Determinação e comparação de genótipo de Candida albicans pelo Método de PCR com base nos polimorfismos da região 255rDNA e das sequências ALT/RPS

As leveduras da espécie Candida albicans são comensais do ser humano, podendo em certos casos, como a toma prolongada de antibióticos de largo espectro, a diminuição da imunidade, ou a quimioterapia, causar infecções severas. Estas infecções classificam-se em superficiais ou sistémicas, consoante a zona anatómica ou os órgãos afectados. As infecções hospitalares por fungos, nomeadamente as causadas por C. albicans, têm vindo a aumentar nos últimos anos, assim como a mortalidade e a morbilidade associadas, e ainda os custos relacionados com os cuidados de saúde. Torna-se por isso importante a implementação de terapêutica de uma forma rápida, eficaz e correcta. Assim, é imperativo que os laboratórios de microbiologia clínica possuam métodos de diagnóstico rápidos, simples e económicos em relação a uma correcta identificação ao nível de espécie e em relação ao estudo da sensibilidade aos antifúngicos. Contudo, esta identificação ao nível de espécie não permite averiguar a origem das infecções, facto importante para a compreensão da evolução das infecções nosocomiais. Para tal, é necessário realizar um estudo ao nível de estirpe através de métodos moleculares que permitam fazer a distinção acurada entre isolados de C. albicans. Os métodos moleculares têm vindo a desenvolver um papel importante no diagnóstico de infecções: são rápidos, sensíveis, precisos e possuem a vantagem de se poder trabalhar pequenas quantidades de amostra. Têm no entanto a desvantagem de ser métodos caros, por vezes demasiado elaborados para serem instituídos num laboratório de microbiologia clínica com grande volume de amostras diárias. O principal objectivo deste trabalho consistiu na diferenciação de estirpes de C. albicans através de uma metodologia molecular inovadora, nunca antes efectuada no ocidente, simples e rápida, por meio de simples amplificações por PCR. Para tal, foram seleccionados 60 isolados clínicos de leveduras obtidas a partir de amostras clínicas de três localidades: Covilhã (Centro Hospitalar Cova de Beira, E.P.E) Lisboa (Instituto Português de Oncologia e Hospital de Santa Maria, E.P.E) e Viseu (Hospital de São Teotónio). O trabalho baseou-se na genotipagem de isolados clínicos de C. albicans por amplificação por PCR com primers dirigidos às sequências 25S rDNA e às regiões ALT das sequências RPS. Foi possível a sua diferenciação e distinção em estirpes, fazendo deste método um bom recurso para estudos epidemiológicos. Realizou-se ainda um estudo de sensibilidade in vitro das estirpes de C. albicans ao antifúngicos Fluconazol e Voriconazol pelo método de difusão em disco, segundo os procedimentos padronizados e publicados pelo CLSI. Através deste estudo foi verificada elevada susceptibilidade aos antifúngicos estudados. Com este trabalho conclui-se que a diferenciação ao nível de estirpe é muito importante para compreender padrões de surtos de infecções e ainda para averiguar a origem, endógena ou exógena, destas infecções nosocomiais. Como tal, este estudo epidemiológico torna-se essencial para definir um controlo mais rigoroso das infecções.

Implementação de método em HPLC para a determinação de PAH´s em óleos vegetais

Os Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA’s), doravante designados PAH’s são considerados poluentes prioritários, devido às suas características tóxicas, cancerígenas e mutagénicas. No entanto, apenas 16 destes compostos são referidos na lista de compostos orgânicos prioritários, na qual estão inseridos os 4 PAH’s estudados neste trabalho - Benzo[a]antraceno, Benzo[a]Pireno, Benzo[b]fluoranteno e o criseno. A origem dos PAH’s no ambiente provém de fontes naturais e antropogénicas. Vários processos têm sido desenvolvidos para remover e/ou reduzir estes contaminantes no ambiente. A sua maioria passa por reduzir a poluição causada por fontes antropogénicas. No entanto, devido à dificuldade de remover totalmente estes contaminantes é necessário controlar a concentração destes compostos durante o processo de fabrico de alimentos. Os PAH’s podem ser encontrados em diferentes géneros alimentícios tais como óleos vegetais. Sendo a Sovena produtora destes surge como objectivo deste trabalho implementar e validar um método analítico para a quantificação dos 4 PAH’s nos óleos crus e refinados de forma a garantir que o contaminante é eliminado ou reduzido até níveis aceitáveis. Esta quantificação foi feita em HPLC com detector de fluorescência (FLD), utilizando-se o método da adição de padrão interno, neste caso o Benzo[b]Criseno. Para avaliar a linearidade do método procedeu-se à representação gráfica da função Área=f (concentração), obtendo – se uma função linear na gama de 1 a 50μg/kg. A média da precisão medida através do coeficiente de variação variou entre 1,63 e 7,49%, a exactidão obtida pela média da percentagem de recuperação variou entre 65,0 e 107,5% sem matriz e entre 59,2 e 87,8% com matriz (óleo alimentar). O limite de detecção obtido foi de 0,5 μg/kg e o limite de quantificação 1 μg/kg. Através da comparação de resultados com laboratórios externos foi possível um constante desenvolvimento no sentido de melhorar os resultados.

Implementação e validação do método de deteção de alergénios em alimentos por PCR em tempo real no Laboratório SGS

As alergias alimentares são um grande problema de saúde pública a nível mundial, que ocorre em todas as faixas etárias, tendo maior incidência em crianças. Mediada pelo sistema imunitário, a alergia alimentar é uma reação adversa que ocorre devido à presença de alergénios alimentares, que são identificados erroneamente como sendo um perigo ao organismo. Como é uma patologia que não possui cura, a prevenção é a melhor forma de evitar que ocorram reações alérgicas em indivíduos sensíveis, sendo a rotulagem um componente indispensável para a identificação dos alergénios presentes nos alimentos. Dentro dos métodos utilizados para a deteção de alergénios está a Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (PCR em tempo real), que é capaz de identificar o gene que codifica a proteína alergénica. Este método possui elevada sensibilidade e especificidade, sendo atualmente utilizado na área alimentar para a deteção de organismos genéticamente modificados e alergénios. Devido a uma grande procura de clientes e consumidores, para identificação de alergénios em alimentos, o objetivo do presente trabalho foi implementar e validar, a partir de análises de sensibilidade, precisão e robustez, o método de PCR em tempo real. Dessa forma, foi testada a deteção qualitativa de oito alergénios em alimentos, sendo estes o aipo, amendoim, avelã, caju, noz, pistáchio, sésamo e soja, no Laboratório da SGS - Société Générale de Surveillance. Destes alergénios, foi possível a validação de sete, demonstrando que o método de PCR em tempo real, para os presentes alergénios, possui elevada precisão e sensibilidade nos resultados obtidos.

Modelo preditivo de insolvência no setor farmacêutico : aplicação à farmácia comunitária portuguesa

O setor farmacêutico apresenta um elevado grau de complexidade, dada a regulamentação a que está sujeito. Atualmente, um dos principais problemas deste setor prende-se com o acentuado aumento (142,6% entre dezembro de 2012 e julho de 2014) do número de farmácias insolventes, sendo impacto da crise económica e consequentes medidas regulamentares aplicadas com o Memorando de Entendimento da Troika. Dada a importância que as farmácias têm na dispensa do medicamento assim como o papel do farmacêutico no aconselhamento diário aos utentes, a redução do número de farmácias levanta problemas no acesso ao medicamento por parte da população. Assim, é necessário dotar as farmácias de ferramentas que lhes permitam gerir o seu negócio, criando bases sólidas de forma a terem uma maior capacidade de reagir em tempos de crise. Desta forma, o objetivo principal do trabalho é fornecer às farmácias uma dessas ferramentas, através da criação de um modelo preditivo de insolvência que permita estimar uma probabilidade de uma farmácia entrar em insolvência. Para o efeito, desenvolveu-se um modelo teórico, com base na revisão de literatura científica e na análise do setor farmacêutico em Portugal, que foi depois testado recorrendo a métodos de estimação com recurso ao modelo logit através do método da Máxima Verosimilhança. O modelo empírico foi estimado com dados de uma amostra de 97 farmácias, selecionadas a partir de uma base de dados da ANF. Esta amostra é composta por todas as farmácias insolventes e por uma seleção aleatória de farmácias solventes, para as quais foi possível utilizar informação proveniente do IES, mantendo a total confidencialidade, nomeadamente dados relativos às dimensões consideradas no modelo teórico: Autonomia Financeira, Endividamento, Gestão de Inventários, Gestão de Funcionários, Liquidez, Prazo Médio de Pagamentos do Estado, Prazo Médio Pagamentos a Fornecedores, Rendibilidade, Solvabilidade, Tesouraria, Dimensão e Localização. As dimensões referidas foram selecionadas após uma análise extensiva da bibliografia sobre esta temática. Estas dimensões foram incluídas na estimação através de variáveis proxy (com exceção da Tesouraria), para as quais foi também levada a cabo uma análise de sensibilidade. Depois de validados os pressupostos da estimação e de uma análise crítica sobre os resultados, foi possível selecionar um modelo em que mais de 90% das observações foram classificadas corretamente. O modelo preditivo selecionado inclui as variáveis proxy das dimensões: Autonomia Financeira, Prazo Médio Pagamentos a Fornecedores, Endividamento, Rendibilidade, Dimensão e Localização. Em testes posteriores, validou-se a capacidade preditiva do modelo com recurso a uma amostra de teste.