10 resultados para CA2 ATPASES
Resumo:
RESUMO: Sessenta e trs derivados de hidantona foram utilizados para avaliar possveis efeitos de modulao na actividade das bombas de efluxo (BE) na Salmonella NCTC 13349 utilizando um mtodo fluorimtrico semi-automtico. Nenhum dos compostos apresentaram actividade anti-bacteriana at concentraes de 240 mg/L. Entre todos os compostos, SZ-7 demonstrou possuir propriedades de modulao de effluxo na presena de glucose. Para testar esta actividade, estirpes de Salmonella resistentes ciprofloxacina, induzidas a elevados nveis de resistncia com sobre-expresso de BE, foram expostas ao SZ-7. Este derivado afectou a susceptibilidade das estirpes ciprofloxacina. Uma vez que os 63 compostos estudados apresentaram pouco efeito inibitrio /cumulativo, apesar de serem conhecidos pelos seus efeitos moduladores de BE-dependentes de ies em eucariotas, foi questionado o papel dos ies na regulao de BE bacterianas, que podero influenciar a eficcia de novos compostos. Para este estudo, utilizamos a Escherichia coli AG100 como modelo, devido ao extenso conhecimento no que respeita a estrutura e actividade das BE. Devido importncia de ies de clcio (Ca2+) nos canais de transporte membranar e na actividade de ATPases, a sua actividade na modulao do efluxo foi investigada. De resultados anteriormente obtidos concluiu-se que a pH 5 o efluxo independente de energia metablica; contudo, a pH 8 absolutamente dependente, sendo que o Ca2+ indispensvel para manter a actividade das ATPases bacterianas. A acumulao/effluxo de EtBr pela E. coli AG100 foi determinada na presena/ausncia de Ca2+, clorpromazina (inibidor de ligao de Ca2+ a protenas), e cido etilenodiamino tetra-actico (quelante de Ca2+). Acumulao/effluxo aumentou a pH 8, contudo o Ca2+ reverte estes efeitos evidenciando a sua importncia no funcionamento das BE bacterianas. Em resumo este trabalho colocou em evidncia que muitos aspectos bioqumicos e bioenergticos devem ser tomados em considerao no estudo da resistncia bacteriana mediada por BE.------- ABSTRACT: Sixty-three hydantoin derivatives were evaluated for their modulating effects on efflux pump (EP) activity of Salmonella NCTC 13349 utilizing a semi-automatic fluorometric method. None of the compounds presented antibacterial activities at concentrations as high as 240 mg/L. Among all compounds, SZ-7 showed possible efflux modulating activity in the presence of glucose, indicative of a potential EP inhibitor. To verify its potential effects, ciprofloxacin-resistant Salmonella strains, induced to high level resistance with over-expressing EPs, were exposed to SZ-7. This derivative affected the susceptibility of the ciprofloxacin-resistant strains. Since the 63 compounds studied had very low inhibitory/accumulative effects, even though their known for being efficient in modulating ion-driven eukaryotic EPs, we questioned whether ions had a leading role in regulating bacterial EPs, influencing the effectiveness of new compounds. For this study we used Escherichia coli AG100 as a model, due to the extensive knowledge on its EPs structure and activity. Owing the importance of calcium ions (Ca2+) for membrane transport channels and activity of ATPases, the role of Ca2+ was investigated. From previous results we concluded that at pH 5 efflux is independent of metabolic energy; however, at pH 8 it is entirely dependent of metabolic energy and the Ca2+ ions are essential to maintain the activity of bacterial ATPases. Accumulation and efflux of ethidium bromide (EtBr) by E. coli AG100 was determined in the presence and absence of Ca2+, chlorpromazine (inhibitor of Ca2+-binding to proteins), and ethylenediaminetetraacetic acid (Ca2+ chelator). Accumulation of EtBr increased at pH 8; however Ca2+ reversed these effects providing information as to the importance of this ion in the regulation of bacterial EP systems. Overall this work puts in evidence that many biochemical and bioenergetic aspects related to the strains physiology need to be taken into consideration in bacterial drug resistance mediated by EPs.
Resumo:
A resistncia aos antibiticos em bactrias Gram-negativas pode ser aumentada pela extruso de antibiticos atravs de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energtica a fora proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergtica na actividade de efluxo de E. coli usando trs estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um mtodo fluorimtrico semi-automtico no qual a fluorescncia do fluorocromo brometo de etdeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medio em tempo real da actividade de efluxo e acumulao de fluorocromo (inibio do efluxo). A utilizao de brometo de etdeo particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescncia no exterior da clula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este mtodo uma nova aplicao do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o clculo da cintica de transporte reflectindo o balano entre acumulao de substrato por difuso passiva atravs da membrana e a sua extruso/efluxo, proporcionando uma deteco rpida e econmica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulao e o efluxo do brometo de etdeo. De todos os inibidores de vias biossintticas testados, o ortovanadato de sdio, foi o que demonstrou maior actividade inibitria, a qual revertida na presena de GLU. Em concluso, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende no s da fosforilao oxidativa por via da fora proto-motriz mas tambm da energia proveniente da hidrlise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sdio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterizao bioenergtica da actividade de bombas de efluxo e permite a seleco de novos inibidores de bombas de efluxo em bactrias.
Resumo:
Febs Journal (2009)276:1776-1786
Resumo:
The S100 proteins are 10-12 kDa EF-hand proteins that act as central regulators in a multitude of cellular processes including cell survival, proliferation, differentiation and motility. Consequently, many S100 proteins are implicated and display marked changes in their expression levels in many types of cancer, neurodegenerative disorders, inflammatory and autoimmune diseases. The structure and function of S100 proteins are modulated by metal ions via Ca2+ binding through EF-hand motifs and binding of Zn2+ and Cu2+ at additional sites, usually at the homodimer interfaces. Ca2+ binding modulates S100 conformational opening and thus promotes and affects the interaction with p53, the receptor for advanced glycation endproducts and Toll-like receptor 4, among many others. Structural plasticity also occurs at the quaternary level, where several S100 proteins self-assemble into multiple oligomeric states, many being functionally relevant. Recently, we have found that the S100A8/A9 proteins are involved in amyloidogenic processes in corpora amylacea of prostate cancer patients, and undergo metal-mediated amyloid oligomerization and fibrillation in vitro. Here we review the unique chemical and structural properties of S100 proteins that underlie the conformational changes resulting in their oligomerization upon metal ion binding and ultimately in functional control. The possibility that S100 proteins have intrinsic amyloid-forming capacity is also addressed, as well as the hypothesis that amyloid self-assemblies may, under particular physiological conditions, affect the S100 functions within the cellular milieu.
Resumo:
Resumo: RodZ um componente do sistema morfogentico das clulas bacterianas. uma protena transmembranar que localiza em bandas ao longo do eixo longitudinal da clula. Em Bacillus subtilis, RodZ consiste numa poro citoplasmtica, RodZn, e em uma parte extra-citoplasmtica, RodZc. RodZn contm um domnio em helixturn- helix (HTH), enquanto que RodZc pode ser dividido num domnio coiled-coil e num domnio terminal C, de funo desconhecida. Um segmento transmembranar (TM) nico separa RodZn de RodZc. A eliminao de rodZ causa alongamento do nucleide e leva produo de clulas polares nucleadas. Aqui, mostramos que RodZn estruturado, estvel e em hlice . Descobrimos que as substituies Y32A e L33A na suposta hlice de reconhecimento (3) do motivo HTH, bem como as substituies Y49A e F53A, fora do motivo HTH (4), causam diviso assimtrica, mas apenas as ltimas levam deslocalizao sub-celular de RodZ. Sugerimos que as hlices 3 e 4 so utilizadas para uma interaco protena-protena ou protena- DNA essencial para diviso celular enquanto que 4 deve contactar um componente do citosqueleto, possivelmente MreB, uma vez que a correcta localizao sub-celular de RodZ depende desta protena. Em todos os mutantes as clulas polares so anucleadas, pelo que conclumos que o alongamento do nucleide no um prrequisito para diviso assimtrica. RodZc largamente no estruturado mas com contedo de folha , sendo estabilizado pelo domnio coiled-coil. Mostramos uma relao homloga entre RodZc e a bomba de transporte Na+/Ca2+ NCX1 e identificmos dois resduos no domnio C, G265 e N275, essenciais para a manuteno da forma celular. Estes resduos fazem parte de um motivo em gancho que pode actuar como um local de interaco com um ligando desconhecido. RodZn e RodZc so monomricos em soluo. Contudo, na membrana, RodZ interage consigo prpria num sistema de dois hbridos (Split-Ubiquitin) em levedura, sugerindo que possa formar multmeros in vivo.-----------ABSTRACT: RodZ is a transmembrane component of the bacterial core morphogenic apparatus. RodZ localizes in bands long the longitudinal axis of the cell, and it is though to functionally link the cell wall to the actin cytoskeleton. In Bacillus subtilis, RodZ consists of a cytoplasmic moiety, RodZn, and an extracytoplasmic moiety, RodZc. RodZn contains a predicted helix-turn-helix domain, whereas RodZc is thought to contain a coiled-coil region and a terminal C domain of unknown function. A single transmembrane domain separates RodZn from RodZc. Deletion of rodZ causes elongation of the nucleoid and leads to the production of polar minicells containing DNA. Here, we have studied the structure and function of RodZn and RodZc. We show that RodZn is a stable, folded, -helical domain. We discovered that the Y32A and L33A substitutions within the presumptive recognition helix (3) of the HTH motif, as well as the Y49A and F53A substitutions outside of the HTH motif (in 4) cause asymmetric cell division. However, only the substitutions in 4 cause sub-celular delocalization of RodZ. We suggest that 3 and 4 are used for a protein-protein or protein-DNA interaction important for cell division, whereas 4 is likely to contact a cytoskeletal component, presumably MreB. The polar cells formed by all the mutants are anucleate. We conclude that nucleoid elongation is not a prerequisite for asymmetric division. RodZc appears to be a largely unstructured domain, with some -sheet content, and is stabilized by the coiled-coil region. We show a homology relationship between RodZc and the NCX1 Na+/Ca2+ transporter and we found two residues within the C domain, G265 and N275, that are important for cell shape determination. These residues are predicted to be essential determinants of a claw-like motif, which may act as a binding site for an unknown ligand. Both the isolated RodZn and RodZc proteins are monomeric in solution. However, because full-length RodZ interacts with itself in a split-ubiquitin yeast two-hybrid assay, we suggest that it may dimerize or form higher order multimers in vivo.
Resumo:
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Biotecnologia
Resumo:
Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Qumica e Bioqumica
Resumo:
A resistncia aos antibiticos em bactrias Gram-negativas pode ser aumentada pela extruso de antibiticos atravs de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energtica a fora proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergtica na actividade de efluxo de E. coli usando trs estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um mtodo fluorimtrico semi-automtico no qual a fluorescncia do fluorocromo brometo de etdeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medio em tempo real da actividade de efluxo e acumulao de fluorocromo (inibio do efluxo). A utilizao de brometo de etdeo particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescncia no exterior da clula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este mtodo uma nova aplicao do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o clculo da cintica de transporte reflectindo o balano entre acumulao de substrato por difuso passiva atravs da membrana e a sua extruso/efluxo, proporcionando uma deteco rpida e econmica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulao e o efluxo do brometo de etdeo. De todos os inibidores de vias biossintticas testados, o ortovanadato de sdio, foi o que demonstrou maior actividade inibitria, a qual revertida na presena de GLU. Em concluso, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende no s da fosforilao oxidativa por via da fora proto-motriz mas tambm da energia proveniente da hidrlise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sdio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterizao bioenergtica da actividade de bombas de efluxo e permite a seleco de novos inibidores de bombas de efluxo em bactrias.
Resumo:
A hemoterapia moderna baseia-se na utilizao correcta dos diversos componentes sanguneos, associados a um maior controle de qualidade do sangue, o que a torna mais segura e, actualmente, muitos doentes sao beneficiados pois, a transfuso de componentes sanguineos, em situaoes vrias, est na linha da frente na manuteno da vida e em casos extremos, o ltimo recurso que salva vidas. A qualidade e a segurana nas transfuses de sangue so grandes preocupaes da rea mdica, autoridades de sade e doente1. O sangue obtido pelos Centros de Sangue provem de dadores voluntrios, dotados de uma enorme sensibilidade social, que periodicamente assumem uma postura benevola e altruista e consequentemente mantm os bancos de sangue providos de um produto imprescindivel no tratamento de diversas patologias. O produto final disponvel concentrado de eritrcitos (CEs), plasma e concentrado plaquetrio tem de assumir um carcter seguro e vivel de modo a que os riscos para o doente sejam diminutos2. O controlo de qualidade aplicado a todo o sangue doado realiza provas de conformidade nas unidades com especificaes previamente definidas, sendo a hmolise um dos parmetros importantes na avaliao da qualidade dos concentrados de eritrcitos, pois, pode ocasionar implicaes clinicas para o receptor. Para alm disso a avaliao da concentrao de hemoglobina (Hg) no sangue doado mostra-se um controlo imprescindivel que salvaguarda a qualidade e segurana do componente a transfundir3;4.At se obter um CE h todo um processo moroso e de responsabilidade vital. Todo o sangue obtido passa por vrias etapas fundamentais at obteno do componente pretendido (analise, produo e armazenamento). Os CEs obtidos quando armazenados, num ambiente de refrigerao, tm uma vida til de 42 dias. Aps este perodo, o sangue deve ser inutilizado por se verificar alteraes bioqumicas, biomecnicas, e imunolgicas nos CEs e por consequncia a sua instabilidade vital no que ao tratamento de patologias, para as quais este componente est indicado, diz respeito5. Foi realizado um estudo experimental com o objetivo de avaliar a contribuio da Anexina V na apoptose celular nos concentrados de eritrcitos, constatando a degradao dos mesmos ao longo de todo o perodo de armazenamento e validar o paradigma que a cincia preconiza: Os CEs aps os 42 dias armazenados, em condies especficas (2 a 6 centgrados), so inviaveis para transfundir6;7. A avaliao dos nveis de apoptose por citometria de fluxo geralmente realizada por mtodos que utilizam Anexina V como marcador vital, que se associa aos resduos de fosfatidilserina, externalizados no incio do processo apopttico. A Anexina V uma protena humana endgena dependente do io Ca+2, amplamente distribuda intracelularmente em altas concentraes na placenta e em concentraes mais baixas nos eritrcitos, plaquetas e moncitos. Apresenta como principal caracterstica a capacidade de se ligar fosfatidilserina, um fosfolipdo presente na camada interna da bicamada lipdica, que durante a apoptose celular translocada para a camada externa da membrana celular. A determinao da Anexina V normalmente utilizada para verificar se as clulas so viveis, apoptticas ou necrticas por meio de diferenas na integridade da membrana plasmtica. Assim, ao conjugar a Anexina V ao FITC (Isotiocianato de fluorescena) possvel identificar e quantificar as clulas apoptticas por citometria de fluxo7. Numa amostra de 15 CEs, a qual foi induzida a hemlise, verificou-se, por citometria de fluxo, que a viabilidade deste componente se desvanesce ao longo do tempo, confirmando assim que o tratamento, manuseamento e armazenamento do sangue compromete a vitalidade terapeutica deste insubstituivel produto vital.
Resumo:
Uma caraterstica comum a muitas doenas neurodegenerativas a formao de agregados proteicos e amilides, no que se designa a cascata amilode. O foco deste trabalho o estudo do homodmero S100A9 e do heterodmero S100A8/A9, duas das protenas da resposta neuroinflamatria, que se encontram elevadas na vizinhana de depsitos proteicos, nomeadamente na doena de Alzheimer. Estas protenas pertencem famlia das S100, que possuem dois domnios EF-hand de ligao a Ca2+, e ligam tambm cobre e zinco. Este estudo visa contribuir esclarecer se as protenas S100A8 e A100A9 estaro envolvidas na cascata de agregao amilide, por formao direta de agregados das S100, ou mediante a associao com ies metlicos, cuja disfuno caracterstica em doenas neurodegenerativas. O primeiro passo do trabalho consistiu em expressar e purificar a S100A9 e a S100A8/A9, optimizando o processo. Os estudos de estabilidade trmica na presena e ausncia de Ca2+, Cu2+ e Zn2+, revelaram que a S100A8/A9 termodinamicamente mais estvel que a S100A9. Os trs ies metlicos so destabilizadores da S100A9, diminuindo a sua estabilidade trmica. Para a estabilidade trmica da S100A8/A9 os mesmos ies no mostraram ter um efeito significativo, pelo que se sugere uma conformao diferente com o core hidrofbico mais blindado, aumentando a estabilidade. Realizaram-se tambm ensaios cinticos de agregao, que revelram que a S100A9 apresenta uma agregao heterognea, no dependente de nucleao na presena dos metais. No caso da S100A8/A9, os trs ies metlicos potenciam a agregao. Por fim, analisou-se a hiptese de S100A9 e S100A8/A9 como moduladores de agregao do pptido A1-42. O A1-42 mostrou ter influncia na agregao da S100A9 e da S100A8/A9, podendo estas protenas ser potenciadoras da agregao. Este trabalho revelou que a agregao das protenas em estudo influenciada e potenciada pela ligao dos ies metlicos, pelo que se sugere que estes tenham um papel crucial na formao de agregados de S100A8/A9 e de S100A9.
