Aplicação clínica - avaliação da técnica acoustic radiation force impulse

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Classificação de tumores de cancro na mama através de radar de banda ultra-larga de microondas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Carta Económica Municipal. Comércio grossista e Indústria

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Planeamento e Ordenamento do Território

Implementação de técnicas avançadas de embalsamamento de cadáveres por perfusão vascular

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Exposição profissional ao chumbo : análise da indução de efeitos genotóxicos

RESUMO - A exposição contínua a substâncias químicas tem consequências para a saúde humana, algumas das quais não estão ainda totalmente estabelecidas. A toxicologia ocupacional é uma área interdisciplinar que envolve conhecimentos de higiene e de medicina ocupacional, de epidemiologia e de toxicologia e que tem por principal objectivo prevenir a ocorrência de efeitos adversos decorrentes do ambiente ocupacional sendo um dos seus principais papéis fornecer o máximo de dados que possam contribuir para o conhecimento dos potenciais efeitos na saúde. O chumbo é um tóxico de características cumulativas que provoca na saúde efeitos principalmente sistémicos, ou seja, o efeito tóxico manifesta-se em locais afastados do contacto inicial que resultam essencialmente de exposições crónicas, resultantes de períodos de exposição mais ou menos longos ao metal (entre meses e anos). Pode interagir com diferentes órgãos e tecidos, ligando-se a moléculas e constituintes celulares. Uma vez que não possui qualquer função fisiológica, a presença do chumbo no organismo humano resulta numa série de efeitos prejudiciais que afectam diversos órgãos e sistemas. A toxicidade do chumbo manifesta-se em diversos órgãos e tecidos, nomeadamente no sistema hematopoiético, no sistema nervoso, no rim, no aparelho reprodutor, no sistema cardiovascular, no sistema endócrino e no sistema imunitário. Da interferência do chumbo com o funcionamento de alguns sistemas biológicos resultam um conjunto de alterações fundamentais ao nível dos processos de transporte através das membranas, da integridade estrutural e funcional das enzimas e de várias vias metabólicas, em especial da fosforilação oxidativa e da síntese do heme sendo os primeiros efeitos bioquímicos do chumbo detectados a partir de valores de plumbémia inferiores a 10 μg/dL. As medidas de higiene e segurança actualmente em vigor nos países desenvolvidos asseguram que os casos de intoxicação grave são cada vez menos frequentes. No entanto, o risco de exposição a nível ocupacional existe em todas as actividades que envolvem materiais que o contenham como as explorações mineiras, as fundições primária e secundária, a produção de baterias de chumbo ácido, a produção de vidro com pigmentos de chumbo, as soldaduras de reparação automóvel e a instrução de tiro. Desde 2006 o chumbo é considerado pela International Agency for Research on Cancer (IARC) uma substância carcinogénica do grupo 2A (provável carcinogénio para o ser humano). Considera-se, assim, que o chumbo tem, inequivocamente, capacidade de induzir cancro em animais experimentais mas que, embora haja fortes indícios de que os mecanismos que medeiam a carcinogénese desses compostos ocorrem no ser humano, os dados disponíveis ainda não podem assegurar essa relação. Com este estudo pretendeu-se contribuir para o conhecimento da toxicidade do chumbo através do estudo da exposição ao chumbo e da influência da susceptibilidade individual (em industrias sem co-exposição significativa a outros agentes conhecidos ou suspeitos de serem carcinogénicos). Pretendeu-se estudar o caso através de uma abordagem múltipla que permitisse relacionar diferentes tipos de marcadores biológicos uma vez que a monitorização biológica integra todas as possíveis vias de entrada no organismo (para além da via respiratória), eventuais exposições fora do contexto estritamente profissional assim como uma série de factores intrínsecos individuais (relacionados com modos de via, de natureza fisiológica e comportamentais). Sendo a co-exposição a outros compostos com propriedades genotóxicas e carcinogénicas uma questão difícil de tornear quando se quer avaliar o potencial genotóxico do chumbo em populações expostas, ocupacional ou ambientalmente este estudo tem a vantagem de ter sido efectuado em populações sem co-exposição conhecida a outras substâncias deste tipo, permitindo concluir sobre os efeitos resultantes apenas da exposição a chumbo na população humana, contribuindo para explicar algumas das aparentes inconsistências e contradições entre diferentes estudos sobre este tema. Os indicadores de exposição usados foram: indicadores de dose interna (doseamento de chumbo e de PPZ no sangue), indicadores de efeitos adversos no heme e genotóxicos (actividade da ALAD, teste do cometa e mutação em TCR) e indicadores de susceptibilidade (polimorfismos genéticos de ALAD e VDR) através de uma abordagem estatística de comparação directa de sub-grupos previamente definidos na população e da aplicação de um modelo de regressão múltipla. Este estudo revelou que os níveis de plumbémia na população portuguesa baixaram significativamente nos últimos 10 anos, tanto na população ocupacionalmente exposta como na população em geral e que a presença do genótipo B-B (do gene VDR) é preditiva das variações de plumbémia, quando comparada com o genótipo mais frequente na população, B-b; ao contrário, o genótipo b-b não aparenta ter influência em nenhum dos marcadores estudados. No que diz respeito a efeitos genotóxicos concluiu-se que estes não se manifestaram na população estudada, levando a concluir que nos níveis de exposição estudados, o chumbo não tem capacidade de induzir este tipo de efeitos per si levando ao reforço da hipótese, já levantada por outros autores, de que o mecanismo de genotoxicidade do chumbo seja essencialmente de promoção de processos de genotoxicidade desencadeados por outros agentes. A realização de estudos de efeitos genotóxicos e de stress oxidativo desenhados de forma a comparar grupos de trabalhadores expostos apenas a chumbo com grupos de trabalhadores com o mesmo nível de exposição a chumbo, mas com co-exposição a outros agentes reconhecidamente carcinogénicos poderá ajudar a aumentar o conhecimento deste efeito do chumbo na saúde humana.

Prevalência de Anticorpos anti-Toxoplasma gondii em Grávidas da Região de Lisboa e Vale do Tejo e Estudo dos Factores de Risco

A toxoplasmose é uma antropozoonose de distribuição mundial que afecta quase um terço da população humana, bem como os animais e é causada por um protozoário intracelular obrigatório, Toxoplasma gondii. A prevalência desta parasitose na população humana varia com os hábitos alimentares, nível sócio-económico e com o clima. A transmissão ao homem está associada à ingestão de oocistos infecciosos (esporulados) provenientes das fezes dos gatos, a partir da água, de alimentos e do solo contaminados, ingestão de quistos na carne crua ou mal cozida, via congénita ou transfusional e por transplante de órgãos e/ou de tecidos de dadores infectados com o parasita e, mais raramente, através do leite não pasteurizado. A transmissão materno-fetal do parasita só ocorre quando a infecção é adquirida pela primeira vez na gravidez, podendo provocar sequelas graves para o feto, nomeadamente, atraso mental e morte fetal. O objectivo deste trabalho foi determinar a prevalência e os factores de risco associados à infecção por T. gondii em grávidas seguidas no Hospital Garcia de Orta. Este estudo teve a duração de 8 meses (Abril de 2010 a Janeiro de 2011) e foram contactadas 163 grávidas, das quais 140 (85,89 %) responderam ao questionário, tendo sido possível recolher soros de 155 (96,88%) grávidas. Os soros recolhidos foram testados para os anticorpos IgG anti-T. gondii pelo kit comercial Toxo-Screen Da e para os anticorpos IgM anti-T. gondii pelo kit comercial Toxo-ISAGA, ambos da bioMérieux®. Nas amostras seropositivas para o anticorpo IgM anti-T. gondii realizou-se a avidez dos anticorpos IgG anti-T. gondii através do kit NovaLisa - Toxoplasma gondii IgG Avidity Test da Novatec™. Foi efectuada a análise descritiva dos dados, centrada essencialmente em frequências absolutas para cada variável. Para testar a associação entre as variáveis utilizou-se o teste Qui-Quadrado de Pearson ou o teste exacto de Fisher (IC 95%, p≤0,05). A prevalência da toxoplasmose nas grávidas, neste estudo, foi de 21,94% (34), dos quais 50% (17) correspondem a grávidas seropositivas só para os anticorpos IgG (imunidade) e os outros 50% (17) correspondem a grávidas seropositivas para os anticorpos IgG/IgM. Neste último grupo, realizou-se a avidez e verificou-se que todas as grávidas eram portadoras de uma infecção antiga. Também, constatou-se que 78,06% das grávidas eram susceptíveis para a toxoplasmose, com risco de adquirirem a doença durante a gravidez. Na análise estatística entre os factores de risco e a infecção por T. gondii nas grávidas verificámos uma associação significativa (p<0,05) entre o número de partos, o conhecimento da toxoplasmose, o contacto com gatos de familiares/amigos e o consumo de carne proveniente da caça (pássaros, coelhos, javalis etc.). Estes factores parecem ser de grande importância na aquisição da infecção por T. gondii nas grávidas, deste estudo, dentre os vários factores investigados. vii Este trabalho pode constituir um alerta para que os profissionais de saúde insistam na prevenção primária, fornecendo informação (escrita e oral) sobre como evitar a infecção por T. gondii durante a gravidez e efectuar uma vigilância serológica, apenas quando esta se torna necessária, ou seja, nas grávidas não imunes à toxoplasmose.

Estudo de mutações germinais em genes de suscetibilidade para o cancro do colón e reto familiar do tipo X

O cancro do cólon e reto familiar do tipo X (FCCTX) é um síndrome que define as famílias que preenchem os critérios de Amesterdão, mas cujos tumores não apresentam instabilidade de microssatélites e também nas quais não é identificada mutação germinal nos genes de reparação de erros de DNA do tipo mismatch (MMR). A sua causa molecular permanece desconhecida. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o envolvimento de genes localizados numa região de suscetibilidade previamente identificada para o FCCTX (13q32-33), assim como de mutações identificadas previamente numa família FCCTX, através da análise do exoma por sequenciação de nova geração (NGS). Pretendeuse ainda melhorar a caracterização molecular de tumores FCCTX. Foi efetuada análise de mutações germinais nos genes KDELC1 e ERCC5 em 15 indivíduos índex de famílias FCCTX e 2 familiares de uma dessas famílias. No caso do gene TPP2, foi avaliado o envolvimento de um transcrito expresso alternativamente, previamente identificado, através de análise mutacional e da quantificação da expressão diferencial dos transcritos por real-time PCR. Foi ainda efetuada a análise de segregação com a doença na família, de 5 mutações em genes distintos, selecionadas a partir dos resultados da análise do exoma. Foi efetuada a análise de alterações de copy-number e de metilação nos genes MMR, MGMT e APC em 22 tumores FCCTX por MS-MLPA. Não foram identificadas mutações potencialmente patogénicas nos genes KDELC1 e ERCC5. No entanto, foram identificadas 2 mutações, uma no ERCC5 (c.2636 A>G) e outra no KDELC1 (c.455A>T) em relação às quais não se pode excluir a sua patogenicidade. Não foi detetada qualquer mutação no TPP2 associada à expressão diferencial dos transcritos, no entanto verificou-se que a expressão difere entre tecidos (sangue e cólon). A análise de segregação das mutações selecionadas a partir da análise do exoma, revelou que apenas para um dos genes a alteração poderá ser patogénica. Foram identificados ganhos frequentes, assim como metilação, nos genes MMR e MGMT, nos tumores FCCTX, sendo significativamente mais frequentes num subgrupo destes tumores que apresenta perdas em genes supressores de tumor (TSG+), em relação ao grupo que não apresenta estas alterações. A metilação no APC também apresentou padrões distintos entre os dois subgrupos de tumores FCCTX. Em conclusão, as variantes observadas nos genes KDELC1, ERCC5 e TPP2, assim como a alteração identificada no âmbito da análise do exoma não devem ser excluídas, podendo ser possível a sua contribuição para a suscetibilidade para o FCCTX. O padrão de alterações de copy-number e de metilação nos tumores FCCTX reforça a existência de pelo menos duas entidades moleculares distintas no FCCTX e sugere mecanismos de tumorigénese específicos para a iniciação tumoral neste síndrome.

Impact of using different radiation therapy techniques in breat cancer: contralateral breast dose

RESUMO: O cancro de mama e o mais frequente diagnoticado a indiv duos do sexo feminino. O conhecimento cientifico e a tecnologia tem permitido a cria ção de muitas e diferentes estrat egias para tratar esta patologia. A Radioterapia (RT) est a entre as diretrizes atuais para a maioria dos tratamentos de cancro de mama. No entanto, a radia ção e como uma arma de dois canos: apesar de tratar, pode ser indutora de neoplasias secund arias. A mama contralateral (CLB) e um orgão susceptivel de absorver doses com o tratamento da outra mama, potenciando o risco de desenvolver um tumor secund ario. Nos departamentos de radioterapia tem sido implementadas novas tecnicas relacionadas com a radia ção, com complexas estrat egias de administra ção da dose e resultados promissores. No entanto, algumas questões precisam de ser devidamente colocadas, tais como: E seguro avançar para tecnicas complexas para obter melhores indices de conformidade nos volumes alvo, em radioterapia de mama? O que acontece aos volumes alvo e aos tecidos saudaveis adjacentes? Quão exata e a administração de dose? Quais são as limitações e vantagens das técnicas e algoritmos atualmente usados? A resposta a estas questões e conseguida recorrendo a m etodos de Monte Carlo para modelar com precisão os diferentes componentes do equipamento produtor de radia ção(alvos, ltros, colimadores, etc), a m de obter uma descri cão apropriada dos campos de radia cão usados, bem como uma representa ção geometrica detalhada e a composição dos materiais que constituem os orgãos e os tecidos envolvidos. Este trabalho visa investigar o impacto de tratar cancro de mama esquerda usando diferentes tecnicas de radioterapia f-IMRT (intensidade modulada por planeamento direto), IMRT por planeamento inverso (IMRT2, usando 2 feixes; IMRT5, com 5 feixes) e DCART (arco conformacional dinamico) e os seus impactos em irradia ção da mama e na irradia ção indesejada dos tecidos saud aveis adjacentes. Dois algoritmos do sistema de planeamento iPlan da BrainLAB foram usados: Pencil Beam Convolution (PBC) e Monte Carlo comercial iMC. Foi ainda usado um modelo de Monte Carlo criado para o acelerador usado (Trilogy da VARIAN Medical Systems), no c odigo EGSnrc MC, para determinar as doses depositadas na mama contralateral. Para atingir este objetivo foi necess ario modelar o novo colimador multi-laminas High- De nition que nunca antes havia sido simulado. O modelo desenvolvido est a agora disponí vel no pacote do c odigo EGSnrc MC do National Research Council Canada (NRC). O acelerador simulado foi validado com medidas realizadas em agua e posteriormente com c alculos realizados no sistema de planeamento (TPS).As distribui ções de dose no volume alvo (PTV) e a dose nos orgãos de risco (OAR) foram comparadas atrav es da an alise de histogramas de dose-volume; an alise estati stica complementar foi realizadas usando o software IBM SPSS v20. Para o algoritmo PBC, todas as tecnicas proporcionaram uma cobertura adequada do PTV. No entanto, foram encontradas diferen cas estatisticamente significativas entre as t ecnicas, no PTV, nos OAR e ainda no padrão da distribui ção de dose pelos tecidos sãos. IMRT5 e DCART contribuem para maior dispersão de doses baixas pelos tecidos normais, mama direita, pulmão direito, cora cão e at e pelo pulmão esquerdo, quando comparados com as tecnicas tangenciais (f-IMRT e IMRT2). No entanto, os planos de IMRT5 melhoram a distribuição de dose no PTV apresentando melhor conformidade e homogeneidade no volume alvo e percentagens de dose mais baixas nos orgãos do mesmo lado. A t ecnica de DCART não apresenta vantagens comparativamente com as restantes t ecnicas investigadas. Foram tamb em identi cadas diferen cas entre os algoritmos de c alculos: em geral, o PBC estimou doses mais elevadas para o PTV, pulmão esquerdo e cora ção, do que os algoritmos de MC. Os algoritmos de MC, entre si, apresentaram resultados semelhantes (com dferen cas at e 2%). Considera-se que o PBC não e preciso na determina ção de dose em meios homog eneos e na região de build-up. Nesse sentido, atualmente na cl nica, a equipa da F sica realiza medi ções para adquirir dados para outro algoritmo de c alculo. Apesar de melhor homogeneidade e conformidade no PTV considera-se que h a um aumento de risco de cancro na mama contralateral quando se utilizam t ecnicas não-tangenciais. Os resultados globais dos estudos apresentados confirmam o excelente poder de previsão com precisão na determinação e c alculo das distribui ções de dose nos orgãos e tecidos das tecnicas de simulação de Monte Carlo usados.---------ABSTRACT:Breast cancer is the most frequent in women. Scienti c knowledge and technology have created many and di erent strategies to treat this pathology. Radiotherapy (RT) is in the actual standard guidelines for most of breast cancer treatments. However, radiation is a two-sword weapon: although it may heal cancer, it may also induce secondary cancer. The contralateral breast (CLB) is a susceptible organ to absorb doses with the treatment of the other breast, being at signi cant risk to develop a secondary tumor. New radiation related techniques, with more complex delivery strategies and promising results are being implemented and used in radiotherapy departments. However some questions have to be properly addressed, such as: Is it safe to move to complex techniques to achieve better conformation in the target volumes, in breast radiotherapy? What happens to the target volumes and surrounding healthy tissues? How accurate is dose delivery? What are the shortcomings and limitations of currently used treatment planning systems (TPS)? The answers to these questions largely rely in the use of Monte Carlo (MC) simulations using state-of-the-art computer programs to accurately model the di erent components of the equipment (target, lters, collimators, etc.) and obtain an adequate description of the radiation elds used, as well as the detailed geometric representation and material composition of organs and tissues. This work aims at investigating the impact of treating left breast cancer using di erent radiation therapy (RT) techniques f-IMRT (forwardly-planned intensity-modulated), inversely-planned IMRT (IMRT2, using 2 beams; IMRT5, using 5 beams) and dynamic conformal arc (DCART) RT and their e ects on the whole-breast irradiation and in the undesirable irradiation of the surrounding healthy tissues. Two algorithms of iPlan BrainLAB TPS were used: Pencil Beam Convolution (PBC)and commercial Monte Carlo (iMC). Furthermore, an accurate Monte Carlo (MC) model of the linear accelerator used (a Trilogy R VARIANR) was done with the EGSnrc MC code, to accurately determine the doses that reach the CLB. For this purpose it was necessary to model the new High De nition multileaf collimator that had never before been simulated. The model developed was then included on the EGSnrc MC package of National Research Council Canada (NRC). The linac was benchmarked with water measurements and later on validated against the TPS calculations. The dose distributions in the planning target volume (PTV) and the dose to the organs at risk (OAR) were compared analyzing dose-volume histograms; further statistical analysis was performed using IBM SPSS v20 software. For PBC, all the techniques provided adequate coverage of the PTV. However, statistically significant dose di erences were observed between the techniques, in the PTV, OAR and also in the pattern of dose distribution spreading into normal tissues. IMRT5 and DCART spread low doses into greater volumes of normal tissue, right breast, right lung, heart and even the left lung than tangential techniques (f-IMRT and IMRT2). However,IMRT5 plans improved distributions for the PTV, exhibiting better conformity and homogeneity in target and reduced high dose percentages in ipsilateral OAR. DCART did not present advantages over any of the techniques investigated. Di erences were also found comparing the calculation algorithms: PBC estimated higher doses for the PTV, ipsilateral lung and heart than the MC algorithms predicted. The MC algorithms presented similar results (within 2% di erences). The PBC algorithm was considered not accurate in determining the dose in heterogeneous media and in build-up regions. Therefore, a major e ort is being done at the clinic to acquire data to move from PBC to another calculation algorithm. Despite better PTV homogeneity and conformity there is an increased risk of CLB cancer development, when using non-tangential techniques. The overall results of the studies performed con rm the outstanding predictive power and accuracy in the assessment and calculation of dose distributions in organs and tissues rendered possible by the utilization and implementation of MC simulation techniques in RT TPS.

Transcriptional regulation of the mannosyltransferase-encoding gene pigm in inherited glycosylphosphatidylinositol (GPI) deficiency

RESUMO:O glicosilfosfatidilinositol (GPI) é um complexo glicolipídico utlizado por dezenas de proteínas, o qual medeia a sua ancoragem à superfície da célula. Proteínas de superfície celular ancoradas a GPI apresentam várias funções essenciais para a manutenção celular. A deficiência na síntese de GPI é o que caracteriza principalmente a deficiência hereditária em GPI, um grupo de doenças autossómicas raras que resultam de mutações nos genes PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO e PIGT, os quais sao indispensáveis para a biossíntese do GPI. Uma mutação pontual no motivo rico em GC -270 no promotor de PIGM impede a ligação do factor de transcrição (FT) Sp1 à sua sequência de reconhecimento, impondo a compactação da cromatina, associada à hipoacetilação de histonas, e consequentemente, impedindo a transcrição de PIGM. Desta forma, a adição da primeira manose ao GPI é comprometida, a síntese de GPI diminui assim como as proteínas ligadas a GPI à superficie das células. Pacientes com Deficiência Hereditária em GPI-associada a PIGM apresentam trombose e epilesia, e ausência de hemólise intravascular e anemia, sendo que estas duas últimas características definem a Hemoglobinúria Paroxística Nocturna (HPN), uma doença rara causada por mutações no gene PIGA. Embora a mutação que causa IGD seja constitutiva e esteja presente em todos os tecidos, o grau de deficiência em GPI varia entre células do mesmo tecido e entre células de tecidos diferentes. Por exemplo nos granulócitos e linfócitos B a deficiência em GPI é muito acentuada mas nos linfócitos T, fibroblastos, plaquetas e eritrócitos é aproximadamente normal, daí a ausência de hemólise intravascular. Os eventos transcricionais que estão na base da expressão diferencial da âncora GPI nas células hematopoiéticas são desconhecidos e constituem o objectivo geral desta tese. Em primeiro lugar, os resultados demonstraram que os níveis de PIGM mRNA variam entre células primárias hematopoiéticas normais. Adicionalmente, a configuração dos nucleossomas no promotor de PIGM é mais compacta em células B do que em células eritróides e tal está correlacionado com os níveis de expressão de PIGM, isto é, inferior nas células B. A presença de vários motivos de ligação para o FT específico da linhagem megacariocítica-eritróide GATA-1 no promotor de PIGM sugeriu que GATA-1 desempenha um papel regulador na sua transcrição. Os resultados mostraram que muito possivelmente GATA-1 desempenha um papel repressor em vez de activador da expressão de PIGM. Resultados preliminares sugerem que KLF1, um factor de transcrição restritamente eritróide, regula a transcrição de PIGM independentemente do motivo -270GC. Em segundo lugar, a investigação do papel dos FTs Sp demonstrou que Sp1 medeia directamente a transcrição de PIGM em ambas as células B e eritróide. Curiosamente, ao contrário do que acontece nas células B, em que a transcrição de PIGM requer a ligação do FT geral Sp1 ao motivo -270GC, nas células eritróides Sp1 regula a transcrição de PIGM ao ligar-se a montante e não ao motivo -270GC. Para além disso, demonstrou-se que Sp2 não é um regulador directo da transcrição de PIGM quer nas células B quer nas células eritróides. Estes resultados explicam a ausência de hemólise intravascular nos doentes com IGD associada a PIGM, uma das principais características que define a HPN. Por último, resultados preliminares mostraram que a repressão da transcrição de PIGM devida à mutação patogénica -270C>G está associada com a diminuição da frequência de interacções genómicas em cis entre PIGM e os seus genes “vizinhos”, sugerindo adicionalmente que a regulação de PIGM e desses genes é partilhada. No seu conjunto, os resultados apresentados nesta tese contribuem para o conhecimento do controlo transcricional de um gene housekeeping, específico-detecido, por meio de FTs genéricos e específicos de linhagem.-------------ABSTRACTC: Glycosylphosphatidylinositol (GPI) is a complex glycolipid used by dozens of proteins for cell surface anchoring. GPI-anchored proteins have various functions that are essential for the cellular maintenance. Defective GPI biosynthesis is the hallmark of inherited GPI deficiency (IGD), a group of rare autosomal diseases caused by mutations in PIGA, PIGL, PIGM, PIGV, PIGN, PIGO and PIGT, all genes indispensable for GPI biosynthesis. A point mutation in the -270GC-rich box in the core promoter of PIGM disrupts binding of the transcription factor (TF) Sp1 to it, imposing nucleosome compaction associated with histone hypoacetylation, thus abrogating transcription of PIGM. As a consequence of PIGM transcriptional repression, addition of the first mannose residue onto the GPI core and thus GPI production are impaired; and expression of GPI-anchored proteins on the surface of cells is severely impaired. Patients with PIGM-associated IGD suffer from life-threatening thrombosis and epilepsy but not intravascular haemolysis and anaemia, two defining features of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH), a rare disease caused by somatic mutations in PIGA. Although the disease-causing mutation in IGD is constitutional and present in all tissues, the degree of GPI deficiency is variable and differs between cells of the same and of different tissues. Accordingly, GPI deficiency is severe in granulocytes and B cells but mild in T cells, fibroblasts, platelets and erythrocytes, hence the lack of intravascular haemolysis.The transcriptional events underlying differential expression of GPI in the haematopoietic cells of PIG-M-associated IGD are not known and constitute the general aim of this thesis. Firstly, I found that PIGM mRNA levels are variable amongst normal primary haematopoietic cells. In addition, the nucleosome configuration in the promoter of PIGM is more compacted in B cells than in erythroid cells and this correlated with the levels of PIGM mRNA expression, i.e., lower in B cells. The presence of several binding sites for GATA-1, a mega-erythroid lineage-specific transcription factor (TF), at the PIGM promoter suggested that GATA-1 has a role on PIGM transcription. My results showed that GATA-1 in erythroid cells is most likely a repressor rather than an activator of PIGM expression. Preliminary data suggested that KLF1, an erythroid-specific TF, regulates PIGM transcription but independently of the -270GC motif. Secondly, investigation of the role of the Sp TFs showed that Sp1 directly mediates PIGM transcriptional regulation in both B and erythroid cells. However, unlike in B cells in which active PIGM transcription requires binding of the generic TF Sp1 to the -270GC-rich box, in erythroid cells, Sp1 regulates PIGM transcription by binding upstream of but not to the -270GC-rich motif. Additionally, I showed that Sp2 is not a direct regulator of PIGM transcription in B and erythroid cells. These findings explain lack of intravascular haemolysis in PIGM-associated IGD, a defining feature of PNH. Lastly, preliminary work shows that transcriptional repression of PIG-M by the pathogenic -270C>G mutation is associated with reduced frequency of in cis genomic interactions between PIGM and its neighbouring genes, suggesting a shared regulatory link between these genes and PIGM. Altogether, the results presented in this thesis provide novel insights into tissuespecific transcriptional control of a housekeeping gene by lineage-specific and generic TFs.

Projecto de um bio-reactor para cultura celular em membranas tubulares

O Grupo de Engenharia de Tecidos da FCT/UNL desenvolve e produz membranas poliméricas tubulares biodegradáveis que servem de substrato a culturas celulares e que se destinam a substituir temporariamente vasos sanguíneos danificados. O objectivo desta dissertação foi o desenvolvimento de um bio-reactor com a capacidade de bombeamento controlado de um fluido adequado à manutenção de uma cultura celular, que simula a passagem do fluxo sanguíneo pelo interior das membranas tubulares, permitindo que as células nelas semeadas recebam os estímulos adequados ao seu desenvolvimento. Foi construído um bio-reactor de perfusão pulsátil para cultura celular em membranas tubulares que é instalável numa incubadora, beneficiando assim de condições ambientais — pH, temperatura e humidade — semelhantes às fisiológicas. O bio-reactor é capaz de gerar estímulos mecânicos pulsáteis favoráveis ao alinhamento de células endoteliais e de músculo liso. O sistema foi desenvolvido de modo a que a pressão e o caudal aplicados às membranas pudessem ser monitorizados e controlados. Foram semeadas células endoteliais em matrizes planas de policaprolactona, tendo-se confirmado a sua adesão e proliferação por microscopia de fluorescência. Após enrolamento, obtiveram-se duas membranas tubulares com células endoteliais semeadas no lúmen. Uma delas foi submetida a cultura estática, e outra a cultura dinâmica no bio-reactor. Após 10 dias de condicionamento in vitro, as membranas foram novamente observadas por microscopia de fluorescência. Os resultados obtidos não foram conclusivos, pelo que serão necessários novos estudos para concluir se o bio-reactor construído é capaz de garantir o condicionamento mecânico das células semeadas nas matrizes.

Novas suturas à base de nanofibras poliméricas

As suturas são dispositivos médicos utilizados na aproximação dos bordos de feridas cirúrgicas ou acidentais. O objectivo deste trabalho consistiu em produzir um fio de sutura com base num material polimérico biodegradável. Para a produção do fio utilizou-se a técnica de electrofiação que permite a obtenção de fibras de diâmetro sub-micrométrico a partir de soluções poliméricas. Os polímeros usados foram a policaprolactona (PCL) e o acetato de celulose (AcCel), polímero sintético e natural, respectivamente. Usaram-se como solventes o clorofórmio e a dimetilacetamida. Foram realizados ensaios mecânicos para caracterizar as propriedades mecânicas das fibras. As fibras compostas por PCL e AcCel apresentaram tensão máxima inferior e módulo de Young superior às fibras de PCL. Concluiu-se que a adição de acetato de celulose tornou as fibras menos elásticas, como era esperado. Quando submetidos a deformações cíclicas, ambos os tipos de fibras mostraram um comportamento idêntico ao apresentado por uma amostra do mesmo material numa única tracção. Para obter os fios, utilizaram-se dois instrumentos de corte. Depois de alongados obtiveram-se fios com calibres correspondentes a 5-0 e 4-0, segundo a classificação da Pharmacopeia dos Estados Unidos. De seguida foram feitos testes in vivo em dois ratos de laboratório, da estirpe Wistar. Durante o procedimento cirúrgico os fios mostraram ser de fácil manuseamento permitindo um bom atravessamento dos tecidos. Observou-se uma boa regeneração dos tecidos apresentando uma cicatrização limpa e com bom aspecto. Os fios de sutura desenvolvidos neste trabalho reúnem as vantagens das suturas mono-filamento e multi-filamento sem nenhuma das respectivas desvantagens.

Optimização das condições de moldação de materiais compósitos para construção de ferramenta de reparação de defeito em radome de aeronave

Com o objectivo de construir uma ferramenta de reparação de defeitos em radomes de aeronaves, torna-se necessário identificar quais os materiais e as técnicas apropriadas para esta tarefa, listando a tecnologia, o conhecimento e os recursos humanos existentes na empresa e no mercado, na tentativa de rentabilizar os custos de construção da ferramenta de reparação. Para os prepreg’s de fibra de carbono, a técnica aconselhada é a Moldação por Saco de Vácuo, enquanto que para os tecidos de fibra de vidro impregnados de resina, a Moldação por Infusão de Resina Assistida por Vácuo é a técnica aconselhada. Após a análise de resultados dos ensaios de Tracção e de Flexão, obtêm-se dados para calcular a espessura mínima aconselhada para as paredes da ferramenta de reparação, de modo a que não sofra qualquer distorção aquando da sua utilização nas reparações efectuadas em autoclave. Após se calcular qual a espessura mínima da parede da ferramenta, faz-se o cálculo e a análise de custos para ambas as soluções, de modo a perceber a viabilidade financeira de cada uma das técnicas, concluindo-se qual a solução mais facilmente rentabilizável.

Produção de matrizes porosas 3D baseadas em réplicas invertidas de cristais coloidais

A Engenharia de Tecidos surge da necessidade recorrente de regenerar ou recriar órgãos e tecidos danificados devido a vários tipos de trauma. A carência de funcionalidades resultante pode ser resolvida através da implantação de substitutos bio-sintéticos. O presente trabalho consiste na produção de matrizes porosas 3D baseadas em réplicas invertidas de cristais coloidais com futura aplicação em substituintes ósseos sintéticos para fraturas de não-união. O substituinte ósseo consiste numa estrutura denominada Inverse colloidal crystal (ICC), em que a sua organização singular resulta numa homogénea proliferação celular e num aumento das propriedades mecânicas, quando comparada com outros substituintes. O primeiro passo para a obtenção desta estrutura é a produção de microesferas de poliestireno, por uma técnica baseada em microfluídica. Posteriormente as microesferas são empacotadas resultando numa estrutura coesa com ligações entre microesferas vizinhas. O preenchimento dos espaços vazios entre microesferas pelo biomaterial pretendido e posterior remoção das microesferas dá origem à estrutura porosa do ICC. ICCs poliméricos (ϕCs = 1,00) e compósitos (ϕCs = 0,86 e ϕHA = 0,14; ϕCs = 0,67 e ϕHA = 0,33; ϕCs = ϕHA = 0,50) são produzidos e as suas propriedades mecânicas são testadas através de ensaios de compressão e comparadas com outros substituintes sintéticos. Para avaliação do comportamento dos materiais em contacto com meio biológico, foram realizados testes de citotoxicidade que revelaram uma viabilidade celular acima dos 80% em todos os ICCs.

O fenómeno da morte: leituras em torno de Heidegger

Esta dissertação propõe um estudo do significado da morte enquanto condição da existência humana, acompanhando, para este fim, a análise do fenómeno desenvolvida por Martin Heidegger em Ser e Tempo. Para tal, faz-se uma exposição das principais estruturas existenciais que constituem o ser do Dasein, entre elas o serno- mundo e a estrutura tripartida do cuidado. Mediante a constatação da essencial incompletude da investigação até então desenvolvida, propõe-se uma análise do fenómeno da morte enquanto chave para a consideração teórica do Dasein como um todo, bem como para o acesso ao conceito de autenticidade. Neste sentido, examinamse as instâncias de compreensão pré-ontológica do fenómeno da morte por parte do Dasein e analisa-se a disposição da ansiedade. Conclui-se que a ansiedade dá a ver ao Dasein a possibilidade de conduzir uma existência autêntica, que consiste na apropriação do seu ser através da antecipação da morte, mediante a qual lhe são reveladas quais as suas possibilidades mais próprias. Explicita-se de que modo uma concepção de temporalidade originária tem a sua origem na antecipação da morte, sublinhando o facto de esta temporalidade estar implícita nos elementos que constituem a estrutura do cuidado. Por último, atenta-se sobre os comentários tecidos por Emmanuel Levinas a propósito do pensamento de Heidegger, dando especial atenção à sua crítica da primazia da morte própria face à morte de outrem no seio da analítica existencial. Em contraste com esta concepção, apresenta-se a proposta ética de Levinas, pondo em evidência a análise distinta do fenómeno da morte que a ela subjaz.

The cellular basis of a congenital heart defect Drosophila

RESUMO: Mutações em genes envolvidos na formação do coração e anomalias em qualquer etapa deste processo causam frequentemente malformações cardíacas, que representam o tipo mais comum de defeitos em neonatais, afetando cerca de 1% dos nascimentos por ano. Assim, estima-se que 20 milhões de pessoas sejam portadoras de um defeito cardíaco congénito. O coração da Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta), denominado vaso dorsal, é um órgão relativamente simples que actua como uma bomba muscular, contraindo automaticamente para permitir a circulação da hemolinfa através do corpo. A formação do vaso dorsal na mosca é muito semelhante ao desenvolvimento do coração em vertebrados, representando por isso, um poderoso modelo para estudar a rede de genes e os padrões regulatórios relacionados com o desenvolvimento deste órgão. Anteriormente, nós identificámos um gene em Drosophila, darhgef10, fortemente expresso no coração em desenvolvimento e cuja deleção induz anormalidades cardíacas subtis mas prevalentes. Os mutantes para darhgef10 são viáveis e férteis no ambiente controlado de laboratório. Este trabalho teve como objectivos caracterizar fenotipicamente os mutantes nulos para darhgef10, determinar a localização subcelular da proteína dArhgef10 e investigar a base celular subjacente ao defeito no alinhamento dos cardioblastos observado nos mutantes. Os nossos resultados revelaram que a deleção de darhgef10 provoca uma severa redução da viabilidade, sem no entanto comprometer o tempo de desenvolvimento e a longevidade. Por outro lado, o aumento da expressão de darhgef10 em músculos, glândulas salivares e no disco imaginal do olho afeta drasticamente a integridade destes tecidos. A expressão ectópica de darhgef10 in vitro e in vivo revelou que a proteína está localiza no citoplasma com enriquecimento junto à membrana celular, com associação à actina F. Live imaging de embriões mutantes para darhgef10 revelou que os defeitos observados no coração podem estar associados a um defeito na adesão dos músculos alary e/ou das células pericardiais ao vaso dorsal. O homólogo humano de darhgef10, ARHGEF10, também é expresso no coração e está associação a uma maior susceptibilidade para a ocorrência de acidentes vasculares cerebrais aterotrombóticos, sugerindo que o que aprendemos sobre darhgef10 em Drosophila pode ter implicações do ponto de vista clínico para a saúde humana. ----------------------------- ABSTRACT: Mutations in genes controlling heart development and abnormalities in any of its steps frequently cause cardiac malformations, the most common type of birth defects in humans, affecting nearly 1% of births per year. Hence around 20 million adults are expected to live with a congenital heart defect. The Drosophila melanogaster heart, called dorsal vessel, is a relatively simple organ that acts as a muscular pump contracting automatically to allow the circulation of hemolymph. Drosophila heart formation shares many similarities with heart development in vertebrates providing a powerful system to study gene networks and regulatory pathways involved in heart development. We have previously identified a Drosophila gene, darhgef10, which is strongly expressed in the developing heart and when deleted, leads to flies with highly prevalent yet subtle heart abnormalities, compatible with unchallenged life in the laboratory. Our aims were to phenotypically characterize homozygous null darhgef10 mutants, characterize the subcellular localization of dArhgef10 and to study the cellular basis of the misaligned cardioblasts defect. We found that about half of darhgef10 mutants die during development. However, the survivors surprisingly have a nearly normal developmental time, adult locomotor behavior and total lifespan. Detection of transgene-derived dArhgef10 protein in vitro and in vivo using custom antibodies revealed a cytosolic protein slightly enriched in the cellular membranes and associated with F-actin. Tissue-specific darhgef10 expression disrupts the normal morphology of developing muscles, salivary glands and the eye. Live imaging of darhgef10 mutant embryos revealed that heart defect could be caused by a reduced capacity of attachment of pericardial cells and/or alary muscle to dorsal vessel. The human homolog of darhgef10 is also expressed in the heart and is a susceptibility gene for atherothrombotic stroke, suggesting that what we learn about the function of this gene and its phenotypes in Drosophila could have implications to human health.