Transglutaminases do mosquito Anopheles gambiae: Caracterização genética, bioquímica e funcional durante a infecção por Plasmodium berghei

A malária constitui um problema de saúde pública, que tem vindo a agravar-se, sendo crescente a necessidade de estratégias renovadas para o seu controlo, como a interrupção do ciclo esporogónico. Deste modo, é essencial compreender as respostas imunológicas de Anopheles anti-Plasmodium. Demonstrou-se anteriormente, que a inibição de transglutaminases, enzimas que participam em vários processos biológicos ao catalisarem a formação de ligações covalentes entre péptidos, agrava a infecção em mosquitos pelo parasita. O presente trabalho tem por objectivo caracterizar as transglutaminases AGAP009098 e AGAP009100 de Anopheles gambiae. Os métodos utilizados para este efeito foram: a sequenciação de regiões dos genes AGAP009098 e AGAP009100; a clonagem molecular de fragmentos da região codificante do gene AGAP009098, usando o vector plasmídico pET–28a(+) e Escherichia coli como sistema de expressão; e PCR em Tempo Real para analisar a expressão relativa dos genes AGAP009098 e AGAP009100 nos diferentes os estádios de desenvolvimento. AGAP009098 é expressa ubiquamente e AGAP009100 a partir do estádio pupa. Estes resultados apontam para a conclusão de que AGAP009098 e AGAP009100 poderão desempenhar funções em processos biológicos relevantes, por exemplo na defesa imunitária, ou no desenvolvimento. Os péptidos recombinantes, obtidos a partir da clonagem com sucesso de fragmentos da região codificante do gene AGAP009098, constituem uma ferramenta importante para averiguar a função destas TGases, no futuro.

The role of detoxification in the mosquito Anopheles gambiae response to Plasmodium infection

Rute C. Félix PALAVRAS-CHAVE: Malária, mosquito vector, Anopheles gambiae, parasita, Plasmodium berghei, infecção, enzimas de detoxificação, citocromos P450, tubulinas A malária, uma das doenças mais devastadoras que ocorrem em África é causada por um parasita do género Plasmodium e é transmitida aos humanos por mosquitos vectores do género Anopheles durante a refeição de sangue. Apesar da resposta do mosquito à infecção por Plasmodium ter vindo a ser intensamente estudada nos últimos anos, as interacções entre o mosquito vector e o parasita são muito complexas e, estão longe de serem completamente compreendidas. Este estudo tem como objectivo principal contribuir para o conhecimento da resposta do mosquito à infecção por Plasmodium, focando-se no papel das enzimas de detoxificação. Para atingir este objectivo realizouse uma análise transcriptómica com microarrays, com o intuito de identificar alterações de transcrição de enzimas de detoxificação no mosquito Anopheles gambiae em resposta à infecção por Plasmodium. Esta análise permitiu identificar alterações na expressão de 254 genes de destoxificação no estômago e corpo gordo de A. gambiae durante a invasão do intestino médio pelos oocinetos e durante a libertação dos esporozoítos do oocisto. Os resultados mostraram que a invasão do intestino médio pelos oocinetos causou alterações num maior número de genes em ambos os tecidos estudados, sendo o intestino médio do mosquito o tecido mais afectado nas duas fases da infecção do parasita. De todos os genes de destoxificação com expressão alterada, as tubulinas e os citocromos P450 destacaram-se e foram escolhidos para continuar o estudo. As tubulinas foram seleccionadas porque estão associadas à invasão do epitélio do intestino médio e a sua função na resposta à invasão do Plasmodium ainda não está bem definida. Os citocromos P450 foram seleccionados porque já foram descritos como tendo a expressão alterada em resposta ao Plasmodium e a outras infecções. Para identificar e caracterizar o papel das tubulinas durante a infecção pelo parasita e a sua possível associação com os citocromos P450 foi utilizado o silenciamento génico por RNA de interferência e a injecção de inibidores químicos de tubulinas. O silenciamento e co-silenciamento das tubulinas causaram um aumento da taxa e intensidade da infecção. No entanto, apesar de o aumento ser consistente não foi significativo. Por outro lado, a injecção de paclitaxel, um inibidor de tubulinas, aumentou significativamente a taxa e intensidade da infecção, fortalecendo a hipótese do envolvimento das tubulinas na resposta à infecção por Plasmodium. Este trabalho também mostrou que o co-silenciamento da tubulina A e tubulina B e a injecção do inibidor de tubulinas colchicine causam alterações significativas na expressão da CYP6Z2, sendo este proposto como um possível elo de ligação entre as tubulinas e os citocromos P450. Finalmente, uma análise comparativa foi realizada para estudar as regiões promotoras dos citocromos P450: CYP6M2 e o CYP6Z1. Este estudo obteve novos dados sobre compostos que activam estes citocromos e quais os possíveis factores de transcrição envolvidos. Dos diferentes estímulos utilizados, a exposição a insecticidas e a bactérias foram os que mais afectaram estes citocromos. O conjunto total das diferentes abordagens utilizadas neste trabalho contribuiu para aumentar o conhecimento do papel das enzimas de destoxificação durante a passagem do parasita da malária pelo mosquito vector.

Transglutaminases de Anopheles gambiae: caracterização molecular, bioquímica e histológica.

A malária é causada por parasitas protozoários do género Plasmodium spp, a sua transmissão aos humanos deve-se à picada infecciosa de mosquitos fêmea do género Anopheles spp, sendo Anopheles gambiae o vector mais eficiente de malária em todo o mundo. O intestino médio do mosquito representa um dos ambientes mais desafiantes à sobrevivência e desenvolvimento do parasita, e é, portanto, também um dos locais mais atraentes para novas estratégias de controlo da malária, pois é onde se observa uma diminuição acentuada na população de parasitas invasores. A transglutaminase (TGM) desempenha um papel importante e diversificado em mamíferos, tais como a coagulação e a formação da barreira epitelial, catalisando o “crosslinking” entre proteínas. Em invertebrados, como Drosophila sp, a proteína TGM mostrou estar envolvida na defesa imunitária. O mosquito A. gambiae tem codificado no seu genoma três TGMs, o gene AGAP009099, já caracterizado, é expresso exclusivamente nas MAGs (glândulas auxiliares masculinas). Os genes AGAP009098 e AGAP009100, cujas funções não foram ainda clarificadas, são expressos ubiquamente e em baixos níveis. No presente trabalho, propõe-se a caracterização das duas proteínas codificadas por estes genes, de forma a identificar o modo como estas proteínas interagem dentro do mosquito, a esclarecer o seu papel na invasão do intestino médio de A. gambiae por Plasmodium spp., o que permitirá averiguar o seu envolvimento ao nível da imunidade inata do mosquito. Foi produzida e purificada a proteína recombinante AgTGM98-1, que se utilizou para a produção de um anticorpo anti-AgTGM98. A atividade de TGM no mosquito não se mostrou estatisticamente significativa entre os estadios larvares, pupas e adultos. A caracterização bioquímica de AgTGM98 e AgTGM100 revelou a possível existência de proteínas do tipo TGM. Através de western blotting, verificou-se uma diminuição de AgTGM98, comparando mosquitos não infetados com infetados por P. berghei, o que sugere alterações na expressão desta proteína face à invasão pelo parasita, o que pode significar o seu envolvimento direto na infeção. Caracterizou-se, por imunohistoquímica (IHC) a localização de AgTGM98 e AgTGM100 em intestinos médios de mosquitos. A proteína AgTGM98 apresentou uma localização membranar, na parte basal do intestino médio e com distribuição ao longo deste. Contrariamente, a AgTGM100 tem uma localização intracelular e uma distribuição presente apenas no proventrículo e zona mais apical do intestino médio durante uma fase da sua existência, sendo com o passar do tempo detectada em todo o intestino médio.

Resistência a insecticidas em Anopheles gambiae s.l. na Região de Luanda, Angola

Em Angola, a malária é a principal causa de morbilidade e de mortalidade infantil. O controlo de vectores com recurso aos insecticidas representa uma parte importante da estratégia actual para a prevenção da doença. Em Anopheles gambiae s.s., principal vector de malária em África, estão identificadas duas mutações pontuais no gene que codifica os canais de sódio das membranas das células do sistema nervoso, conferindo resistência knockdown (kdr) aos insecticidas piretróides e ao DDT. Também se encontra descrita para esta espécie uma mutação no gene acetilcolinesterase-1 (ace-1), associada à resistência a carbamatos e organofosfatos. Este trabalho teve como principal objectivo avaliar o nível de resistência aos insecticidas em An. gambiae da província de Luanda, Angola e determinar a frequência destas mutações. Foram realizadas colheitas entomológicas em 2009 e 2010, através da prospeção de criadouros larvares. Os insectos capturados foram criados até a emergência do adulto e sujeitos a ensaios de susceptibilidade a insecticidas, através de testes da OMS. A identificação de espécies e formas moleculares do complexo An. gambiae, bem como a pesquisa de mutações no gene ace-1 foram feitas por PCR-RFLP. A pesquisa de mutações no gene kdr foi realizada por PIRA-PCR. Amostras selecionadas de mosquitos (incluindo uma amostra proveniente de uma colheita de adultos) foram ainda genotipadas para 11 loci microssatélites. Os níveis de resistência para a permetrina, DDT e -cialotrina foram elevados, com taxas de mortalidade inferiores a 70% em ambos os anos. Em contraste, as taxas de mortalidade foram sempre acima de 98% para bendiocarb e fenitrotião, indicadoras de susceptibilidade a estes insecticidas. Todas as amostras processadas foram identificadas como An. gambiae s.s., forma molecular M e não se observou a mutação no gene ace-1 associada à resistência. Em ambos os anos, foi detectada apenas a mutação L1014F no locus kdr e a frequência do alelo mutante (TTT) foi bastante elevada. Em 2009, observou-se uma associação entre genótipos homozigóticos para o alelo 1014F e o fenótipo resistente, para os insecticidas piretróides e para o DDT. O polimorfismo dos loci microssatélites analisados foi elevado, com a riqueza alélica a variar entre 5 (45C1) e 20 (H128) e a heterozigotia esperada entre 0,529 (H577) e 0,862 (H249). A análise genética não revelou um grau de parentesco entre os indivíduos que constituíram as amostras estudadas. Este resultado sugere que os elevados níveis de resistência observados não foram influenciados pelo método de colheita de mosquitos que, em certas condições, poderia contribuir para a amostragem de indivíduos aparentados.

Estudo da influência da flora intestinal do mosquito Anopheles sp. no estabelecimento da infecção por Plasmodium Berghei

A malária é uma doença infecciosa com um efeito devastador nas áreas afectadas. É provocada pelo protozoário Plasmodium e transmitida pelo insecto vector do género Anopheles. As fêmeas hematófagas ao alimentar-se de um hospedeiro infectado vão dar continuidade ao ciclo de vida do parasita e transmiti-lo a um novo hospedeiro na próxima refeição sanguínea. O intestino médio dos mosquitos é um órgão imunocompetente, onde a presença de microrganismos vai activar o sistema imunitário, determinando a sua capacidade vectorial. Novas abordagens de controlo biológico de doenças transmitidas por vectores parecem ganhar terreno. P. aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, potencialmente patogénica, em especial as estirpes produtoras de muco, sendo um microrganismo modelo em estudos de biofilmes. Estes são caracterizados por conferir tolerância a antibióticos e resistência ao sistema imune do hospedeiro. Com este trabalho pretendeu-se analisar o efeito da influência da flora bacteriana, nomeadamente isolados de Pseudomonas aeruginosa produtores de muco e não produtores, presentes no tracto digestivo de Anopheles sp. e a sua relação com a infecção por P. berghei. Com este estudo é possível afirmar a existência de uma proporcionalidade directa entre a taxa de infecção por P. berghei e a ausência da Microbiota. A presença de Pseudomonas produtoras de muco no intestino médio dos mosquitos demonstrou conferir algum grau de protecção no estabelecimento da infecção, bem como na intensidade da mesma. Contudo, mais estudos necessitam ser realizados e com um maior número de mosquitos, de forma a ultrapassar as limitações impostas pelo tratamento antibacteriano. Possivelmente, a sobreposição de respostas imunes anti-bacterianas e anti-Plasmodium, vão provocar um incremento no sistema imune e limitação das infecções por Plasmodium. Biofilmes bacterianos têm demonstrado a capacidade de aderir e inibir o crescimento de protozoários Uma melhor compreensão do papel da flora microbiana face ao sistema de defesa do hospedeiro poderá contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo da transmissão da malária.