Identificação e quantificação de adutos covalentes formados entre a valina Nterminal da hemoglobina e o fármaco nevirapina em doentes de HIV: Desenvolvimento e validação de um método analítico por espectrometria de massa de alta resolução

A nevirapina é o fármaco antirretroviral mais utilizado nos países em desenvolvimento para combater o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Apesar dos seus efeitos benéficos, a nevirapina tem sido associada a casos de hipersensibilidade cutânea e hepatoxicidade graves ou mesmo fatais. Estudos recentes sugerem o envolvimento da bioactivação do seu metabolito de Fase I, 12-OHNevirapina, a espécies electrofílicas capazes de formar adutos covalentes com proteínas. A identificação dos adutos formados, por esta via de bioactivação, com a valina N-terminal da hemoglobina (Hb) isolada de doentes sob terapêutica com a nevirapina foi já efectuada. A técnica analítica utilizada envolveu a utilização do método de derivatização N-alquilo Edman que, por reacção com fenilisotiocianato (PITC), permite destacar o aduto formado com o resíduo N-terminal da Hb, sob a forma de uma hidantoina, que foi posteriormente analisado e quantificado por cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massa de tandem por ionização de electrospray. O presente trabalho teve como objectivo inicial optimizar o procedimento experimental envolvido no procedimento de N-alquilo Edman, tendo-se inicialmente comparado a sensibilidades obtidas mediante a utilização de dois agentes derivatizante: o PITC e o isotiocianato de fluoresceína (FTIC). Este processo inicial permitiu estabelecer que a utilização do PTIC como agente de derivatização conduzia a melhores resultados, tendo-se prosseguido com o desenvolvimento e a validação do método analítico para a quantificação deste aduto por cromatografia líquida acoplado a espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS). O método analítico desenvolvido apresentou recuperações entre 36 e 57 %, supressão de sinal de 19 % e um limite de quantificação (LOQ) de 1,4 ppb (média da exactidão = 98 %; CV = 5 %). A metodologia validada foi depois aplicada na quantificação de adutos de nevirapina em duas amostras de Hb isolada de doentes de HIV e os níveis de adutos obtidos foram de 95 e 92 pmol/g de Hb.

Comparação entre um método aproximado e um método numérico para cálculo de deformações em treliças e otimização dessas estruturas

Pretende-se estudar a utilização de um método analítico relativamente básico para cál-culo de deformações em treliças com vãos consideravelmente longos, com o intuito de ajudar o projetista a conceber um futuro projeto antes de conhecer a geometria da estrutura reticulada as-sim como as áreas de secção transversal dos elementos que a compõe. Numa primeira fase é avaliado o grau de aproximação à realidade do método analítico, e numa segunda fase é avaliado o ganho que pode ser obtido por utilização de métodos numéricos, podendo esta dissertação ser dividida em duas partes:  Uma análise estrutural comparativa entre um método analítico aproximado para o cálculo de deformações em treliças e um método numérico obtido a partir de um programa for-mulado para se usar em MATLAB, o PROAES, com o objetivo de avaliar a sua aderência à realidade;  Otimização dessas estruturas, primeiro de topologia para definir quais os elementos que serão necessários para a composição geométrica da treliça e em seguida uma combinação de otimização dimensional com otimização de forma para definir o valor das áreas de secção transversal de cada um dos elementos e a posição dos nós que os unem. Pretende-se também salientar a importância da carga crítica em estruturas do tipo tre-liça, nos elementos sujeitos a esforços normais de compressão, e qual a influência na geometria da estrutura e nas suas dimensões. O programa PROAES torna-se vantajoso face a outros algoritmos de otimização porque tem em conta as derivadas dos constrangimentos em ordem às variáveis consideradas no projeto, o que para além de acelerar o processo de otimização a nível informático, torna-se mais focado na procura de uma solução, na medida em que é um método determinístico e não aleatório, como é o caso, por exemplo, do método dos algoritmos genéticos.

Desenvolvimento do modelo para avaliação de parâmetros hemodinâmicos do sistema mãe-placenta

Uma das principais causas de mortalidade durante a gravidez está relacionada com variações na pressão arterial materna, tal como a pré-eclâmpsia. Esta dissertação surgiu da necessidade de compreender o que provoca alterações na pressão arterial, a sua relação com o fluxo e velocidade e os efeitos nas artérias uterinas. De forma a perceber os efeitos da pressão no fluxo sanguíneo, modelou-se o sistema arterial materno, desde a aorta até às artérias uterinas, numa ferramenta de desenho tridimensional. Neste modelo foi aplicado um método de cálculo utilizando uma ferramenta de dinâmica de fluídos computacional, no qual se simulou o fluxo sanguíneo. Utilizaram-se como parâmetros de entrada, na aorta ascendente, uma função de velocidade e um valor saudável de pressão arterial central, e como parâmetro de saída introduziram-se vários valores de pressão arterial periférica normal e típicos de situações patofisiológicas, tais como hipertensão e pré-eclâmpsia. Obtiveram-se diagramas de velocidade, pressão e tensão de corte ao longo de todo o modelo arterial. Em cada saída do modelo, obtiveram-se os valores de fluxo calculados automaticamente, para cada pressão de saída introduzida. Alguns dos valores de fluxo obtidos foram comparados com valores existentes na literatura, de forma a avaliar a eficácia do modelo desenhado, concluindo-se que este produzia valores próximos dos reais. Desta forma efectuaram-se várias simulações, através das quais se percebeu que aumentando a pressão nas artérias uterinas, e mantendo constante a pressão de entrada, o fluxo de saída também aumenta.

Relatório de estágio na Caixa Geral de Depósitos

This report will describe the activities undertaken during my internship at the Personnel Department (DPE-UPE4.1) in Caixa Geral de Depósitos (CGD), Lisbon, between September 22, 2014, and February 28, 2015. I consider that it is important to note from the outset i) that the subject of my training was suggested by my supervisor in the DPE and accepted by me; and ii) that the internship consisted essentially of carrying out research and information gathering into the different social systems that coexist within the bank and the application of each legal system in solving concrete situations of the CGD employees. The research and analysis of information was important not only for my study but for the CGD itself, as it enables the department to have such an important matter, full of specific characteristics, condensed into a single document, i.e. this report. This is a complex reality. The various welfare systems differ according to the contractual agreement linking the employee to the employer at the date when the labour contract is signed, and also the unique/singular characteristics of the CGD. In the early stage I started by trying to understand the financial institution and its organization and role and the department where I worked. So I analyzed the CGD Statutes and the legal measures that crystallized the scheme for its employees and I also researched its domestic and international operations. The first month was devoted to the research and analysis of such legislation to understand the creation of the CGD and its path to date. In the second and third months I studied the legal social systems that are applied to different groups of CGD workers. This period was quite important to identify and understand the differences between those regimes of CGD employees as well as the procedure inherent in each case. I highlighted the non-implementation of “the social protection regime of convergence” to the workers of this institution; the differences regarding the allocation of sickness subsidies paid to workers who belong to Social Security and CGA contributors, as well as the enforcement of internal rules to all the workers when a work-related accident happens.Then I focused on to assessing and examining external legislation and several internal regulations in order to obtain solutions to questions raised and situations involving by the workers, in order to understand how the DPE solves these situations. Over the last three months of internship, after this more theoretical work, I began the analysis of concrete situations involving employees carrying out their duties in Portugal and abroad. Some of these situations had been received by the department before the beginning of my internship and others over this period. When I was “working” in the DPE I analyzed “cases” that had been solved and some others without a final solution because they were still in courts. As for the last ones (new cases) I was able to follow their assessment and sometimes their outcome. Some of them became study cases for me. Over these five months of my internship, several cases were analyzed and discussed by legal experts of DPE in which I could participate. I always worked hard. I know that this action contributed to elucidate me about the treatment of the issues, and allowed me to have a direct contact with some workers and be part of a dynamic work team. For these reasons, my internship report is not merely descriptive of activities. It consists of an analysis of rules (legislation) and a regulatory framework of activities and it is also a description of several specific situations solved or in a solution process. Through this work I intend to make known the particular reality of a modern Portuguese financial institution not only because of its importance in our country but also such a large number of employees work here (in Portugal and abroad). I should add that throughout my internship I was allowed to attend conferences, within the scope of the bank in order to get a broader view of some issues related to the daily life of the DPE and the CGD. So, I participated in I Jornadas Bancárias and the Conferência Internacional do Contrato a Termo, given that the CGD is a bank and the DPE deals with legal and labour relations.

Determinação e comparação de genótipo de Candida albicans pelo Método de PCR com base nos polimorfismos da região 255rDNA e das sequências ALT/RPS

As leveduras da espécie Candida albicans são comensais do ser humano, podendo em certos casos, como a toma prolongada de antibióticos de largo espectro, a diminuição da imunidade, ou a quimioterapia, causar infecções severas. Estas infecções classificam-se em superficiais ou sistémicas, consoante a zona anatómica ou os órgãos afectados. As infecções hospitalares por fungos, nomeadamente as causadas por C. albicans, têm vindo a aumentar nos últimos anos, assim como a mortalidade e a morbilidade associadas, e ainda os custos relacionados com os cuidados de saúde. Torna-se por isso importante a implementação de terapêutica de uma forma rápida, eficaz e correcta. Assim, é imperativo que os laboratórios de microbiologia clínica possuam métodos de diagnóstico rápidos, simples e económicos em relação a uma correcta identificação ao nível de espécie e em relação ao estudo da sensibilidade aos antifúngicos. Contudo, esta identificação ao nível de espécie não permite averiguar a origem das infecções, facto importante para a compreensão da evolução das infecções nosocomiais. Para tal, é necessário realizar um estudo ao nível de estirpe através de métodos moleculares que permitam fazer a distinção acurada entre isolados de C. albicans. Os métodos moleculares têm vindo a desenvolver um papel importante no diagnóstico de infecções: são rápidos, sensíveis, precisos e possuem a vantagem de se poder trabalhar pequenas quantidades de amostra. Têm no entanto a desvantagem de ser métodos caros, por vezes demasiado elaborados para serem instituídos num laboratório de microbiologia clínica com grande volume de amostras diárias. O principal objectivo deste trabalho consistiu na diferenciação de estirpes de C. albicans através de uma metodologia molecular inovadora, nunca antes efectuada no ocidente, simples e rápida, por meio de simples amplificações por PCR. Para tal, foram seleccionados 60 isolados clínicos de leveduras obtidas a partir de amostras clínicas de três localidades: Covilhã (Centro Hospitalar Cova de Beira, E.P.E) Lisboa (Instituto Português de Oncologia e Hospital de Santa Maria, E.P.E) e Viseu (Hospital de São Teotónio). O trabalho baseou-se na genotipagem de isolados clínicos de C. albicans por amplificação por PCR com primers dirigidos às sequências 25S rDNA e às regiões ALT das sequências RPS. Foi possível a sua diferenciação e distinção em estirpes, fazendo deste método um bom recurso para estudos epidemiológicos. Realizou-se ainda um estudo de sensibilidade in vitro das estirpes de C. albicans ao antifúngicos Fluconazol e Voriconazol pelo método de difusão em disco, segundo os procedimentos padronizados e publicados pelo CLSI. Através deste estudo foi verificada elevada susceptibilidade aos antifúngicos estudados. Com este trabalho conclui-se que a diferenciação ao nível de estirpe é muito importante para compreender padrões de surtos de infecções e ainda para averiguar a origem, endógena ou exógena, destas infecções nosocomiais. Como tal, este estudo epidemiológico torna-se essencial para definir um controlo mais rigoroso das infecções.

Implementação de método em HPLC para a determinação de PAH´s em óleos vegetais

Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA’s), doravante designados PAH’s são considerados poluentes prioritários, devido às suas características tóxicas, cancerígenas e mutagénicas. No entanto, apenas 16 destes compostos são referidos na lista de compostos orgânicos prioritários, na qual estão inseridos os 4 PAH’s estudados neste trabalho - Benzo[a]antraceno, Benzo[a]Pireno, Benzo[b]fluoranteno e o criseno. A origem dos PAH’s no ambiente provém de fontes naturais e antropogénicas. Vários processos têm sido desenvolvidos para remover e/ou reduzir estes contaminantes no ambiente. A sua maioria passa por reduzir a poluição causada por fontes antropogénicas. No entanto, devido à dificuldade de remover totalmente estes contaminantes é necessário controlar a concentração destes compostos durante o processo de fabrico de alimentos. Os PAH’s podem ser encontrados em diferentes géneros alimentícios tais como óleos vegetais. Sendo a Sovena produtora destes surge como objectivo deste trabalho implementar e validar um método analítico para a quantificação dos 4 PAH’s nos óleos crus e refinados de forma a garantir que o contaminante é eliminado ou reduzido até níveis aceitáveis. Esta quantificação foi feita em HPLC com detector de fluorescência (FLD), utilizando-se o método da adição de padrão interno, neste caso o Benzo[b]Criseno. Para avaliar a linearidade do método procedeu-se à representação gráfica da função Área=f (concentração), obtendo – se uma função linear na gama de 1 a 50μg/kg. A média da precisão medida através do coeficiente de variação variou entre 1,63 e 7,49%, a exactidão obtida pela média da percentagem de recuperação variou entre 65,0 e 107,5% sem matriz e entre 59,2 e 87,8% com matriz (óleo alimentar). O limite de detecção obtido foi de 0,5 μg/kg e o limite de quantificação 1 μg/kg. Através da comparação de resultados com laboratórios externos foi possível um constante desenvolvimento no sentido de melhorar os resultados.

Implementação e validação do método de deteção de alergénios em alimentos por PCR em tempo real no Laboratório SGS

As alergias alimentares são um grande problema de saúde pública a nível mundial, que ocorre em todas as faixas etárias, tendo maior incidência em crianças. Mediada pelo sistema imunitário, a alergia alimentar é uma reação adversa que ocorre devido à presença de alergénios alimentares, que são identificados erroneamente como sendo um perigo ao organismo. Como é uma patologia que não possui cura, a prevenção é a melhor forma de evitar que ocorram reações alérgicas em indivíduos sensíveis, sendo a rotulagem um componente indispensável para a identificação dos alergénios presentes nos alimentos. Dentro dos métodos utilizados para a deteção de alergénios está a Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em tempo real), que é capaz de identificar o gene que codifica a proteína alergénica. Este método possui elevada sensibilidade e especificidade, sendo atualmente utilizado na área alimentar para a deteção de organismos genéticamente modificados e alergénios. Devido a uma grande procura de clientes e consumidores, para identificação de alergénios em alimentos, o objetivo do presente trabalho foi implementar e validar, a partir de análises de sensibilidade, precisão e robustez, o método de PCR em tempo real. Dessa forma, foi testada a deteção qualitativa de oito alergénios em alimentos, sendo estes o aipo, amendoim, avelã, caju, noz, pistáchio, sésamo e soja, no Laboratório da SGS - Société Générale de Surveillance. Destes alergénios, foi possível a validação de sete, demonstrando que o método de PCR em tempo real, para os presentes alergénios, possui elevada precisão e sensibilidade nos resultados obtidos.