidade de granulomas aumenta, as dimensões têm uma tendência inicial para aumentar mas a partir dos 90 dias após a exposição sofrem uma diminuição. No grupo experimental com maior intensidade de infecção inicial a diminuição deu-se mais cedo. Em relação às fases de desenvolvimento do granuloma este sofre alterações ao longo de toda a infecção. Assim, aos 55 dias predomina a fase exsudativa, aos 90 todos os grupos apresentam maior percentagem de granulomas na fase produtiva e por fim aos 125 dias prevalece a fase involutiva. Todos estes resultados sugerem que a caracterização do granuloma nas diferentes fases de infecção pode depender do número de cercárias da exposição.