Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucarióticas evoluíram um sistema de sinalização complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalização são essenciais para a sobrevivência da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdução de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a proteína Smoothened (Smo) na ausência dos seus ligandos, as proteínas Sonic hedgehog (Shh). Estas proteínas são reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionário, como ilustrado pelas malformações drásticas observadas em embriões humanos e de murganho com perturbações da transdução de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformações ósseas. Igualmente importantes são as consequências da ativação inapropriada da via de sinalização Hh na formação de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos cílios primários. Além disso, demonstrou-se que esta localização é crucial para a sinalização através da via Hh. Na presença dos ligandos, Ptch1 é internalizado e destinado a degradação ou sequestrado num compartimento da célula de onde não pode desempenhar o seu papel inibitório. A proteína Arl13b é uma pequena GTPase pertencente à família Arf/Arl da superfamília Ras de pequenas GTPases e foi implicada no síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congénita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congénita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestação (E13,5) e exibem anomalias morfológicas nos cílios que levam à interrupção da sinalização Hh. Além disso, a Arl13b está diretamente envolvida na regulação da via Hh, controlando a localização de vários componentes desta via nos cílios primários. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que são estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalização de recetores, e que regula a sua formação. Além disso, aprofundámos o conhecimento do processo de ativação da via de sinalização Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos após ativação da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir daí, sugerindo uma indução contínua da reorganização do citoesqueleto de actina quando a via está ativada. Observámos ainda que a inibição da formação de CDRs através do silenciamento de WAVE1, uma proteína necessária para a formação destas estruturas, resulta na diminuição da ativação da via de sinalização Hh. Além disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, através do silenciamento de uma proteína necessária para a cisão de macropinossomas, nomeadamente a proteína BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose são necessárias para a ativação da via de sinalização Hh e indicam que esta via de internalização controla os níveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do cílio primário para a transdução de várias vias de sinalização. A via Hh induz a diferenciação do músculo cardíaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalização Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alteração do looping do coração, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigámos o papel da Arl13b no desenvolvimento do coração. Mostramos que a Arl13b é altamente expressa no coração de embriões de murganho e de murganhos adultos ao nível do mRNA e da proteína. Além disso, o perfil de distribuição da Arl13b no coração segue o dos cílios primários, que são essenciais para o desenvolvimento cardíaco. Corações de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal átrio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do índice mitótico no ventrículo esquerdo. Além disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento é observado em corações de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b é necessária para o desenvolvimento embrionário do coração e que defeitos cardíacos podem contribuir para a letalidade embrionária de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulação dos níveis de superfície do recetor Ptch1, que envolve a remodelação do citoesqueleto de actina e a formação de CDRs após a ativação da via de sinalização Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repressão excessiva da via através da remoção de Ptch1 da superfície da célula. Além disso, determinou-se que uma mutação de perda de função na Arl13b causa defeitos cardíacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associação dos defeitos em cílios primários e na sinalização Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalização Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalização, uma vez que a sua regulação é crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tráfego através de macropinocitose e CDRs que controla a ativação e repressão da via de sinalização Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir à identificação de novos alvos e estratégias terapêuticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

The role of arl13b in cilia length regulation and in zebrafish development

RESUMO: Arl13b é uma importante proteína ciliar, presente em cílios primários e cílios móveis. Ratinhos mutantes para Arl13b têm comprimento dos cílios reduzido e defeitos nos B-túbulos dos cílios. Como consequência destes fenótipos, deficiências na Arl13b originam, em modelos animais, várias doenças congénitas, incluindo problemas no estabelecimento do eixo esquerda-direita, malformações cerebrais e deformações corporais. Nos seres humanos, deficiências na Arl13b levam a uma doença crónica congénita chamada Síndrome de Joubert. Por outro lado, a sobreexpressão de Arl13b origina cílios mais longos, no entanto existe uma ausência da caracterização dos fenótipos celulares e durante o desenvolvimento embrionário. Neste trabalho, quisemos explorar o efeito da sobre-expressão de Arl13b em embriões de peixezebra. Descobrimos que, ao nível ciliar, a sobre-expressão de Arl13b nas células aumenta o comprimento ciliar em cílios primários e móveis, no entanto, a esses cílios falta adequada acetilação da alfa-tubulina no citoesqueleto feito por microtúbulos. Os nossos resultados mostraram que esse efeito é específico de Arl13b sobre-expressão e quando se manipularam as enzimas responsáveis pela acetilação (Mec17) e pela de-acetilação (HDAC6) encontrámos uma sinergia potencial com ambas. Testámos ainda, que o aumento no comprimento ciliar não estava causalmente relacionado com a falta de acetilação, ou seja, os cílios com menos acetilação não eram necessariamente os mais longos. Também mostrámos que a sobre-expressão de Arl13b é capaz de restaurar o comprimento dos cílios em mutantes com cílios curtos e como isso pode ser explorado para um futuro potencial papel terapêutico para Arl13b. Em seguida, foi avaliado o impacto do aumento da quantidade de Arl13b no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Observou-se que a sobre-expressão de Arl13b apresentava fenótipos muito fracos, quando comparados com a perda de função dos mutantes de Arl13b. Focados no inesperado fenótipo leve no estabelecimento do eixo esquerda-direita abordámos a questão através do estabelecimento de uma colaboração com matemáticos, descobrimos que os cílios mais longos que potencialmente têm a capacidade de movimentar mais fluido são atenuados por amplitudes de batimento menores, e, como resultado, estes longos cílios não prejudicam o movimento do fluido e consequentemente não afetam o estabelecimento dos padrões de esquerda-direita. Sugerimos assim que a Arl13b é um regulador chave, do comprimento ciliar. Descobrimos uma nova interação com as enzimas de acetilação/de-acetilação e levantamos novas hipóteses quanto aos mecanismos moleculares da função da Arl13b. Propomos um novo modelo para o mecanismo molecular da Arl13b na regulação do comprimento dos cílios onde podemos integrar os nossos resultados com os relatados na literatura. Este trabalho adiciona mais conhecimento para o mecanismo de ação da Arl13b e, portanto, fornece uma importante contribuição para o campo da investigação em cílios.---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ABSTRACT: Arl13b is an important ciliary protein, present in primary and motile cilia. arl13b-/- mouse mutants have reduced cilia length and cilia B-tubule defects. As a consequence of these phenotypes, Arl13b loss of function animal models suffer from several congenital disorders including left-right problems, brain malformations and body deformations. In humans Arl13b depletion leads to a congenital chronic disease called Joubert Syndrome. On the other hand, overexpressing Arl13b leads to longer cilia but the characterization of the cellular and developmental phenotypes was missing. In this work we explore the effect of Arl13b overexpression in zebrafish embryos. We found that, at the ciliary level, Arl13b overexpression from 1 cell stage produces longer primary and motile cilia, but these cilia lack proper alpha tubulin acetylation of their microtubule cytoskeleton. Our results showed that this effect is specific from Arl13b overexpression and when we manipulated the enzymes responsible for acetylation, Mec17, and de-acetylation, HDAC6, we found a potential synergy of both mec17 knockdown and HDAC6 activity with Arl13b overexpression. We tested that the ciliary increase in length was not causally related to the lack of acetylation, meaning the more de-acetylated cilia were not necessarily the longer ones. We also showed that Arl13b overexpression is able to restore cilia length in short cilia mutants and how that may be explored to a potential future therapeutic role for Arl13b. Next, we evaluated the impact of increasing the amount of Arl13b in zebrafish embryonic development. We observed that Arl13b overexpression presented very mild phenotypes when compared to the loss of function mutants. We focused on the unexpected left-right mild phenotype and by establishing a mathematical modeling collaboration, we found out that the longer cilia generated force was attenuated by smaller beating amplitudes, and as a result, these long cilia were not impairing the cilia generated flow and the establishment of left-right patterning. We suggest that Arl13b is one key cilia length regulator. We disclosed a novel interaction with the acetylation / de-acetylation enzymes and raised new hypothesis as to the mechanisms of Arl13b function. We propose a new model for the Arl13b molecular mechanism of cilia length regulation where we integrate our findings with those reported in the literature. This work adds more knowledge to the Arl13b mechanism of action and therefore provides an important contribution to the cilia research field.

O acompanhamento local como modelo de desenvolvimento curricular em matemática

Dissertação de mestrado em Ciências da Educação: área de Educação e Desenvolvimento

Desenvolvimento da saúde ocupacional em Portugal e a prática profissional dos médicos do traba

A importância e a magnitude da saúde da população trabalhadora advém, em primeiro lugar, da justa consideração de que se trata do elemento mais dinâmico e numeroso da sociedade, do factor essencial da produção de bens e serviços e do garante da produtividade económica (Lefranc, 1988). O desenvolvimento sustentado das sociedades modernas conta com os trabalhadores como o meio de trabalho vivo mais valioso, pelo que a valorização da sua saúde está com ele directamente correlacionado (Duclos,1984; Dias, 1993). O conhecimento das relações trabalho e saúde foi e continuará a ser condição necessária, mas não suficiente, para a organização de intervenções promotoras da saúde e do bemestar no local de trabalho e de medidas profilácticas das doenças e lesões relacionadas com o trabalho e com as condições em que este é efectuado (OMS, 1981). É preciso que a sociedade e as suas estruturas políticas e económicas assumam a Saúde Ocupacional (SO) como objectivo prioritário e criem as condições legais, técnico-profissionais e materiais para a levar à prática (Portugal, 1991a e 2001). O actual estádio da organização e da prestação de cuidados de Saúde Ocupacional em Portugal é fruto de um processo complexo onde intervêm factores de natureza política, social, económica e técnico-científica. Estes, interactuando entre si, criaram as condições objectivas e subjectivas para o lançamento, na década de sessenta, de um modelo legal de serviços de Medicina do Trabalho o qual influenciou o desenvolvimento da saúde dos trabalhadores e a prática profissional dos médicos do trabalho (Faria et al., 1985 ). A Medicina do Trabalho como especialidade médica apresenta a característica ímpar de, ao contrário de outras especialidades, ter sido precedida pela lei, regulamento ou norma (Larche-Mochel, 1996). A sua prática, também muitas vezes entendida como de Saúde Ocupacional, integra-se desde o início na lógica do sistema legal criado em Portugal na década de sessenta que privilegia os cuidados médicos (Faria et al., 1985). Na evolução interactiva da saúde no mundo do trabalho, as condições objectivas de natureza estrutural, próprias do crescimento económico de cada país ou região, assumem um papel essencial. No entanto, como a outros níveis sociais, os factores subjectivos ligados aos conhecimentos, experiências e organização dos parceiros sociais e do poder político influenciam a estrutura formal da organização da Saúde Ocupacional (Duclos, 1984; Dias, 1993). O que ressalta da realidade portuguesa é que o inadequado e incongruente modelo político organizacional de prestação de cuidados de medicina do trabalho dos anos sessenta (Faria et al., 1985), foi substituído pela nova legislação de 1994 e 1995, (Decreto Lei 26/94 e Lei 7/95) que dá suporte a uma nova estrutura formal de serviços de Segurança, Higiene e Saúde no Trabalho (SHST) que está longe de corresponder à realidade da evolução das forças produtivas, da sua organização e das necessidades de saúde e bem-estar dos trabalhadores (Santos, 1998; Graça, 1999). A reformulação da política de Saúde Ocupacional, com a correspondente reorganização de serviços de saúde dirigidos à população trabalhadora, tem sido defendida por alguns autores e entidades desde o início da década de oitenta (Faria et al., 1985; BIT, 1985; Santos; Faria, 1988; Graça, 1999). Recentemente tal necessidade tornou-se uma evidência constatada por todos os parceiros sociais e pelo poder político, o que levou ao desencadear do processo de mudança em curso, que conta como primeiro facto, a aprovação do “Acordo de Segurança, Higiene e Saúde no Trabalho”, pelo Conselho Permanente de Consertação Social, em Julho de 1991, renovado pelo “Acordo sobre Condições de Trabalho, Higiene e Segurança no Trabalho e Combate à Sinistralidade” do Conselho Económico e Social de Fevereiro de 2001 (Portugal, 1991a e 2001). De tempos a tempos, a falta de médicos do trabalho em termos absolutos é referenciada na comunicação social por responsáveis políticos ou profissionais de saúde ocupacional sem, no entanto, ser conhecida qualquer análise suficientemente rigorosa da prática profissional dos actuais médicos do trabalho diplomados ou legalmente habilitados. Os médicos do trabalho não são os únicos profissionais de saúde ocupacional, e o seu contributo, apesar de importante, não é determinante no desenvolvimento histórico da organização dos cuidados de saúde à população trabalhadora. Reconhece-se que os parceiros sociais e o poder político são os intervenientes principais da evolução das políticas de saúde ocupacional (Graça, 1993a; Dias, 1993). No entanto, os médicos do trabalho são necessários e mesmo fundamentais para pôr em prática as políticas (implícitas e explícitas) de saúde ocupacional. O papel dos médicos do trabalho é tão primordial que, não raras vezes, estes assumem um tal protagonismo que é susceptível de ser considerado como uma prática profissional mais dirigida aos seus próprios interesses, do que virada para as necessidades de saúde dos trabalhadores (Walters, 1984). O papel dos médicos e a prática de medicina do trabalho são elementos relevantes no processo de desenvolvimento histórico da saúde dos trabalhadores, de tal modo que a adopção de um determinado modelo de serviços de SHST sendo, num dado momento, a resultante da interacção dos diversos factores em presença, torna-se por sua vez um elemento condicionante do pensamento e da prática profissional dos diversos técnicos de saúde ocupacional, entre os quais figuram os médicos do trabalho (BIT, 1985; WHO, 1986 e 1995; Directiva CEE n.º 391/1989; Rantanen, 1990). Um primeiro inquérito aos diplomados com o curso de medicina do trabalho (cerca de 500) realizado pela Cadeira de Saúde Ocupacional da ENSP, em 1982, mostrou que cerca de um terço (34,6%) não exercia qualquer actividade profissional relacionada com a saúde ocupacional e os que a praticavam faziam-no essencialmente como actividade secundária (74,4%), em regime de pluriemprego, de tempo parcial (horário semanal igual ou inferior a 20 horas em 73,4% dos casos e inferior a 10 horas em 24,1%) e em empresas industriais de grande dimensão (66,9%), em unidades de 500 ou mais trabalhadores (Faria et al., 1985). Em 1993, altura em que se inicia o presente estudo, é efectuado um novo inquérito aos antigos alunos que representam o núcleo mais numeroso de médicos com actividade profissional em Saúde Ocupacional no início da década de noventa. A estes junta-se um número, relativamente pequeno, de médicos de empresa habilitados ao abrigo de disposições transitórias e excepcionais contempladas na legislação de organização de serviços médicos do trabalho de 1962 e 1967 (Portugal, 1991b). A partir de 1991 têm início os Cursos de Medicina do Trabalho das Universidades de Coimbra e do Porto, com a admissão anual e bianual de candidatos, respectivamente. Os diplomados destas escolas representam um número acrescido de profissionais que iniciam a sua actividade neste período de transição na organização dos cuidados de Segurança, Higiene e Saúde no Trabalho (Decreto Lei nº 441/91; Decreto Lei n.º 26/94; Lei n.º 7/95). A Estratégia Global da Saúde Ocupacional para Todos aprovada pela Assembleia Mundial da Saúde em 1995 constitui a estrutura de enquadramento da nova política de saúde ocupacional que inclui entre as suas dez prioridades o desenvolvimento de serviços orientados para a população trabalhadora (WHO, 1995). Estes serviços devem funcionar bem, de forma competente e compreensiva, centrados na prevenção multidisciplinar e incluir a vigilância do ambiente de trabalho e da saúde dos trabalhadores e a promoção da saúde, conforme a Declaração de Saúde Ocupacional Para Todos aprovada no segundo encontro de Centros Cooperativos para a SO da OMS, realizado em Pequim, em 1994. Este trabalho tem como finalidade conhecer as eventuais inter-relações entre o novo modelo legal de organização dos cuidados de Segurança, Higiene e Saúde no Trabalho (SHST), instituído em Portugal nos anos de 1994/1995, e o pensamento e a prática profissional dos médicos do trabalho diplomados pela Escola Nacional de Saúde Pública da Universidade Nova de Lisboa (ENSP/UNL). De um modo mais específico pretende-se descrever em que medida o novo enquadramento jurídico da MT/SHST/SO, correspondente genericamente à fase da Nova Saúde Ocupacional, foi acompanhado de alterações: (1) da percepção do grau de satisfação dos médicos do trabalho quanto ao seu papel e estatuto profissionais; (2) do nível de satisfação relativo à formação especializada formal (Curso de Medicina do Trabalho da ENSP/UNL) versus as necessidades da prática profissional; (3) da efectividade do desempenho profissional e (4) da adequação do novo modelo de organização de serviços de MT/ SHST/SO ao contexto do desenvolvimento sócio-económico e científico nacional e ao sentir dos médicos do trabalho. Quatro grandes temáticas vão ser abordadas: (1) politicas, organização e desenvolvimento da saúde ocupacional nacional e de empresa; (2) papel e funções dos médicos do trabalho; (3) ensino e necessidades formativas em saúde ocupacional; (4) prática profissional dos médicos do trabalho de empresa. Os resultados obtidos serão contextualizados através do enquadramento num modelo teórico explicativo da evolução histórica dos cuidados de saúde à população trabalhadora em meio laboral e que é alvo de revisão no presente trabalho. Este estudo enquadra-se nos objectivos e temas de investigação prioritários da Saúde Para Todos (SPT) da região europeia da OMS, nomeadamente o estudo do funcionamento dos actuais sistemas de assistência sanitária, tendo em vista a adequada cobertura das necessidades de saúde de

Caracterização das actividades pedagógicas promotoras do desenvolvimento das competências visuais que influenciam a iniciação à leitura e à escrita

RESUMO: A presente tese de dissertação de mestrado visa a contribuição para o enriquecimento da organização curricular da Educação Pré-Escolar. Baseia-se num estudo de natureza estatística descritiva, desenvolvido junto de uma amostra de vinte e três Educadores de Infância, dos Jardins de Infância do Concelho de Lourinhã, através da aplicação de um questionário, que procura caracterizar as actividades promotoras de competências visuais, quanto ao grau de importância e de frequência, no que constituem os pré requisitos para a leitura e a escrita. Os resultados sugerem a necessidade de uma maior sistematização dessas actividades e demonstram que um número significativo de actividades são desenvolvidas, neste âmbito, pelos educadores de infância, havendo, no entanto, aspectos considerados lógicos por autores como a Barraga e a Chapman, que não são geralmente considerados. A ênfase das conclusões é colocada, na necessidade de alargar o leque de actividades promotoras dos pré-requisitos para a iniciação à leitura e escrita e às actividades previstas nos Programas Educativos Individuais, para crianças com baixa visão, através da articulação com o docente de educação especial, de forma a que a sua intervenção especializada envolva todos os aspectos considerados fundamentais no treino de visão destas crianças. ABSTRACT: This master’s degree thesis is based on a descriptive statistical study, conducted with a sample of twenty three preschool Teachers working in public kindergartens in Lourinhã, Portugal. The study was based on the results of a questionnaire aimed at contributing to enrich preschool Curricula. The study was based on the scientific knowledge of the precise classroom activities which contribute to develop visual abilities needed for reading and writing. The activities were characterized according to their importance and frequency. The results suggest that these activities should be more planned and more organised. It showed a significant number of activities which are prepared on a regular basis and considered important but, on the other hand; it also showed a significant number of activities which are prepared occasionally. The emphasis of the conclusions is on the fact that the Curricula should include a larger range of activities that promote visual abilities needed for reading and writing and that Individual Educational Programs for low vision children, which include specific activities for vision training, should be built in team with the classroom teacher. In addition, Special Education Teacher’s program should contemplate all the aspects that the Preschool teachers do not, in order to involve all the important aspects for vision training.

Altruísmo e/ou ilusão? A política portuguesa pós-colonial de "cooperação para o desenvolvimento" : construindo pontes para a "lusofonia"

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Migrações, Inter-Etnicidades e Transnacionalismo

Ortografia e desenvolvimento da escrita

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Desenvolvimento e Perturbações da Linguagem na Criança, área de especialização em Educação e Ensino da Língua

O desenvolvimento da competência intercultural através do Task-Based learning na aula de língua estrangeira

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ensino de Inglês e de Língua Estrangeira (Francês) no 3.º Ciclo do Ensino Básico e no Ensino Secundário

Desenvolvimento de sistemas de medição interferométrica para a calibração de distanciómetros

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Desenvolvimento de padrão gravimétrico de medição de caudal de fluidos entre 10 mL/min e 100 nL/min

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Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Ciência e Engenharia dos Materiais

Desenvolvimento vocal na infância: análise acústica de vocalizações de bebés face a estímulos musicais e linguísticos durante o segundo ano de vida

Tese apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Ciências Musicais, na especialidade de Ensino e Psicologia da Música

Desenvolvimento de estratégias para aumentar a produtividade e controlar as propriedades de biopolímeros (PHAs) produzidas por culturas mistas

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestrado em Engenharia Química e Bioquímica

Odivelas: Rumo ao Desenvolvimento Sustentável Ambiental

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciência Política e Relações Internacionais com especialização em Globalização e Ambiente