Development of human central nervous system 3D in vitro models for preclinical research

Neurological disorders are a major concern in modern societies, with increasing prevalence mainly related with the higher life expectancy. Most of the current available therapeutic options can only control and ameliorate the patients’ symptoms, often be-coming refractory over time. Therapeutic breakthroughs and advances have been hampered by the lack of accurate central nervous system (CNS) models. The develop-ment of these models allows the study of the disease onset/progression mechanisms and the preclinical evaluation of novel therapeutics. This has traditionally relied on genetically engineered animal models that often diverge considerably from the human phenotype (developmentally, anatomically and physiologically) and 2D in vitro cell models, which fail to recapitulate the characteristics of the target tissue (cell-cell and cell-matrix interactions, cell polarity). The in vitro recapitulation of CNS phenotypic and functional features requires the implementation of advanced culture strategies that enable to mimic the in vivo struc-tural and molecular complexity. Models based on differentiation of human neural stem cells (hNSC) in 3D cultures have great potential as complementary tools in preclinical research, bridging the gap between human clinical studies and animal models. This thesis aimed at the development of novel human 3D in vitro CNS models by integrat-ing agitation-based culture systems and a wide array of characterization tools. Neural differentiation of hNSC as 3D neurospheres was explored in Chapter 2. Here, it was demonstrated that human midbrain-derived neural progenitor cells from fetal origin (hmNPC) can generate complex tissue-like structures containing functional dopaminergic neurons, as well as astrocytes and oligodendrocytes. Chapter 3 focused on the development of cellular characterization assays for cell aggregates based on light-sheet fluorescence imaging systems, which resulted in increased spatial resolu-tion both for fixed samples or live imaging. The applicability of the developed human 3D cell model for preclinical research was explored in Chapter 4, evaluating the poten-tial of a viral vector candidate for gene therapy. The efficacy and safety of helper-dependent CAV-2 (hd-CAV-2) for gene delivery in human neurons was evaluated, demonstrating increased neuronal tropism, efficient transgene expression and minimal toxicity. The potential of human 3D in vitro CNS models to mimic brain functions was further addressed in Chapter 5. Exploring the use of 13C-labeled substrates and Nucle-ar Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy tools, neural metabolic signatures were evaluated showing lineage-specific metabolic specialization and establishment of neu-ron-astrocytic shuttles upon differentiation. Chapter 6 focused on transferring the knowledge and strategies described in the previous chapters for the implementation of a scalable and robust process for the 3D differentiation of hNSC derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). Here, software-controlled perfusion stirred-tank bioreactors were used as technological system to sustain cell aggregation and dif-ferentiation. The work developed in this thesis provides practical and versatile new in vitro ap-proaches to model the human brain. Furthermore, the culture strategies described herein can be further extended to other sources of neural phenotypes, including pa-tient-derived hiPSC. The combination of this 3D culture strategy with the implemented characterization methods represents a powerful complementary tool applicable in the drug discovery, toxicology and disease modeling.

From user browsing behaviour to user demographics

A Internet conta hoje com mais de 3 mil milhões de utilizadores e esse valor não para de aumentar. Desta forma, proporcionar uma experiência online agradável aos seus utilizadores é cada vez mais importante para as empresas. De modo a tirar partido dos benefícios deste crescimento, as empresas devem ser capazes de identificar os seus clientes-alvo dentro do total de utilizadores; e, subsequentemente, personalizar a sua experiência online. Existem diversas formas de estudar o comportamento online dos utilizadores; no entanto, estas não são ideais e existe uma ampla margem para melhoria. A inovação nesta área pode comportar um grande potencial comercial e até ser disruptiva. Com isto em mente, proponho-me a estudar a possível criacão de um sistema de aprendizagem automática (machine learning) que permita prever informa ações demográficas dos utilizadores estritamente com base no seu comportamento online. Tal sistema poderia constituir uma alternativa às atuais opções, que são mais invasivas; mitigando assim preocupações ao nível da proteção de dados pessoais. No primeiro capítulo (Introdução) explico a motivação para o estudo do comportamento dos utilizadores online por parte de empresas, e descrevo as opções disponíveis atualmente. Apresento também a minha proposta e o contexto em que assenta. O capítulo termina com a identicação de limitações que possam existir a priori. O segundo capítulo (Machine Learning) fornece uma introdução sobre machine learning, com o estudo dos algoritmos que vão ser utilizados e explicando como analisar os resultados. O terceiro capítulo (Implementação) explica a implementação do sistema proposto e descreve o sistema que desenvolvi no decorrer deste estudo, e como integra-lo em sistemas já existentes. No quarto capítulo (Análise e manipulação dos dados), mostro os dados compilados e explico como os recolhi e manipulei para testar a hipótese. No quinto capítulo (Análise de dados e discussão) vemos como e que os dados recolhidos foram usados pelos vários algoritmos para descobrir como se correlacionam com dados dos utilizadores e analiso e discuto os resultados observados. Por fim, o sexto e último capítulo apresenta as conclusões. Dependendo dos resultados, mostro como a hipótese poderia ser melhor testada, ou então discuto os próximos passos para tornar o sistema realidade.