10 resultados para Adenomatous Polyposis Coli
Resumo:
Dissertation presented to obtain a Ph.D. degree in Biology, speciality Microbiology, by Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Cincias e Tecnologia
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A resistncia aos antibiticos em bactrias Gram-negativas pode ser aumentada pela extruso de antibiticos atravs de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energtica a fora proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergtica na actividade de efluxo de E. coli usando trs estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um mtodo fluorimtrico semi-automtico no qual a fluorescncia do fluorocromo brometo de etdeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medio em tempo real da actividade de efluxo e acumulao de fluorocromo (inibio do efluxo). A utilizao de brometo de etdeo particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescncia no exterior da clula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este mtodo uma nova aplicao do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o clculo da cintica de transporte reflectindo o balano entre acumulao de substrato por difuso passiva atravs da membrana e a sua extruso/efluxo, proporcionando uma deteco rpida e econmica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulao e o efluxo do brometo de etdeo. De todos os inibidores de vias biossintticas testados, o ortovanadato de sdio, foi o que demonstrou maior actividade inibitria, a qual revertida na presena de GLU. Em concluso, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende no s da fosforilao oxidativa por via da fora proto-motriz mas tambm da energia proveniente da hidrlise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sdio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterizao bioenergtica da actividade de bombas de efluxo e permite a seleco de novos inibidores de bombas de efluxo em bactrias.
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PLOS ONE, 4(8):ARTe6820
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Dissertao apresentada na Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obteno do grau de Mestre em Biotecnologia
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Dissertation presented to obtain a Master degree in Biotechnology
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Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Biomdica
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RESUMO: O Cell Fusing Agent Vrus (CFAV), considerado como o primeiro flavivrus especficos de insectos (ISF), parece estar exclusivamente adaptado aos seus hospedeiros, no replicando em clulas de vertebrados. Apesar de ter sido identificado h mais de trs dcadas (1975), a verdade que muito pouco se conhece sobre a sua biologia. Dado o seu parentesco filogentico com alguns outros flavivrus encontrados naturalmente em mosquitos de diferentes gneros colhidos em diferentes regies do globo, este vrus poder ser usado como modelo para o estudo de ISF. No entanto, necessitam do desenvolvimento de ferramentas bsicas, tais como clones moleculares ou baterias de soros contendo anticorpos que reconheam uma ou mais protenas codificadas pelo genoma viral, produzidas, por exemplo, a partir de antignios virais produzidos de forma recombinante. Com este trabalho pretendeu-se a optimizao de protocolos que permitiram a expresso e purificao parcial de quatro protenas [duas protenas estruturais (C e E) e duas no estruturais (NS3hel e NS5B)] do CFAV em E. coli, todas elas produzidas como protenas de fuso com caudas (tags) de hexahistidina nos seus extremos carboxilo. Para a expanso do CFAV foram utilizadas clulas Aedes albopictus (C6/36). Aps a realizao da extraco do RNA viral e a obteno de cDNA, procedeu-se amplificao, por RT-PCR, das regies codificantes das protenas C, E, NS3hel e NS5B, utilizando primers especficos. Os quatro fragmentos de DNA foram independentemente inseridos no vector pJTE1.2/blunt usando E. coli NovaBlue como hospedeira de clonagem e, posteriormente, inseridos em vectores de expresso pET-28b e pET-29b usando E. coli BL21(DE3)pLysS e Rosetta(DE3)pLysS como hospedeiras de expresso. Aps da induo, expresso e purificao das protenas recombinantes C, E, NS3hel e NS5B, foi confirmada a autenticidade destas protenas produzidas atravs do mtodo Western Blot com um anticorpo anti-histidina. --------- ABSTRACT: The Cell Fusing Agent virus (CFAV) considered as the first "insect- specific flavivirus" (ISF) and seems to be uniquely adapted to their hosts, not replicating in vertebrate cells. Although it has been known for more than three decades (1975), the truth is very little is known about its biology. Given its close phylogenetic relationship with other flavivirus naturally circulating in various genera of mosquitoes collected from different regions of the globe, this virus could be used as a model for the study of ISF. However, such studies require the development of experimental basic tools, such as molecular clones or serum batteries containing antibodies that recognize one or more proteins encoded by the viral genome, produced, for example, from viral antigens recombinant produced. In this work, we carried out the optimization of protocols that allowed the expression and partial purification of four proteins [two structural proteins (C and E) and two nonstructural proteins (NS3hel and NS5B)] CFAV in E. coli as fusion protein for c-terminal hexahistidine tags. For the expansion of the CFAV we used Aedes albopictus (C6/36) cells. After completion of the viral RNA extraction and cDNA obtained, amplification of the coding regions of the C, E, NS5B and NS3hel proteins was carried out by RT-PCR using specific primers. The four DNA fragments were independently inserted into the vector pJTE1.2/blunt using E. coli NovaBlue as cloning host and then inserted into expression vectors pET-28b and pET-29b using E. coli BL21(DE3)pLysS and Rosetta(DE3)pLysS as expression host. After induction, expression and purification of recombinant C, E, NS3hel and NS5B proteins Western Blot analyses with an anti-histidine antibody confirmed the authenticity of these proteins produced.
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A resistncia aos antibiticos em bactrias Gram-negativas pode ser aumentada pela extruso de antibiticos atravs de sistemas de efluxo. Em Escherichia coli, o principal sistema de efluxo o AcrAB-TolC o qual tem como principal fonte energtica a fora proto-motriz. Este trabalho pretendeu estudar alguns aspectos essenciais da bioenergtica na actividade de efluxo de E. coli usando trs estirpes bem caracterizadas genotipica e fenotipicamente. Foi utilizado um mtodo fluorimtrico semi-automtico no qual a fluorescncia do fluorocromo brometo de etdeo, substrato de bombas de efluxo foi seguida, permitindo a medio em tempo real da actividade de efluxo e acumulao de fluorocromo (inibio do efluxo). A utilizao de brometo de etdeo particularmente vantajosa pois emite baixa fluorescncia no exterior da clula bacteriana tornando-se extremamente fluorescente no seu interior. Este mtodo uma nova aplicao do termociclador em tempo real RotorGeneTM 3000 que permite o clculo da cintica de transporte reflectindo o balano entre acumulao de substrato por difuso passiva atravs da membrana e a sua extruso/efluxo, proporcionando uma deteco rpida e econmica de inibidores de efluxo. Os resultados obtidos mostram, para todas as estirpes, que a GLU e o pH afectam a acumulao e o efluxo do brometo de etdeo. De todos os inibidores de vias biossintticas testados, o ortovanadato de sdio, foi o que demonstrou maior actividade inibitria, a qual revertida na presena de GLU. Em concluso, este estudo mostra que a actividade de efluxo de E. coli depende no s da fosforilao oxidativa por via da fora proto-motriz mas tambm da energia proveniente da hidrlise de ATP pelas ATPases. O ortovanadato de sdio tem potencial para ser um novo inibidor de bombas de efluxo de largo espectro. A tecnologia utilizada neste trabalho demonstrou ser apropriada para a caracterizao bioenergtica da actividade de bombas de efluxo e permite a seleco de novos inibidores de bombas de efluxo em bactrias.
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Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biochemistry.
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As bactrias desenvolveram ao longo do tempo, mecanismos que lhes permitem superar os efeitos nocivos causados por uma grande variedade de compostos antimicrobianos. Os sistemas de efluxo e a permeabilidade reduzida da parede celular so dois desses mecanismos. Para se estudar a resistncia aos antibiticos mediada por efluxo em Escherichia coli, a influncia dos inibidores de efluxo na resistncia, os mecanismos de aco desses inibidores, a sua relao com a bioenergtica e a competio entre substratos de efluxo, usaram-se duas estirpes de E. coli: a estirpe AG100, com o sistema de efluxo AcrAB-TolC funcional, e a estirpe AG100A, com o sistema AcrAB-TolC inactivo. Os inibidores testados foram a cloropromazina, tioridazina, ortovanadato sdio, arilpiperazina, carbonil cianeto m-clorofenilhidrazona e o verapamil. Estes compostos foram avaliados i) quanto sua capacidade para inibir o sistema de efluxo AcrAB-TolC, atravs de um mtodo fluoromtrico semi-automtico; ii) quanto capacidade para diminurem a susceptibilidade de E. coli aos antimicrobianos, atravs da determinao de concentraes mnimas inibitrias na presena e ausncia de inibidores de efluxo; iii) quanto ao seu efeito ao nvel da membrana celular, nomeadamente, disrupo do potencial de membrana, por microscopia de fluorescncia. Para alm disso, estes inibidores foram usados em ensaios de competio entre o brometo de etdio e os antibiticos tetraciclina, ofloxacina e oxacilina. Os resultados demonstraram que todos os compostos estudados foram capazes de diminuir a actividade de efluxo. Os compostos que apresentaram um efeito mais relevante foram a cloropromazina e o ortovanadato sdio. Contrariamente, as arilpiperazinas demonstraram um maior efeito na reduo dos valores das concentraes mnimas inibitrias dos antibiticos testados realando o facto de que o efeito destes compostos tidos como inibidores nem sempre corresponde inibio real de efluxo. Para alm disso, foi possvel dividir os inibidores em dois grupos: (i) dependentes da aco da glucose NMP e VP, e (ii) independentes da aco da glucose CCCP, CPZ, Na3VO4. Os resultados de microscopia de fluorescncia demonstraram que todos os compostos testados possuem um efeito imediato ao nvel da produo de energia celular, afectando o potencial de membrana. Por ltimo, os ensaios de competio entre substratos demonstraram a existncia de um efeito sinrgico, nomeadamente com tetraciclina e ofloxacina, uma vez que permitiram a reteno de mais brometo de etdeo no interior das clulas. Os resultados obtidos evidenciam a relao entre a resistncia aos antibiticos por efluxo activo em E. coli, em particular pelo sistema AcrAB-TolC, e a sua dependncia de energia fornecida pela hidrlise de ATP. Deste modo, podemos concluir que os inibidores de efluxo podem ser potenciais alvos para o desenvolvimento de novas terapias no combate resistncia em E. coli.
