Extension and patterning of the vertebrate body

Dissertation presented to obrain the Ph.D degree in Biology. Developmental Biology

Caracterização de múltiplos polimorfismos de Pneumocystis Jirovecii por multiplex-PCR/Single base extension

Pneumocystis jirovecii é conhecido por causar infecções específicas no aparelho respiratório de seus hospedeiros, principalmente em doentes imunocomprometidos, manifestando-se por uma pneumonia grave e por vezes fatal, normalmente designada por pneumonia por Pneumocystis. A caracterização da diversidade genética de P. jirovecii tem demonstrado que determinados polimorfismos de base única poderão ser reconhecidos como marcadores moleculares de eleição para o estudo da distribuição geográfica, vias de transmissão, resistência/susceptibilidade a fármacos, factores de virulência e genética populacional de subtipos genéticos. Este estudo teve como objectivo a caracterização de polimorfismos de P. jirovecii, através da metodologia PCR multiplex/Extensão de base única (do inglês single base extension), com a principal finalidade de constatar eventuais associações entre polimorfismos de base única, genótipos multilocus, e dados clínicos e demográficos da infecção. Sessenta e seis espécimes pulmonares, previamente considerados positivos para P. jirovecii, obtidos entre 2001 e 2012, a partir de doentes portugueses imunocomprometidos, foram seleccionados de forma aleatória para este estudo multilocus. PCR multiplex foi utilizada para a amplificação simultânea de três regiões genómicas: subunidade grande do rRNA mitocondrial, superóxido dismutase e dihidropteroato sintetase. Cinco polimorfismos de base única, previamente correlacionados com parâmetros da doença, foram genotipados por extensão de base única: mt85, SOD110, SOD215, DHPS165 e DHPS171. Um total de 330 polimorfismos de base única e 29 genótipos multilocus putativos de P. jirovecii foram identificados e caracterizados nos espécimes pulmonares analisados. Os padrões de distribuição dos polimorfismos foram analisados, sendo considerada a variação temporal e/ou geográfica das suas formas alélicas. Constatou-se grande diversidade genotípica entre os isolados de P. jirovecii que poderá ter influência a nível epidemiológico. Foram observadas associações estatísticas entre mt85/genótipos multilocus e parâmetros demográficos e clínicos. A correlação mais importante verificou-se entre mt85C e cargas parasitárias baixas a moderadas, enquanto mt85T foi associado com cargas parasitárias altas; MLG5, MLG9 e MLG13 foram associados com cargas parasitárias baixas, moderadas e altas, respectivamente. Tais associações demonstram que potenciais marcadores moleculares da infecção por P. jirovecii poderão existir e que polimorfismos/genótipos específicos poderão determinar perfis epidemiológicos da pneumonia por Pneumocystis. A análise genética cruzada permitiu verificar associações entre polimorfismos de base única. Os polimorfismos SOD110T e SOD215C, SOD110C e SOD215T, DHPS165A e DHPS171C, DHPS165G e DHPS171T foram associados estatisticamente. Os genótipos multilocus mais prevalentes foram considerados para o teste recombinatório d1. Dois genótipos multilocus (MLG7 e MLG9) foram observados com elevada frequência, e a análise genética indicou que estes se encontravam sobre-representados na população de P. jirovecii estudada. Estas evidências indicam que o fenómeno de desequilíbrio de ligação e a propagação clonal de subtipos genéticos é frequente, considerando que a espécie P. jirovecii poderá ser representada por uma população com estrutura epidémica. O presente trabalho confirmou a importância do estudo de polimorfismos em P. jirovecii, sugerindo que a caracterização multilocus poderá fornecer informação relevante para a compreensão dos padrões, causas e controlo da infecção, melhorando assim a investigação deste importante patogéneo.