Probing key DNA contacts in AraR-mediated transcriptional repression of the Bacillus subtilis arabinose regulon.

Nucleic Acid Research (2007) Vol.37 N. 14 4755-4766

Functional domains of Bacillus subtilis transcription factor AraR and identification of aminoacids important for nucleoprotein complex assembly and effector-binding.

Journal of Bacteriology (Apr 2006) 3024-3036

The discovery of three lost ‘Salting’ carpets: science as a tool for revealing their history

Thesis presented at the Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, to obtain a Master degree in Conservation and Restoration,Specialization in Textiles

Role of a novel disulfide bridge within the all-beta fold of soluble Rieske proteins

Journal of Biological Inorganic Chemistry (2010)15: 271-281

Computational design with flexible backbone sampling for protein remodeling and scaffolding of complex binding sites

Dissertation presented to obtain the Doutoramento (Ph.D.) degree in Biochemistry at the Instituto de Tecnologia Qu mica e Biol ogica da Universidade Nova de Lisboa

Expression of the human carboxylesterase 2 enzyme (CES2) in mammalian cells

Dissertation to obtain a Master Degree in Biotechnology

Análise da estrutura e da função da proteína morfogenética RodZ de Bacillus subtilis

Resumo: RodZ é um componente do sistema morfogenético das células bacterianas. É uma proteína transmembranar que localiza em bandas ao longo do eixo longitudinal da célula. Em Bacillus subtilis, RodZ consiste numa porção citoplasmática, RodZn, e em uma parte extra-citoplasmática, RodZc. RodZn contém um domínio em helixturn- helix (HTH), enquanto que RodZc pode ser dividido num domínio coiled-coil e num domínio terminal C, de função desconhecida. Um segmento transmembranar (TM) único separa RodZn de RodZc. A eliminação de rodZ causa alongamento do nucleóide e leva à produção de células polares nucleadas. Aqui, mostramos que RodZn é estruturado, estável e em hélice α. Descobrimos que as substituições Y32A e L33A na suposta hélice de reconhecimento (3) do motivo HTH, bem como as substituições Y49A e F53A, fora do motivo HTH (4), causam divisão assimétrica, mas apenas as últimas levam à deslocalização sub-celular de RodZ. Sugerimos que as hélices 3 e 4 são utilizadas para uma interacção proteína-proteína ou proteína- DNA essencial para divisão celular enquanto que 4 deve contactar um componente do citosqueleto, possivelmente MreB, uma vez que a correcta localização sub-celular de RodZ depende desta proteína. Em todos os mutantes as células polares são anucleadas, pelo que concluímos que o alongamento do nucleóide não é um prérequisito para divisão assimétrica. RodZc é largamente não estruturado mas com conteúdo de folha , sendo estabilizado pelo domínio coiled-coil. Mostramos uma relação homóloga entre RodZc e a bomba de transporte Na+/Ca2+ NCX1 e identificámos dois resíduos no domínio C, G265 e N275, essenciais para a manutenção da forma celular. Estes resíduos fazem parte de um motivo em gancho que pode actuar como um local de interacção com um ligando desconhecido. RodZn e RodZc são monoméricos em solução. Contudo, na membrana, RodZ interage consigo própria num sistema de dois híbridos (Split-Ubiquitin) em levedura, sugerindo que possa formar multímeros in vivo.-----------ABSTRACT: RodZ is a transmembrane component of the bacterial core morphogenic apparatus. RodZ localizes in bands long the longitudinal axis of the cell, and it is though to functionally link the cell wall to the actin cytoskeleton. In Bacillus subtilis, RodZ consists of a cytoplasmic moiety, RodZn, and an extracytoplasmic moiety, RodZc. RodZn contains a predicted helix-turn-helix domain, whereas RodZc is thought to contain a coiled-coil region and a terminal C domain of unknown function. A single transmembrane domain separates RodZn from RodZc. Deletion of rodZ causes elongation of the nucleoid and leads to the production of polar minicells containing DNA. Here, we have studied the structure and function of RodZn and RodZc. We show that RodZn is a stable, folded, -helical domain. We discovered that the Y32A and L33A substitutions within the presumptive recognition helix (3) of the HTH motif, as well as the Y49A and F53A substitutions outside of the HTH motif (in 4) cause asymmetric cell division. However, only the substitutions in 4 cause sub-celular delocalization of RodZ. We suggest that 3 and 4 are used for a protein-protein or protein-DNA interaction important for cell division, whereas 4 is likely to contact a cytoskeletal component, presumably MreB. The polar cells formed by all the mutants are anucleate. We conclude that nucleoid elongation is not a prerequisite for asymmetric division. RodZc appears to be a largely unstructured domain, with some -sheet content, and is stabilized by the coiled-coil region. We show a homology relationship between RodZc and the NCX1 Na+/Ca2+ transporter and we found two residues within the C domain, G265 and N275, that are important for cell shape determination. These residues are predicted to be essential determinants of a claw-like motif, which may act as a binding site for an unknown ligand. Both the isolated RodZn and RodZc proteins are monomeric in solution. However, because full-length RodZ interacts with itself in a split-ubiquitin yeast two-hybrid assay, we suggest that it may dimerize or form higher order multimers in vivo.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry: new application for urinary stones analysis

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Física

Structural investigation of the Bacillus subtilis morphogenic factor RodZ

A thesis to obtain a Master degree in Structural and Functional Biochemistry

Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Staying under the radar - the multifunctional LANA Protein

Many viruses have developed numerous strategies to recruit and take advantage of cellular protein degradation pathways to evade the cellular viral immune system. One such virus is the Kaposi´s Sarcoma associated herpesvirus (KSHV), first discovered in Kaposi´s Sarcoma lesions found in AIDS patients. Latency-Associated Nuclear Antigen (LANA) is a KSHV multifunctional protein responsible for tethering viral DNA to the chromosome ensuring maintenance and segregation of the viral genome during cell division. Besides its main role of viral maintenance, LANA also physically interacts with several host proteins to modulate cell functions. One such function is to recruit the EC5S ubiquitin-ligase complex by interacting with Elongin BC complex and Cullin 5 protein, which in turn ubiquitinate substrates such as NF-κB and p53 to allow persistent viral infection. Like any other post-translation modifications, ubiquitination is reversible through deubiquitination enzymes (DUBs). LANA also interacts with ubiquitin specific protease 7 (USP7), a deubiquitination enzyme involved in regulation of several proteins including p53. Interaction with USP7 is made through a conserved peptide motif, which is also present in LANA. This work addresses the role of LANA in the recruitment and modulation of the ubiquitination and deubiquitination pathways. Despite the continued efforts in uncovering new LANA interacting partners to form a functional EC5S ubiquitin-ligase complex, only MHV-68 LANA interacted directly with Elongin BC, other interactions were not direct and may require a linker protein. On the other hand, LANA interaction with USP7 was able to be analysed by X-ray structure determination. In addition to a conserved P/AxxS motif, a novel Glutamine (Gln) residue from KSHV LANA was shown to make a specific interaction with USP7. This Gln residue is also present in other herpesvirus protein and hence it might be a conserved motif within herpesviruses.

Criminosos popularizados na narrativa de divulgação (De 1838 aos Alvores da República)

O presente estudo incide sobre obras impressas que tomaram como motivo central as «façanhas» de criminosos com referência histórica celebrizados em Portugal na segunda metade do século XIX e inícios de XX e mostra que, enquanto narrativas elaboradas para o grande público, os textos foram não só um reflexo da popularidade prévia dos famigerados transgressores, como também um fator incontornável da sua «lendarização» ao longo de décadas. São as seguintes as figuras dos infratores que protagonizaram as ficções em apreço: José Joaquim de Sousa Reis, ou «o Remexido» (1797-1838), Diogo Alves, ou «o Pancada» (1810-1841), Francisco de Matos Lobo (1814-1842), José Teixeira da Silva, ou «o José do Telhado» (1816-1875), João Victor da Silva Brandão, ou «o João Brandão de Midões» (1825-1880), e Vicente Urbino de Freitas (1859-1913). A tese agora apresentada aborda um corpus textual de características singulares, nunca antes coligido nem estudado. Comprova que os textos sobre as figuras criminosas tiveram uma função iminentemente noticiosa, pedagógico-edificante e política, apropriando-se de relatos orais, adotando procedimentos de atestação da veracidade (transcrição de documentos na primeira pessoa, referenciação cronológica, espacial, geográfica dos eventos, alusão às fontes) e incorporando diversas fontes do conhecimento dos crimes, quer de origem popular (geralmente designadas de «musa popular», «tradição»), quer de caráter erudito e teórico-científico («estudo», «estudo social»). Assim, foram analisadas as condições históricas excecionais nas quais as ficções emergiram: as características específicas do seu universo editorial, a apropriação a um público amplo (o formato de coleção, uso de sinopses e de outros elementos gráficos), as regularidades discursivas das obras (ocorrência de determinados dispositivos de organização textual), os procedimentos narrativos (recurso abundante a paratextos com intuito explicativo e aproximação a modalidades ficcionais conhecidas do público da época) e, ainda, as configurações imagéticas inspiradas nos discursos oficiais (influência de ciências e doutrinas epocais emergentes, como a criminologia, a antropologia criminal, a frenologia, a psiquiatria, a sociologia). Em suma, estas edições produzidas em diversos contextos e por um elenco autoral heterogéneo não só viveram da relação com as edições predecessoras, ao longo de gerações, como recriaram e ampliaram as «façanhas» dos transgressores em função de diversos propósitos e fontes: ampla divulgação dos casos criminais, condenação pública dos infratores, análise médico-científica dos sujeitos culpados, especulação política, pressão sobre o foro judiciário, edificação moral do público leitor. Trata-se, sem dúvida, de produções únicas, que erigiram a comemoração dos facínoras e sucessivamente reinscreveram as suas histórias reais na problemática do homem criminal e na consciência ética do seu tempo.