Evaluation of antihypertensive drugs in patients with obstructive sleep apnea and in rats submitted to chronic intermittent hypoxia

RESUMO: A hipertens��o arterial (HA) �� uma patologia altamente prevalente, embora claramente subdiagnosticada, em doentes com s��ndrome de apneia obstrutiva do sono (SAOS). Estas duas patologias apresentam uma estreita rela����o e a monitoriza����o ambulat��ria da press��o arterial (MAPA), por um per��odo de 24 horas, parece ser o m��todo mais preciso para o diagn��stico de hipertens��o em doentes com SAOS. No entanto, esta ferramenta de diagn��stico para al��m de ser dispendiosa e envolver um n��mero acrescido de meios t��cnicos e humanos, �� mais morosa e, por conseguinte, n��o �� utilizada por rotina no contexto do diagn��stico da SAOS. Por outro lado, apesar da aplica����o de press��o positiva cont��nua nas vias a��reas (CPAP ��� Continous Positive Airway Pressure) ser considerada a terap��utica de elei����o para os doentes com SAOS, o seu efeito no abaixamento da press��o arterial (PA) parece ser modesto, exigindo, por conseguinte, a implementa����o concomitante de terap��utica anti-hipertensora. Acontece que s��o escassos os dados relativos aos regimes de f��rmacos anti-hipertensores utilizados em doentes com SAOS e, acresce ainda que, as guidelines terap��uticas para o tratamento farmacol��gico da HA, neste grupo particular de doentes, permanecem, at�� ao momento, inexistentes. A utiliza����o de modelos animais de hipóxia cr��nica intermitente (CIH), que mimetizam a HA observada em doentes com SAOS, revela-se extremamente importante, uma vez que se torna imperativo identificar f��rmacos que promovam um controle adequado da PA neste grupo de doentes. No entanto, estudos concebidos com o intuito de investigar o efeito anti-hipertensor dos f��rmacos neste modelo animal revelam-se insuficientes e, por outro lado, os escassos estudos que testaram f��rmacos anti-hipertensores neste modelo n��o foram desenhados para responder a quest��es de natureza farmacol��gica. Acresce ainda que se torna imprescind��vel garantir a escolha de um m��todo para administra����o destes f��rmacos que seja n��o invasivo e que minimize o stress do animal. Embora a gavagem seja uma t��cnica indiscutivelmente eficaz e amplamente utilizada para a administra����o di��ria de f��rmacos a animais de laborat��rio, ela compreende uma sequ��ncia de procedimentos geradores de stress para os animais e, que podem por conseguinte, constituir um vi��s na interpreta����o dos resultados obtidos. O objectivo global da presente investiga����o translacional foi contribuir para a identifica����o de f��rmacos anti-hipertensores mais efectivos para o tratamento da HT nos indiv��duos com SAOS e investigar mecanismos subjacentes aos efeitos sist��micos associadas �� SAOS bem como a sua modula����o por f��rmacos anti-hipertensores. Os objectivos espec��ficos foram: em primeiro lugar,encontrar novos crit��rios, baseados nas medidas antropom��tricas, que permitam a identifica����o de doentes com suspeita de SAOS, que erroneamente se auto-classifiquem como n��ohipertensos, e desta forma promover um uso mais criterioso do MAPA; em segundo lugar, investigar a exist��ncia de uma hipot��tica associa����o entre os esquemas de f��rmacos antihipertensores e o controle da PA (antes e ap��s a adapta����o de CPAP) em doentes com SAOS em terceiro lugar, avaliar a efic��cia do carvedilol (CVD), um f��rmaco bloqueador ��-adren��rgico n��o selectivo com actividade antagonista ��1 intr��nseca e propriedades anti-oxidantes num modelo animal de hipertens��o induzida pela CIH; em quarto lugar, explorar os efeitos da CIH sobre o perfil farmacocin��tico do CVD; e, em quinto lugar, investigar um m��todo alternativo �� gavagem para a administra����o cr��nica de f��rmacos anti-hipertensores a animais de laborat��rio. Com este intuito, na primeira fase deste projecto, fizemos uso de uma amostra com um n��mero apreci��vel de doentes com SAOS (n=369), que acorreram, pela primeira vez, �� consulta de Patologia do Sono do CHLN e que foram submetidos a um estudo polissonogr��fico do sono, �� MAPA e que preencheram um question��rio que contemplava a obten����o de informa����o relativa ao perfil da medica����o anti-hipertensora em curso. Numa segunda fase, utiliz��mos um modelo experimental de HT no rato induzida por um paradigma de CIH. Do nosso trabalho resultaram os seguintes resultados principais: em primeiro lugar, o ��ndice de massa corporal (IMC) e o per��metro do pesco��o (PP) foram identificados como preditores independentes de ���auto-classifica����o err��nea��� da HA em doentes com suspeita de SAOS; em segundo lugar, n��o encontramos qualquer associa����o com significado estat��stico entre os v��rios esquemas de f��rmacos anti-hipertensores bem como o n��mero de f��rmacos inclu��dos nesse esquemas, e o controle da PA (antes e depois da adapta����o do CPAP); em terceiro lugar, apesar das doses de 10, 30 e 50 mg/kg de carvedilol terem promovido uma redu����o significativa da frequ��ncia card��aca, n��o foi observado qualquer decr��scimo na PA no nosso modelo animal; em quarto lugar, as raz��es S/(R+S) dos enanti��meros do CVD nos animais expostos �� CIH e a condi����es de norm��xia revelaram-se diferentes; e, em quinto lugar, a administra����o oral volunt��ria mostrou ser um m��todo eficaz para a administra����o di��ria controlada de f��rmacos anti-hipertensores e que �� independente da manipula����o e conten����o do animal. Em conclus��o, os resultados obtidos atrav��s do estudo cl��nico revelaram que o controle da PA, antes e ap��s a adapta����o do CPAP, em doentes com SAOS �� independente, quer do esquema de f��rmacos anti-hipertensores, quer do n��mero de f��rmacos inclu��dos num determinado esquema. Os nossos resultados salientam ainda a falta de validade da chamada self-reported hypertension e sugerem que em todos os doentes com suspeita de SAOS, com HA n��o diagnosticada e com um IMC e um PP acima de 27 kg/m2 e 39 cm, respectivamente, a confirma����o do diagn��stico de HA dever�� ser realizada atrav��s da MAPA, ao inv��s de outros m��todos que com maior frequ��ncia s��o utilizados com este prop��sito. Os resultados obtidos no modelo animal de HA induzida pela CIH sugerem que o bloqueio do sistema nervoso simp��tico, juntamente com os supostos efeitos pleiotr��picos do CVD, n��o parece ser a estrat��gia mais adequada para reverter este tipo particular de hipertens��o e indicam que as altera����es farmacocin��ticas induzidas pela CIH no ratio S/(R+S) n��o justificam a falta de efic��cia anti-hipertensora do CVD observada neste modelo animal. Por ��ltimo, os resultados do presente trabalho suportam ainda a viabilidade da utiliza����o da administra����o oral volunt��ria, em alternativa �� gavagem, para a administra����o cr��nica de uma dose fixa de f��rmacos anti-hipertensores.---------------------------- ABSTRACT: Hypertension (HT) is a highly prevalent condition, although under diagnosed, in patients with obstructive sleep apnea (OSA). These conditions are closely related and 24-hour ambulatory blood pressure monitoring (ABPM) seems to be the most accurate measurement for diagnosing hypertension in OSA. However, this diagnostic tool is expensive and time-consuming and, therefore, not routinely used. On the other hand, although continuous positive airway pressure (CPAP) is considered the gold standard treatment for symptomatic OSA, its lowering effect on blood pressure (BP) seems to be modest and, therefore, concomitant antihypertensive therapy is still required. Data on antihypertensive drug regimens in patients with OSA are scarce and specific therapeutic guidelines for the pharmacological treatment of hypertension in these patients remain absent. The use of animal models of CIH, which mimic the HT observed in patients with OSA, is extremely important since it is imperative to identify preferred compounds for an adequate BP control in this group of patients. However, studies aimed at investigating the antihypertensive effect of antihypertensive drugs in this animal model are insufficient, and most reports on CIH animal models in which drugs have been tested were not designed to respond to pharmacological issues. Moreover, when testing antihypertensive drugs (AHDs) it becomes crucial to ensure the selection of a non-invasive and stress-free method for drug delivery. Although gavage is effective and a widely performed technique for daily dosing in laboratory rodents, it comprises a sequence of potentially stressful procedures for laboratory animals that may constitute bias for the experimental results. The overall goal of the present translational research was to contribute to identify more effective AHDs for the treatment of hypertension in patients with OSA and investigate underlying mechanisms of systemic effects associated with OSA, as well as its modulation by AHDs. The specific aims were: first, to find new predictors based on anthropometric measures to identify patients that misclassify themselves as non-hypertensive, and thereby promote the selective use of ABPM; second, to investigate a hypothetical association between ongoing antihypertensive regimens and BP control rates in patients with OSA, before and after CPAP adaptation; third, to determine, in a rat model of CIH-induced hypertension, the efficacy of carvedilol (CVD), a nonselective beta-blocker with intrinsic anti-��1-adrenergic activity and antioxidant properties; fourth, to explore the effects of CIH on the pharmacokinetics profile of CVD and fifth, to investigate an alternative method to gavage, for chronic administration of AHDs to laboratory rats. For that, in the first phase of this project, we used a sizeable sample of patients with OSA (n=369), that attended a first visit at Centro Hospitalar Lisboa Norte, EPE Sleep Unit, and underwent overnight polysomnography, 24-h ABPM and filled a questionnaire that included ongoing antihypertensive medication profile registration. In the second phase, a rat experimental model of HT induced by a paradigm of CIH that simulates OSA was used. The main findings of this work were: first, body mass index (BMI) and neck circumference (NC) were identified as independent predictors of hypertension misclassification in patients suspected of OSA; second, in patients with OSA, BP control is independent of both the antihypertensive regimen and the number of antihypertensive drugs, either before or after CPAP adaptation; third, although the doses of 10, 30 and 50 mg/Kg of CVD promoted a significant reduction in heart rate, no decrease in mean arterial pressure was observed; fourth, the S/(R+S) ratios of CVD enantiomers, between rats exposed to CIH and normoxic conditions, were different and fifth, voluntary ingestion proved to be an effective method for a controlled daily dose administration, with a define timetable, that is independent of handling and restraint procedures. In conclusion, the clinical study showed that BP control in OSA patients is independent of both the antihypertensive regimen and the number of antihypertensive drugs. Additionally, our results highlight the lack of validity of self-reported hypertension and suggest that all patients suspected of OSA with undiagnosed hypertension and with a BMI and NC above 27 Kg/m2 and 39 cm should be screened for hypertension, through ABPM. The results attained in the rat model of HT related to CIH suggest that the blockade of the sympathetic nervous system together with the putative pleiotropic effects of carvedilol is not able to revert hypertension induced by CIH and point out that the pharmacokinetic changes induced by CIH on S/(R+S) ratio are not apparently responsible for the lack of efficacy of carvedilol in reversing this particular type of hypertension. Finally, the results here presented support the use of voluntary oral administration as a viable alternative to gavage for chronic administration of a fixed dose of AHDs.

Estudo da vasculariza����o dos nervos perif��ricos e da sua influ��ncia na regenera����o nervosa : estudo experimental e no cad��ver humano

RESUMO: Na cl��nica, a recupera����o funcional que se segue a uma les��o nervosa raramente �� atingida na sua totalidade. A reinerva����o, quer motora, quer sensitiva, ocorre geralmente com maior ou menor deficit. Interessa, ent��o, identificar os factores que podem interferir na regenera����o nervosa. O neur��nio �� a unidade anat��mica fundamental do sistema nervoso perif��rico e �� muito vulner��vel �� isquemia pela grande dist��ncia que existe entre o corpo neuronal e a extens��o do ax��nio, que pode ser de apenas alguns mil��metros ou at�� atingir um metro. ��, por isso, fundamental o estudo da vasculariza����o do nervo perif��rico e da sua influ��ncia na regenera����o nervosa. O resultado deste estudo pode levar ao desenvolvimento de t��cnicas cir��rgicas que criem as condi����es que garantam, por sua vez, a revasculariza����o precoce do nervo perif��rico em caso de les��o, ou mesmo em caso de doen��as, nas quais a vasculariza����o do nervo est�� alterada como, por exemplo, na neuropatia diab��tica. O estudo da vasculariza����o do nervo perif��rico realizou-se atrav��s da investiga����o da vasculariza����o do nervo mediano do cad��ver humano, pela investiga����o da vasculariza����o do nervo isqui��tico do rato Wistar e do Plexo Braquial (PB) do mesmo. A vasculariza����o do PB do rato n��o �� muito diferente daquela que �� reportada na esp��cie humana, existindo uma homologia entre o rato e o Homem no que diz respeito �� morfologia e �� vasculariza����o do PB. Atrav��s da compara����o angiomorfol��gica entre o nervo isqui��tico do rato e o nervo mediano humano, conclu��u-se que a microvasculariza����o do nervo isqui��tico do rato e do mediano humano s��o muito semelhantes, o que suporta a utiliza����o do rato como modelo experimental de les��es do nervo mediano humano. Para a avalia����o da influ��ncia da vasculariza����o na regenera����o nervosa foi feita a an��lise da efic��cia de enxerto de tubo de membrana amni��tica humana imunologicamente inerte, de enxerto de veia jugular externa aut��loga e de auto-enxerto de nervo, na repara����o de um defeito de 10 mil��metros no nervo isqui��tico do rato, na presen��a de um fornecimento vascular axial, comparando-se com os mesmos procedimentos em estudos realizados anteriormente, sem suprimento vascular. Os ratos foram avaliados funcionalmente atrav��s do estudo das pegadas, da electroneurografia e da for��a de flex��o ao n��vel do tornozelo, e estruturalmente, atrav��s das avalia����es histol��gicas e morfom��tricas, da taxa de recupera����o do peso dos m��sculos gastrocn��mio e solhear e da marca����o axonal retr��grada com True Blue ��s 4, 8 e 12 semanas. Os nervos reconstru��dos apresentaram uma arquitectura normal, incluindo a arquitectura vascular. A membrana amni��tica foi bem tolerada, persistindo imunologicamente em torno do nervo at�� �� 12.�� semana. Concluiu-se tamb��m que, na presen��a de um suprimento vascular axial local, a membrana amni��tica humana e as veias aut��logas s��o, pelo menos, t��o eficazes como os auto-enxertos nervosos na reconstru����o de defeitos nervosos de 10 mil��metros.--------------------------------------ABSTRACT: At the clinic, the functional recovery that follows a nerve lesion is rarely achieved in full. The neuron is very vulnerable to ischemia that���s why it is essential to study the vascularization of the peripheral nerve and its influence on the nerve���s regeneration. The outcome of this study may lead to the development of surgical techniques that create the conditions which are necessary to ensure an early revascularization in case of a peripheral nerve injury. This study investigated the vascularization of the median nerve of the human cadaver and the vascularization of the sciatic nerve of the Wistar rat and his Brachial Plexus (BP) through animal experimentation. The mouse's BP vascularization is not so different from the one that is reported in the human species. An angiomorphological comparison between the mouse sciatic nerve and the human median nerve concluded that the microvascularizations are very similar, which supports the use of the mouse as an experimental model for the study of median nerve���s lesions. To evaluate the influence of vascularization in the nerve���s regeneration, it was made an assessment of the effectiveness of the human amniotic immuno-inert membrane grafts, of the autologous external jugular vein grafts and of the nerve auto-graft in the repair of a defect of 10 mm on the sciatic nerve of the rat, in the presence of an axial vascular supply, comparing these with the same procedures that were adopted in the previous studies, without vascular supply. The rats were functionally assessed and structurally evaluated (through histological and morphometric evaluations) at the 4.th, 8.th and 12.th weeks. The nerves reconstructed presented a normal architecture, including vascular architecture. The amniotic membrane was well-tolerated immunologically, persisting around the nerve until the 12.th week. As a result, it was also concluded that in the presence of a local axial vascular supply, the human amniotic membrane and the autologous veins are, at least, as effective as the nerve auto-grafts in the reconstruction of the nerve���s defects of 10 mm.