Anemia de células falciformes na idade pediátrica : contribuição para o estudo das suas principais complicações e indicadores de prognóstico

RESMO: Introdução: A anemia de células falciformes doença hereditária, com repercussão multi-orgânica, tem grande variabilidade na sua expressão clínica. Daí o interesse do estudo de indicadores de prognóstico. A investigação realizada foi precedida de um resumo histórico incidindo sobre a compreensão de aspectos fundamentais da doença ao longo dos tempos. Na primeira parte do estudo e após revisão bibliográfica, foram referidos dados da fisiopatologia como base para os estudos que integram a presente dissertação. Abordou-se o estado da arte relativamente às complicações, aos indicadores de prognóstico e à terapêutica utilizada. Objectivos: Constituíram objectivos deste estudo realizado numa amostra populacional representativa: identificar as lesões a nível dos sistemas cardio-respiratório e nervoso central, avaliando-se as respectivas repercussões; avaliar a presença de indicadores de prognóstico entre as variáveis seleccionadas; estudar a eficácia e toxicidade da HU nos doentes com as formas graves da ACF. Para a prossecução destes objectivos foram delineados para além do estudo global três estudos específicos: Estudo 1- repercussão no sistema cardio-respiratório; Estudo 2- repercussão no sistema nervoso central; Estudo 3- terapêutica com hidroxiureia. Doentes e métodos: Procedeu-se a um estudo prospectivo e multi-institucional durante um período de três anos tendo-se seleccionado para a amostra, e de acordo com critérios pré-definidos, 30 doentes com ACF na fase estável da doença, com idades compreendidas entre os sete e os 18 anos, todos de origem africana à excepção de um caucasiano. O diagnóstico baseou-se em técnicas de electroforese e estudo molecular que definiu o genotipo da doença e a presença da delecção da -talassémia assim como os haplotipos da amostra populacional. Foram utilizadas diferentes metodologias para avaliar a existência de lesão pulmonar e cerebral. Através do estudo estatístico foram seleccionadas diversas variáveis como hipotéticos indicadores de prognóstico. Estudo 1. Para determinar a existência de lesão a nível pulmonar usaram-se duas metodologias diferentes, a avaliação da função pulmonar com estudo da saturação da Hb em O2 no sangue arterial e a tomografia computadorizada de alta resolução. Estudou-se também a possível disfunção cardíaca como repercussão da lesão pulmonar, através do ecocardiograma, e os indicadores de prognóstico com significado estatístico para a lesão encontrada. Estudo 2. O desenho deste estudo foi sobreponível ao anterior, mas com metodologia adequada para o SNC. Procedeu-se ao estudo das lesões cerebrais por meio de exames imagiológicos, (RMN-CE e DTC) e de testes psicológicos. Correlacionaram-se as três metodologias utilizadas e a importância de cada uma para a decisão de atitudes terapêuticas preventivas. Estudo 3. Consistiu num estudo aberto prospectivo não controlado com nove crianças e adolescentes com formas graves de ACF, com o objectivo de avaliar a eficácia da terapêutica com hidroxiureia, durante um período de 24 meses. Todos os doentes completaram no mínimo 15 meses de terapêutica, com uma dose final média de 194 mg/K/dia. Resultados globais: Durante o período anterior à investigação caracterizou-se a amostra populacional estudada quanto ao fenotipo genético, clínico e hematológico de acordo com os critérios utilizados por outros investigadores. Verificou-se: predomínio do haplotipo Bantu na forma homozigótica em 53% dos doentes; número total de EVO ≥3/ano em 87,5% dos doentes; crises de sequestração em 18,75%; dactilites no primeiro ano de vida em 31,2%; quadro de sépsis grave apenas num doente; crises de hiper-hemólise em 50%; e STA em 59,38% dos doentes. Quanto ao fenotipo hematológico evidenciaram-se como factores de risco reticulocitose (13,1x103/l) e hiperbilirrubinémia (2,5 mg/dl) e como factores de bom prognóstico a presença de delecção de um gene da -talassémia em 46,9% dos doentes e valor médio de Hb 8,1 g/dl. Resultados dos estudos parcelares: Estudo 1. Deste estudo infere-se que a DPR ligeira foi diagnosticada em 70% dos doentes, uma vez que as alterações da difusão não foram estatisticamente significativas, o estudo dos gases no sangue não evidenciaram resultados anormais e a TCAR evidenciou alterações em 43,3% dos doentes. Apenas num doente se verificou doença pulmonar obstrutiva relacionada com maior número da STA.O estudo da disfunção cardíaca encontrada em 86,7% dos doentes não reflecte a repercussão da DPR a nível cardíaco, podendo estar associada às alterações fisiopatológicas da própria anemia crónica. Encontraram-se indicadores de prognóstico hematológicos e clínicos. Entre os primeiros, valores de Hb ≥8,5 g/dl e de HbF ≥13% foram considerados indicadores de bom prognóstico para a lesão pulmonar. Em relação aos parâmetros clínicos, as STA não foram consideradas indicadoras de prognóstico para a DPR ao contrário do que se verificou com o número de EVO. Pela análise dos parâmetros genéticos e socio-económicos provou-se a ausência de relação estatisticamente significativa com lesão pulmonar. Estudo 2. Pela RMN-CE foram diagnosticados ES em 33,3% com uma localização preferencial na substância branca profunda em 26,6% dos doentes. Relativamente aos parâmetros hematológicos seleccionados, o valor médio da HbF 8,6% constituíu um indicador de bom prognóstico para o aparecimento de ES, enquanto o valor médio de leucócitos 12.39x103/μl foi considerado um indicador de mau prognóstico. No estudo do DTC apenas um doente apresentou aumento da velocidade do fluxo cerebral na ACM igual a 196 cm/segundos, associado a vasculopatia grave. Os testes psicológicos alterados em 80% dos doentes mostraram ser o método mais sensível para detectar alterações do neurodesenvolvimento, mas sem correlação com os ES em 10% dos doentes. Realça-se a baixa percentagem de DTC patológicos encontrados neste estudo em relação ao número elevado de ES e de testes psicológicos alterados, não se verificando concordância entre os três exames. Dos indicadores de prognóstico estudados a -talassémia foi considerada um factor de protecção para o coeficiente de inteligência da escala de Wechsler. Em relação a parâmetros clínicos estudados os doentes com maior número de EVO, tem em média valores inferiores nos testes psicológicos. Estudo 3. Neste estudo verificou-se que o valor médio da HbF aumentou significativamente de 7,0±4% para 13,7±5,3% (p=0,028) ao fim de 15 meses de terapêutica com hidroxiureia. Clinicamente todos os doentes responderam significativamente com uma redução de 80% no número de EVO, 69% no número de internamentos, 76% no número de dias de hospitalização e 67% no número de transfusões. Deste modo comprovou-se não só a eficácia desta terapêutica neste grupo pediátrico como também a falta de efeitos secundários significativos. Considera-se a necessidade de estudos mais prolongados e em grande séries, para com segurança se usar a HU antes que a lesão orgânica se estabeleça, portanto logo nos primeiros anos de vida. Conclusão: Na amostra populacional estudada foram evidenciadas lesões pulmonares e cerebrais na grande maioria dos doentes que condicionaram a sua qualidade de vida. Foram identificados indicadores de prognóstico que poderão eventualmente ditar medidas terapêuticas precoces com o objectivo de diminuir a morbilidade e a mortalidade neste grupo etário. Demonstrou-se que a terapêutica com a HU foi eficaz e bem tolerada----------ABSTRACT: Background: Sickle cell anemia (SCA), a hereditary disease characterized by pain and lifetime multi-organic lesion, is a challenge for all that work with carriers of this disease. The clinical expression variability of SCA is a constant reality and a problem to be solved in the current world of investigation, for which the knowledge of prognostic indicators responsible for the different aspects of clinical evolution diversity wiil be an added value. The study is preceded by a historical summary of the most important factors in the evolution of SCA, which are in themselves, an incentive for future research. In the first part of the study, after an extensive bibliographical revision, physiopathology data is referred to in general and specifically regarding the target organs, that constituted the base for the studies presented in the dissertation. The state of the art for the complications to be studied, the choice of prognostic indicators and the therapeutics application, were approached for the renewed interest in the theme. Aims: In regard to the investigation, the objective was to study the lesions in the most affected organs of a chosen pediatric group, to investigate prognostic indicators for lung and cerebral lesions and to evaluate the protective effect of hydroxyurea in children with severe outcomes. Patients and methods: A prospective and multi-institutional study was carried out during a three-year period, February 1998 to March 2001, with children and adolescents followed up at a Immunohematology Outpatient Clinic of Dona Estefânia's Hospital, Lisbon. Based in predefined criteria, 30 children with SCA were selected in a stable phase of the disease, aged from seven to 18 years old, all of whom were of African origin with exception of one who was Caucasian. The diagnosis was based on electrophoresis techniques and molecular study that allowed to define the genotype, the presence of deletional alpha-thalassemia as well as haplotypes in the population. Different methodologies were used to evaluate the existence of lung and cerebral lesion. Statistical study of the different variables selected the prognostic indicators. In Study 1, to determine the existence of lung lesion two different methodologies were used: pulmonar function study with arterial blood gases determination; and high resolution computerized tomography. Heart dysfunction as a repercussion of lung lesion was also studied through echocardiography, and prognostic indicators were statistically significant for lesions found. The design of Study 2 was similar to Study 1, but with the appropriate methodology for CNS. After neurological examination, which was normal in all patients (control group), cerebral lesions were studied with imagiologic exams (MRN-CE and TCD) and psychological tests. These three methodologies were correlated and the importance of each one in the decision of the therapeutic profilactic attitudes. Study 3 consisted of a controlled prospective open study in children with severe forms of SCA, with the aim of the evaluating therapeutic effectiveness of hydroxyurea, during a period of 24 months. Results: In the global overall study preceding the Studies 1,2 and 3, there were a prevalence of haplotype Bantu (53%) and other risk factors, namely the number of VOC (87,5%), sequestration crisis (18,75%), dactilytis in first year of life(31,2%), hyperhemolysis crisis (50%) and ATC in more than half of the patients (59,38%). This group of bad prognostic indicators, associated with the population of the lower class according to the Graffar scale, demonstrates the importance of primary health care services, information provided to the children and their relatives, as well as the interest in prophylactic therapeutics, specific screening and prenatal diagnosis. Study 1. It was evident from this study that slight RPD was diagnosed in 70% of the patients, because alterations of the diffusion had no statistical significance and arterial blood gases determinations were normal. Only one patient had restrictive lung disease related with numerous ACS. However ACS was not considered a prognostic indicator for RPD, contrary to the number of EVO. HRTC revealed discreet fibrotic lines that could be related with slight RPD, but the lack of correlation of these two exams (33%) supports the value of lung function tests for precocious diagnosis of RPD. Heart dysfunction was found in 86,7% of patients, does not reflect the repercussion of RPD, but with the physiopathology of chronic anemia. Hematologic and clinical prognostic indicators were found. Good prognostic indicators for the non-evolution of RPD with average Hb values of ≥ 8,5 g/dl and average HbF values of ≥13%, respectively. The genetic and social-economic factors had no statistical significance; nevertheless, they were more prevalent among Bantu haplotype (53,3%) in patients with RPD. Study 2. RMN-CE detected SI in 33,3% of the patients, with preferential location in deep white substance in 26,6% and in front lobe in 20%. This distribution can be related to structural aspects of the brain and with the high sensibility of this organ to hypoxia. From the hematological parameters selected, average HbF value 8,6% and average leucocyte count 12.39x103/μl were prognostic indicators with different meaning to SI. The increase in the total bilirubin related to hyperhemolysis clinically explains the genesis of SI In the TCD study, only one patient had increased cerebral flow speed >196 cm/sec in CMA, which corresponded to serious vasculopathy in AngioMR. This patient never present previously neurological symptoms and had several hyperhemolysis crisis and VOC as risk factors. Low percentage of pathological TCD in this study, in relation to the high number of SI and altered tests, although without correlation among the three exams, is probably attributed to factors related to the methodology, aspects of cerebral physiopathology or perhaps a sign of good prognostic if the duration of study had not been so short. TCD should be used as a screening method in the age groups with higher risk of AVC and should never be considered separately in prophylactic therapeutics indication. Psychological tests were the most sensitive method to detect neurodevelopment impairment; in 80% of patients the neuropsychologics tests were altered, but without correlation with SI (10%). Since SI can become evident during the first two years of life and develop with time, the first psychological tests should be carried out between 3 and 5 years of age to timely be referred to special education and stimulation programs. Prognostic indicators to psychological tests were also found: alpha-thalassemia was found to be a protection factor of the IQ, just as other hematologic factors (hematocrit, MGCV and erythrocytes count). In relation to clinical parameters, although without statistical significance, patients with larger number of VOC had average lower scores versus the average in tests, except in TP. Results from different studies were conclusive as to the type of lesion found and the importance of prognostic indicators. Study 3. All the patients completed a minimum of 15 months therapeutic treatment with the final average daily dose of 19±4 mg/kg/day. The average value of the fetal hemoglobin increased significantly from 7,0±3,9% to 13,7±5,3% (p=0.028). The HbF average values increased from 6% to 15% after 15 months of therapeutic treatment. Clinically there was a reduction of 80% in the number of VOE , 69% in the number of hospitalization, 76% in the number of days of hospitalization and 67% in the number of transfusions. Once again the effectiveness of this treatment in this pediatric group, as well as the lack of any significant secondary effects, was evident. The study confirms the need for further detailed research in order to safely effect the appropriate treatment prior to the development of organic lesions, which ideally should be in the first year of life. Conclusions: These results allow us to clarify the importance of either pulmonary lesions or either nervous central system impairment among patients, children and adolescents, with sickle cell anemia. These lesions were demonstrated in most of the patients studied compromising their quality of life and the mortality. The treatment with HU is proved to be effective and having low toxicity.

Analysis of the pathway of developing a national mental health plan for Suriname

ABSTRACT: The aim of this analysis was to analyze and describe the steps that have been taken in the development of the mental health policy in Suriname after the WHO AIMS. The objectives are: 1.To review the steps to be taken in developing a mental health policy and plan for a country 2.To gather information and data concerning mental health policy and plan development in Suriname 3.To draw conclusion from the experience gained that can be applied to other countries. In general, the information that was gathered from the four countries Guyana, Barbados, Trinidad & Tobago and Suriname, was compared with the WHO steps for developing a mental health policy and plan. Were these steps taken into consideration, when developing their mental health policy and plan? If not, what were the reasons why it did not happen? The checklist for evaluating a mental health plan was used in Suriname. This checklist assisted to see if the results of the recommendations given by the WHO AIMS to develop a effective and balanced mental health plan were taken into consideration. The mayor findings of the analysis are that Suriname as well as Guyana used the steps in developing their mental health policy and plan. Barbados and Trinidad & Tobago did not develop a mental health policy and plan. Suriname and Guyana have a mental health coordinating body at the Ministry of Health. Trinidad & Tobago as well as Barbados have a mental health focal person at the Ministry of Health of the respective countries. It can be concluded that successfully improving of health systems and services for mental health is combining theoretical concepts, expert knowledge and cooperation of many stakeholders. The appointment of a mental health coordinating unit at the Ministry of Health is crucial for the development of mental health in a country. Furthermore, mental health is everyone’s business and responsibility. Implementing the steps to be taken when developing a mental health policy and plan as recommended by WHO may be a slow process requiring the mobilization of political will. That’s why it is crucial that persons responsible for this process work close with all stakeholders in relevant sectors, taking their needs into consideration and try to translate that in clear objectives. It is common knowledge that improving the quality of mental health must be accompanied by the availability of financial and human resources. Finally, a mental health policy and plan should be one document tackling all aspects of mental health of a community.

New spectroscopic and electrochemical insights on a class I superoxide reductase: evidence for an intramolecular electron-transfer pathway

Biochem. J. (2011) 438,485–494 doi:10.1042/BJ20110836

O2/CO2-sensitive cyclic AMP-signalling pathway in peripheral chemoreceptors

RESUMO: O corpo carotídeo (CB) é um pequeno órgão sensível a variações na PaO2, PaCO2 e pH. As células tipo I (células glómicas) do corpo carotídeo, as unidades sensoriais deste órgão, libertam neurotransmissores em resposta às variações dos gases arteriais. Estes neurotransmissores atuam quer em recetores pré-sinápticos, localizados nas células tipo I, quer em recetores póssinápticos, localizados nas terminações do nervo do seio carotídeo, ou em ambos. A activação dos recetores pré-sinápticos modula a atividade do corpo carotídeo, enquanto que, a activação dos recetores pós-sinápticos, de carater excitatório, desencadeia um aumento da frequência de descarga das fibras do CSN, com subsequente despolarização dos neurónios do gânglio petroso, e posterior despolarização de um grupo específico de neurónios do centro respiratório central, desencadeando, como resposta final, hiperventilação. Estes recetores pré- e pós-sinápticos podem ser classificados em ionotrópicos ou metabotrópicos, estando os últimos acoplados a adenilatos ciclases transmembranares (tmAC). O mecanismo exato pelo qual as variações dos gases arteriais são detetadas pelo CB não se encontra ainda completamente elucidado, mas tem sido sugerido que alterações nos níveis de cAMP estejam associadas ao mecanismo de deteção de variações de O2 e CO2. Os níveis de cAMP podem ser regulados através da sua via de síntese, mediada por dois tipos de adenilatos ciclases: tmAC sensível aos eurotransmissores e adenilato ciclase solúvel (sAC)sensível a variações de HCO3/CO2, e pela sua via de degradação mediada por fosfodiesterases. A via de degradação do cAMP pode ser manipulada farmacologicamente, funcionando enquanto alvo terapêutico para o tratamento de patologias do foro respiratório (e.g. asma, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstructiva crónica e apneia do sono), que induzem um aumento da actividade do CB.O trabalho descrito nesta dissertação partiu da hipótese de que a actividade do CB é manipulada por fármacos, que interferem com a via de sinalização do cAMP, tendo sido nosso objectivo geral, investigar o papel do cAMP na quimiotransdução do CB de rato, e determinar se a actividade dos enzimas responsáveis pela via de sinalização do cAMP é ou não regulada por variações de O2/CO2. Assim, a relevância deste trabalho é a de estudar e identificar possíveis alvos moleculares (sAC, isoformas de tmAC e PDE) com potencial para serem usados no tratamento de patologias relacionadas com o controlo respiratório. A primeira parte do presente trabalho, centrou-se na caracterização farmacológica da PDE4 no CB e em tecidos não quimiorecetores (e.g. gânglio cervical superior e artérias carótidas), e na observação do efeito de hipóxia aguda na acumulação dos níveis de cAMP, induzidos pelos inibidores de PDE, nestes tecidos. A quantificação de cAMP foi efectuada por técnica imunoenzimática (EIA), tendo sido elaboradas curvas de dose-resposta para os efeitos de inibidores, não específicos (IBMX) e específicos para a PDE2 e PDE4 (EHNA, Rolipram e Ro 20-1724), nos níveis de cAMP acumulados, em situações de normóxia (20%O2/5%CO2) e hipóxia (5%O2/5%CO2). A caracterização das PDE no gânglio cervical superior foi aprofundada, utilizando-se a técnica de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) em culturas primárias de neurónios, na presença de inibidores não específicos (IBMX) e específicos para a PDE3 e PDE4 (milrinone e rolipram, respetivamente). Foram igualmente estudadas, através de RT-qPCR, as alterações na expressão de PDE3A-B e PDE4A-D, no gânglio cervical superior, em resposta a diferentes percentagens de oxigénio. Na segunda parte do trabalho investigou-se a via de síntese do cAMP no CB em resposta a variações na concentração de HCO3/CO2. Em concreto, o protocolo experimental centrou-se na caracterização da sAC, dado que a sua actividade é regulada por variações de HCO3/CO2. A caracterização da expressão e regulação da sAC, em resposta a variações de HCO3/CO2 ,foi efectuada no CB e em tecidos não quimioreceptores periféricos (e.g. gânglio cervical superior, petroso e nodoso) por qRT-PCR. A actividade deste enzima foi caracterizada indirectamente através da quantificação dos níveis de cAMP (quantificação por EIA), induzidos por diferentes concentrações de HCO3/CO2, na presença de MDL-12,33-A, um inibidore da tmAC. A expressão das isoformas da tmAC no CB e gânglio petroso foi determinada por RT-qPCR. Adicionalmente, estudámos a contribuição relativa da tmAC e sAC no mecanismo de sensibilidade ao CO2 no CB. Para o efeito foram estudadas as alterações: 1) nos níveis de cAMP (quantificado por EIA) na presença de diferentes concentrações de HCO3/CO2 e ao longo do tempo (5-30 min); 2) na ativação da proteína cinase A (PKA, FRET baseado em sensores) em células tipo I do CB; e 3) na frequência de descarga do CSN (registos) na presença e ausência de ativadores e inibidores da sAC,tmAC e PKA. Por último, foi caracterizada a expressão e actividade da sAC nos quimioreceptors centrais (locus ceruleus, rafe e medula ventro-lateral) através de técnicas de RT-qPCR e EIA. A expressão das isoformas da tmAC foi aprofundada no locus coeruleus através de RT-qPCR. Por fim, comparámos a contribuição da tmAC e sAC nos níveis de cAMP no locus coeruleus em condições de normocapnia e hipercapnia.O nosso trabalho teve os seguintes resultados principais: 1) PDE4 está funcional no corpo carotídeo, artérias carótidas e gânglio cervical superior de rato, embora a PDE2 só se encontre funcional neste último; 2) Os efeitos dos inibidores de PDE nos níveis de acumulação de cAMP foram exacerbados em situações de hipóxia aguda no CB e artérias carótidas, mas foram atenuados no gânglio cervical superior; 3) No gânglio cervical superior, diferentes tipos de células apresentaram uma caracterização específica de PDEs, sugerindo uma subpopulação de células neste gânglio com funções fisiológicas distintas; 4) Embora todas as isoformas de PDE4 e PDE3 estivessem presentes no gânglio, a PDE3a, PDE4b e a PDE4d foram as isoformas mais expressas. Por outro lado, incubações de gânglio cervical superior, em diferentes percentagens de oxigénio, não alteraram (não regularam) significativamente a expressão das diferentes isoformas de PDE neste órgão; 5) a sAC encontra-se expressa e funcional no CB e nos quimiorecetores centrais estudados (locus coeruleus, rafe e medula ventrolateral). A sAC apresenta maior expressão no CB comparativamente aos restantes orgãos estudados, exceptuando os testículos, orgão controlo. Variações de HCO3/CO2 de 0/0 para 24/5 aumentaram os níveis de cAMP no CB e quimiorecetores centrais, tendo sido o aumento mais significativo observado no CB. Concentrações acima dos 24mM HCO3/5%CO2 não induziram alterações nos níveis de cAMP, sugerindo que a actividade da sAC se encontra saturada em condições fisiológicas (normocapnia) e que este enzima não desempenha qualquer papel na deteção de situações de hipercapnia; 6) No CB, a expressão das isoformas tmAC1, tmAC4, tmAC6 e tmAC9 é mais elevada comparativamente à expressão da sAC; 7) Utilizamos diferentes inibidores da tmAC (MDL 12-330A, 500μM, 2’5’-ddADO, 30-300μM, SQ 22536, 200μM) e da sAC (KH7, 10-100μM) para estudar a contribuição relativa destes enzimas na acumulação do cAMP no CB. Tanto a tmAC como a sAC contribuem para a acumulação dos níveis de cAMP em condições de hipercapnia. Contudo, existe um maior efeito destes inibidores nas condições de 12 mM HCO3/2.5%CO2 do que em condições de normocapnia e hipercapnia, sugerindo um papel relevante destes enzimas na atividade do CB em situações de hipocapnia; 8) Não se observaram variações nos níveis de cAMP em resposta a diferentes concentrações de HCO3/CO2 ao longo do tempo (5-30 min). O efeito inibitório induzido por ddADO e KH7 foi sobreponível após 5 ou 30 minutos de incubação em todas as concentrações de HCO3/CO2 estudadas; 9) Por último, verificou-se um aumento na frequência da descarga do nervo do seio carotídeo entre as condições de normocapnia e hipercapnia acídica. Ao contrário do KH7 (10μM), o 2’5’-ddADO reduziu significativamente a frequência de descarga do nervo, quer em condições de normocapnia quer de hipercapnia acídica. Contudo, não se verificou aumento na frequência de descarga do nervo entre normocapnia e hipercapnia isohídrica, sugerindo que a sensibilidade à hipercapnia no CB é mediada por variações de pH. Em conclusão, os resultados decorrentes deste trabalho permitiram demonstrar que, embora os enzimas que medeiam a via de sinalização do cAMP possam ser bons alvos terapêuticos em condições particulares, a sua actividade não é específica para o CB. Os resultados sugerem ainda que o cAMP não é um mediador específico da transdução à hipercapnia neste orgão. Contudo, os nossos resultados demonstraram que os níveis de cAMP são mais elevados em condições fisiológicas, o que sugere que o cAMP possa ter uma função homeostática neste orgão. Por último, o presente trabalho demonstrou que os aumentos de cAMP descritos por outros em condições de hipercapnia, não são observáveis quando o pH se encontra controlado. ------------------ ABSTRACT: The work presented in this dissertation was aimed to establish how specific is cAMP-signaling pathways in the CB mainly in different CO2 conditions and how O2 concentrations alter/drives the manipulation of cAMP signaling in the CB. The experimental studies included in this thesis sought to investigate the role of cAMP in the rat CB chemotransduction mechanisms and to determine whether the enzymes that participate in cAMP signal transduction in the CB are regulated by O2/CO2. We characterized the enzymes involved in the cAMP-signaling pathway in the CB (sAC, tmAC, PDE) under different O2/CO2 conditions. Our results demonstrated that many of these enzymes are involved in CO2/O2 sensing and while they may be useful in treating conditions with alterations in CO2/O2 sensing,they will not be specific to chemoreception within the CB: 1) PDE4 is ubiquitously expressed in CB and non-chemoreceptor related tissues and their affinity to inhibitors change with O2 tensions in both CB and carotid arteries, and 2) sAC and tmAC are expressed in peripheral and central chemo- and non-chemoreceptor tissues and their effect on cAMP levels do not change between normocapnic and isohydric hypercapnic conditions. Our results provide evidence against a specific role of cAMP as a mediator for O2 and CO2 chemotransduction in the rat CB and emphasized the role of pH in CO2 sensitivity of the CB. Furthermore, our results demonstrate that cAMP levels are maintained higher under physiological conditions, supporting recent finding from our lab, which all together suggests that cAMP has a homeostatic function in this organ.

A systems biology framework for pathway level culture media engineering: pplication to Pichia pastoris cultures

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Química e Bioquímica

Estudo da Prevalência da Malária na Mulher Grávida Submetida ao Tratamento Intermitente e Preventivo com Sulfadoxina e Pirimetamina e sua Associação com Anemia

A malária é causada por parasitas de género Plasmodium e transmitida por mosquitos fêmea do género Anopheles. A doença é endémica em regiões tropicais e intertropicais e constituí uma das maiores causas de morbilidade e mortalidade principalmente no continente Africano. Segundo os dados da OMS ocorrem anualmente 300 a 500 milhões de casos clínicos e um milhão de mortes. Durante a gravidez, a malária é frequente e mais grave, com maior incidência nos países da África subsaariana. As mulheres grávidas têm maior risco de contrair a doença e muitas vezes em formas mais graves com associação à anemia. O objectivo deste estudo foi caracterizar a ocorrência dos casos de malária em mulheres grávidas submetidas ao tratamento intermitente preventivo (TIP) com a Sulfadoxina/ Pirimetamina (SP) nas Províncias de Benguela e Huíla. Neste estudo constatamos que todas as grávidas que participaram tinham tido episódios de malária antes da gravidez quer na província de Benguela tal como na província da Huíla. No total, 633 mulheres grávidas foram analisadas e apresentavam um valor de hemoglobina abaixo dos 14g/dl. A prevalência de malária em grávidas sujeitas a TIP foi significativamente menor (p< 0.01) do que nas grávidas que não a fizeram, respectivamente 4,5% e 10,0%, conforme esperado e descrito anteriormente por outros autores. Todos os casos de malária detectados corresponderam a Plasmodium falciparum, não se tendo verificado nenhuma infecção mista, de acordo com os métodos utilizados. O valor médio da hemoglobina nas grávidas foi inferior ao esperado em grávidas seguidas em consulta pré-natal, e existe uma diferença significativa entre os valores encontrados na Província de Benguela e da Huíla (significativamente mais elevados nesta última). O teste rápido Paracheck-pf detectou a presença de Plasmodium falciparum em maior número do que a microscopia óptica. Por constrangimentos logísticos, o número de amostras submetidas a teste molecular (PCR) não foi suficiente para se tirarem conclusões.

Prevalência de parasitas intestinais em crianças a frequentar a escola primária no Bairro Lucrécia, no Lubango, Angola, e sua relação com o estado nutricional e anemia

Introdução: Os parasitas intestinais são responsáveis por morbilidade em crianças de todo mundo, em especial nos países de baixa renda. Os estudos têm vindo a demonstrar o seu impacto negativo no estado nutricional e o seu contributo na etiologia da anemia. Pretendeu-se determinar a prevalência de parasitas intestinais em crianças dos 5 aos 12 anos de idade, a frequentar a escola primária no Bairro Lucrécia, no Lubango, Angola, e explorar a sua relação com o estado nutricional e anemia. Material e Métodos: Foi efectuado um estudo observacional, transversal e analítico, cuja colheita de dados se realizou entre Setembro e Outubro de 2010. A amostra foi constituída por 328 crianças. Realizou-se a detecção microscópica de parasitas intestinais e identificação molecular dos parasitas Entamoeba histolytica e Entamoeba dispar. O estado nutricional foi avaliado através dos z-scores do peso para a idade, da estatura para a idade e do IMC para a idade. A concentração de hemoglobina foi determinada através de um hemoglobinómetro portátil. Resultados: A prevalência de parasitas intestinais patogénicos foi de 44,2%, destacando-se Ascaris lumbricoides com 22,0%, Giardia lamblia com 20,1% e Hymenolepis nana com 8,8%. Na microscopia foi encontrada uma prevalência de Entamoeba histolytica/dispar de 13,7%, tendo sido posteriormente identificada, por diagnóstico molecular, uma prevalência de 13,1% para E. dispar e 0,3% para E. histolytica. A prevalência de baixo peso, subnutrição crónica e subnutrição aguda foi de, respectivamente, 36,1%, 41,5% e 30,2%. A probabilidade das crianças terem subnutrição crónica ou subnutrição aguda aumentou com o facto de terem 10 anos ou mais. As crianças co-infectadas por protozoários e helmintas apresentaram uma maior probabilidade de terem subnutrição crónica. A prevalência de anemia foi de 21,6%, encontrando-se a mesma significativamente associada à infecção por H. nana. A probabilidade das crianças estarem anémicas aumentou com o facto de terem menos de 10 anos. Adicionalmente nas crianças desparasitadas com albendazol ou mebendazol há 2 meses e meio ou menos verificou-se uma maior prevalência de infecção por G. lamblia (28,6%) em comparação com as desparasitadas há mais de 2 meses e meio (13,7%), tendo sido essa diferença estatisticamente significativa. Discussão e Conclusões: Emergiu deste estudo a importância da co-infecção com helmintas e protozoários no aumento da probabilidade das crianças terem subnutrição crónica e foi encontrada uma associação estatisticamente significativa entre a infecção por H. nana e a anemia. Será importante desenhar futuros estudos que investiguem o poder patogénico do H. nana e o modo como é efectuada a desparasitação com albendazol ou mebendazol, pois ao ser eficaz contra a infecção por A. lumbricoides, poderá aumentar a susceptibilidade à infecção por G. lamblia.

Gold nanoprobes for assessing expression of critical genes in the infection pathway of MRSA

Staphylococcus aureus is an important opportunistic pathogen that can cause a wide variety of diseases from mild to life-threatening conditions. S. aureus can colonize many parts of the human body but the anterior nares are the primary ecological niche. Its clinical importance is due to its ability to resist almost all classes of antibiotics available together with its large number of virulence factores. MRSA (Methicillin-Resistant S. aureus) strains are particularly important in the hospital settings, being the major cause of nosocomial infections worldwide. MRSA resistance to β-lactam antibiotics involves the acquisition of the exogenous mecA gene, part of the SCCmec cassette. Fast and reliable diagnostic techniques are needed to reduce the mortality and morbidity associated with MRSA infections, through the early identification of MRSA strains. The current identification techniques are time-consuming as they usually involves culturing steps, taking up to five days to determine the antibiotic resistance profile. Several amplification-based techniques have been developed to accelerate the diagnosis. The aim of this project was to develop an even faster methodology that bypasses the DNA amplification step. Gold-nanoprobes were developed and used to detect the presence of mecA gene in S. aureus genome, associated with resistance traits, for colorimetric assays based on non-crosslinking method. Our results showed that the mecA and mecA_V2 gold-nanoprobes were sensitive enough to discriminate the presence of mecA gene in PCR products and genomic DNA (gDNA) samples for target concentrations of 10 ng/μL and 20 ng/μL, respectively. As our main objective was to avoid the amplification step, we concluded that the best strategy for the early identification of MRSA infection relies on colorimetric assays based on non-crosslinking method with gDNA samples that can be extracted directly from blood samples.