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em RUN (Repositório da Universidade Nova de Lisboa) - FCT (Faculdade de Cienecias e Technologia), Universidade Nova de Lisboa (UNL), Portugal
Resumo:
Dissertao apresentada para cumprimento dos requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Cincias da Educao (rea de Especializao em Anlise e Interveno em Educao)
Resumo:
RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfcie celular e os lpidos e protenas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interaces crticas homlogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterlogas (hospedeiro-patognio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos so parte integrante do processo de imunidade, continua a no ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que so frequentemente terminados por resduos de cido silico, podem ser alterados por factores externos, tais como patognios, ou por acontecimentos fisiolgicos celulares especficos. Normalmente em posio terminal, as glico-estruturas que contm cido silico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e trfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante funo imune. altura do incio desta tese, era sabido que os cidos silicos expressos superfcie das clulas poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posio de charneira que as clulas dendrticas (DCs) ocupam na transio da resposta imune inata para a adaptativa, antecipmos que os cidos silicos poderiam tambm modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs tm uma funo muito relevante na verificao e captura antignica, migrao para os gnglios linfticos e apresentao antignica aos linfcitos, uma sequncia de funes que conduz, em ultima instncia, induo da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hiptese principal foi que os cidos silicos podem influenciar funes relevantes das DCs, tais como captura de antignios, maturao, migrao para os gnglios linfticos e apresentao antignica s clulas Para testar esta hiptese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analismos os glicanos sialilados de superfcie, expressos durante a diferenciao de moncitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expresso dos glicanos com ligaes em O (O-glicanos) e sialilados em 2,3, assim como glicanos com ligaes em N (N-glicanos) sialilados em 2,6 e 2,3 aumentou durante o processo de diferenciao das moDCs. Contribuindo para esta nova configurao glicosdica, trs sialiltransferases (STs) podero estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expresso aumentada de N-glicanos sialilados em 2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilao em 2,3 de O-glicanos, em especial de antignios T; e a ST3Gal-4 poder ser responsvel pelo aumento de N-glicanos sialilados em 2,3. Aps estmulo e consequente maturao das moDCs, ambos os nveis de expresso gnica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 so negativamente modificados sendo, tambm, que a expresso de ST3Gal-1 varia consoante o estmulo. 2) Estudmos posteriormente as consequncias da modulao dos cidos silicos de superfcie nas funes das DCs. Observmos que a remoo dos cidos silicos de superfcie diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se tambm que este mecanismo requer a existncia de cido silico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interaco hospedeiro-patognio dependente de cido silico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase tambm apresentam um nvel superior de expresso de molculas de MHC e molculas co-estimulatrias, sugerindo um fentipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de clulas da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturao so influenciadas por modificaes 37 nos glicanos sialilados em 2,3 ou 2,6. A deteco e quantificao de protenas Nglicosiladas e sialiladas em 2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas 2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilao em 2,6 na migrao das DCs para os gnglios linfticos foi tambm analisado. Observmos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma reduo de cerca de 50% nos nveis de migrao das DCs para os gnglios linfticos, tal como aferido em ensaios de inflamao in situ e estudos de transferncia adoptiva de clulas. Uma reduo dos nveis deste tipo de migrao foi tambm observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. So, contudo, necessrios mais ensaios de forma a identificar as molculas envolvidas neste processo. 4) Por ltimo, analismos o impacto da sialilao na estimulao antignica das DCs s clulas T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nvel de expresso superior de IL-12, TNF-, IL-6 e IL-10, e activao do factor de transcrio nuclear kappa B (NF-B). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferao nas clulas T, com expresso correspondente de interfero-. Este dado sugere que a remoo de cidos silicos de superfcie contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatria do tipo 1 por clulas T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, conclumos que o cido silico tem um papel marcante nas funes imunes das DCs. Alteraes concentrao de cido silico superfcie das clulas podem alterar a endocitose/fagocitose, maturao, migrao para os tecidos e gnglios linfticos e capacidade estimulatria para com as clulas T. Complementando estes dados, as ligaes glicosdicas de cidos silicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 so funcionalmente relevantes. A modulao programada da sialilao do glicoclice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases uma possibilidade aceitvel para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potncia imunolgica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficincia e aplicabilidade num futuro muito prximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical hosthost and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that 2,3-sialylated O-glycans and 2,6- and 2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of 2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the 2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased 2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of hostpathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either 2,3 or 2,6-sialylated glycans. The analysis of 2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of 2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of 2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-B. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acids relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.
