Molecular determinants of nonaqueous biocatalysis

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biochemistry

Microbiology of membrane bioreactors for wastewater treatment: a molecular approach

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Engineering and Technology Sciences, Biotechnology.

Cell-to cell Communication in Pectobacterium wasabiae

Dissertation presented to obtain the PhD degree in Biology

Personal Learning Environments – Um Ecossistema de Aprendizagem em e-Learning

Esta investigação tem como tema de estudo os ambientes pessoais de aprendizagem que se podem desenvolver em e-learning. Estes ambientes com características singulares, face ao atual estado de desenvolvimento tecnológico e social, têm sido designados na doutrina científica pela expressão anglo-saxónica Personal Learning Environments, da qual derivam os acrónimos PLE ou PLEs. Este estudo tem, como objetivo, compreender o papel dos PLEs na aprendizagem dos alunos da parte letiva do Mestrado em Gestão de Sistemas de e-Learning, da Faculdade de Ciências Sociais e Humanas da Universidade Nova de Lisboa, nos biénios que decorreram de 2010-2011 a 2012-2013. Estes alunos, ao longo da sua aprendizagem, utilizaram várias ferramentas e/ou serviços associados com as TIC e Web 2.0. Esta utilização permitiu aos alunos criarem um ecossistema de aprendizagem próprio. A metodologia de investigação utilizada teve em consideração sobretudo aspetos qualitativos. A estratégia utilizada para a recolha de informações foi o inquérito por questionário. As informações recolhidas foram sujeitas a tratamento estatístico descritivo, e posterior triangulação dos resultados de algumas das variáveis.Dos resultados obtidos, é possível concluir que os alunos do Mestrado criaram os seus próprios PLEs e que estes facilitaram as suas aprendizagens. Que a sua utilização conferiu vantagens aos alunos. Que os PLEs foram fundamentais para poderem desenvolver atividades colaborativas, e que criaram um ecossistema próprio, uma rede de troca de conhecimentos.

2D position system for a mobile robot in unstructured environments

Nowadays, several sensors and mechanisms are available to estimate a mobile robot trajectory and location with respect to its surroundings. Usually absolute positioning mechanisms are the most accurate, but they also are the most expensive ones, and require pre installed equipment in the environment. Therefore, a system capable of measuring its motion and location within the environment (relative positioning) has been a research goal since the beginning of autonomous vehicles. With the increasing of the computational performance, computer vision has become faster and, therefore, became possible to incorporate it in a mobile robot. In visual odometry feature based approaches, the model estimation requires absence of feature association outliers for an accurate motion. Outliers rejection is a delicate process considering there is always a trade-off between speed and reliability of the system. This dissertation proposes an indoor 2D position system using Visual Odometry. The mobile robot has a camera pointed to the ceiling, for image analysis. As requirements, the ceiling and the oor (where the robot moves) must be planes. In the literature, RANSAC is a widely used method for outlier rejection. However, it might be slow in critical circumstances. Therefore, it is proposed a new algorithm that accelerates RANSAC, maintaining its reliability. The algorithm, called FMBF, consists on comparing image texture patterns between pictures, preserving the most similar ones. There are several types of comparisons, with different computational cost and reliability. FMBF manages those comparisons in order to optimize the trade-off between speed and reliability.

Molecular regulation of secondary gorwth: searching for SHORT-ROOT function in cork formation

The analysis of molecular regulators involved in controlling the maintenance and function of plant meristems has been the subject of many studies. Some master regulators of these processes have been identified in Arabidopsis benefiting from the array of tools available for genetic and molecular analysis in this model plant. However, aspects such as secondary growth that are more extensively observed in woody plants, have been less studied. Secondary growth is responsible for the enlargement of the plant stems and roots and results from the activity of the lateral (secondary) meristems, vascular cambium and cork cambium (phellogen), which produce two important renewable natural resources, wood and cork, respectively.(...)

Estudo molecular de estirpes de Aspergillus fumigatus isolados em aviários e em aves diagnosticadas com aspergilose. Possíveis implicações na Saúde Pública

Aspergillus fumigatus é um agente etiológico fúngico disperso mundialmente por variados nichos ecológicos e o fungo patogénico que mais promove doenças respiratórias em aves e pessoas imunocomprometidas. A exposição a conídios deste fungo pode causar aspergilose invasiva, a doença mais frequente em variadas espécies ornitológicas, com elevada mortalidade e morbidade. Além disso, esta doença é um dos fatores que mais contribui para significativas perdas económicas na indústria avícola, bem como perdas de biodiversidade, em espécies selvagens. Neste contexto, Aspergillus fumigatus, que pertence ao complexo Fumigati, desenvolve-se facilmente no trato respiratório de aves e humanos, no solo, nas camas e ninhos das aves. Tem uma fácil aerolização e contamina os alimentos nos ambientes avícolas e produz uma micotoxina, gliotoxina, que invade o trato respiratório e é considerada como fator de virulência. A identificação exacta dos isolados fúngicos provenientes de aves é muito importante, para percepção da sua epidemiologia em aves, para pesquisa de espécies crípticas de Aspergillus fumigatus, que podem desencadear as mesmas patologias mas apresentar diferentes resultados às mesmas terapêuticas antifúngicas. A análise molecular efectuada neste estudo permitiu atingir estes objectivos. Como tal, 108 isolados provenientes de diversificadas aves foram analisados por ferramentas moleculares para determinar a presença de espécies crípticas de Aspergillus fumigatus e observar os seus diferentes perfis de susceptibilidade antifúngica ao itraconazol. Não foram detectadas espécies crípticas, mas foi possível corrigir duas identificações morfológicas erradas ao nível do complexo. Apesar da emergência da resistência adquirida por Aspergillus fumigatus ao itraconazol, estar a emergir, não foram detectadas estirpes resistentes neste estudo. O conhecimento molecular deste agente etiológico responsável pela aspergilose invasiva em aves é importante para auxiliar a escolha de uma melhor terapêutica e futuros tratamentos para infeções oportunistas fúngicas, contribuindo assim para menos perdas na produção avícola e para uma melhoria da Saúde Pública.

Molecular simulation of gas adsorption equilibria in nanoporous materials

This work is divided into two distinct parts. The first part consists of the study of the metal organic framework UiO-66Zr, where the aim was to determine the force field that best describes the adsorption equilibrium properties of two different gases, methane and carbon dioxide. The other part of the work focuses on the study of the single wall carbon nanotube topology for ethane adsorption; the aim was to simplify as much as possible the solid-fluid force field model to increase the computational efficiency of the Monte Carlo simulations. The choice of both adsorbents relies on their potential use in adsorption processes, such as the capture and storage of carbon dioxide, natural gas storage, separation of components of biogas, and olefin/paraffin separations. The adsorption studies on the two porous materials were performed by molecular simulation using the grand canonical Monte Carlo (μ,V,T) method, over the temperature range of 298-343 K and pressure range 0.06-70 bar. The calibration curves of pressure and density as a function of chemical potential and temperature for the three adsorbates under study, were obtained Monte Carlo simulation in the canonical ensemble (N,V,T); polynomial fit and interpolation of the obtained data allowed to determine the pressure and gas density at any chemical potential. The adsorption equilibria of methane and carbon dioxide in UiO-66Zr were simulated and compared with the experimental data obtained by Jasmina H. Cavka et al. The results show that the best force field for both gases is a chargeless united-atom force field based on the TraPPE model. Using this validated force field it was possible to estimate the isosteric heats of adsorption and the Henry constants. In the Grand-Canonical Monte Carlo simulations of carbon nanotubes, we conclude that the fastest type of run is obtained with a force field that approximates the nanotube as a smooth cylinder; this approximation gives execution times that are 1.6 times faster than the typical atomistic runs.

Caracterização clínica e molecular da infecção por Giardia Duodenalis em crianças em idade pré-escolar da cidade de Lisboa

As parasitoses intestinais, quer provocadas por protozoários quer por helmintas, afectam humanos a nível ubiquitário, independentemente do sexo, estrato social ou faixa etária, constituindo um verdadeiro problema de Saúde Pública. Dentro dos protozoários, Giardia duodenalis destaca-se por ser um dos principais agentes responsáveis pela doença diarreica infecciosa, afectando milhões de indivíduos em todo o mundo. Apesar da sua maior incidência nos países em vias de desenvolvimento, esta parasitose é actualmente considerada como uma infecção reemergente nos países desenvolvidos, particularmente em crianças frequentadoras de creches e jardins-de-infância. O presente estudo foi desenvolvido com o objectivo de realizar a caracterização clínica e molecular da giardíase em crianças de idade pré-escolar da cidade de Lisboa. Decorreu de Abril a Julho de 2009 e teve como população alvo 685 crianças dos três aos seis anos de idade, frequentadoras de 10 jardins-de-infância da rede de escolas públicas da capital. Participaram voluntariamente, com resposta aos inquéritos protocolares, preenchimento de consentimento informado e fornecimento de amostras biológicas de fezes, 317 crianças. Em oito delas, correspondendo a uma prevalência de 2,5%, e num familiar (irmão) foi identificada infecção por Giardia duodenalis. Salienta-se que este foi o único parasita com potencial patogénico identificado nas amostras de fezes recolhidas. Através de técnicas de genotipagem constatou-se que cinco dos isolados pertenciam ao genótipo A, três ao B e numa amostra não foi possível identificar o genótipo. Dentro da mesma escola as crianças infectadas apresentaram o mesmo genótipo de Giardia. O espectro de manifestações clínicas variou entre flatulência, diarreia aguda, anorexia, dor abdominal recorrente e distensão abdominal, não se conseguindo correlacionar com a variabilidade genética da Giardia duodenalis encontrada. Uma das tinha má progressão ponderal. Todas as crianças infectadas foram tratadas com metronidazol, sem efeitos adversos conhecidos, e o controlo, efectuado duas semanas depois, foi negativo. Em todas as escolas foram realizadas acções de formação de Educação para a Saúde para as crianças, pais, educadores e funcionários das escolas incluídas no estudo, sobre a temática em estudo. Caracterização clínica e molecular da infecção por Giardia duodenalis em crianças em idade pré-escolar da cidade de Lisboa Este estudo contribuiu para um melhor conhecimento epidemiológico da giardíase em Portugal.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais do complexo de espécies de Cryptococcus neoformans através do gene da fosfolipase B (PLB1) e avaliação da susceptibilidade antifúngica

Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada, presente em animais e humanos, que infecta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. A criptococose é uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, sendo a meningoencefalite o sinal mais frequente da doença. Duas espécies estão incluídas no complexo de Cryptococcus neoformans: C. gattii (serotipos B e C) e C. neoformans. Por sua vez, C. neoformans é dividido em duas grandes variedades - var. grubii (serotipo A) e var. neoformans (serotipo D) –, além de incluir estirpes híbridas (serotipo AD). A técnica de RFLP tem sido usada para identificar facilmente os tipos moleculares dos isolados em estudos epidemiológicos. Oito tipos foram descritos: VNI, VNII (ambos correspondentes a estirpes C. neoformans var. grubii), VNIII (estirpes híbridas AD), VNIV (C. neoformans var. neoformans), e VGI-IV (correspondentes a C. gattii). Este trabalho teve como objectivo, caracterizar geneticamente uma colecção de isolados clínicos e ambientais, portugueses e estrangeiros, e avaliar a sua resistência a duas drogas antifúngicas, permitindo comparar os padrões epidemiológicos do complexo de espécies com os encontrados noutras regiões do mundo. A colecção possui 337 isolados de C. neoformans, provenientes de diversos hospitais e regiões, previamente identificados por métodos convencionais de diagnóstico. A determinação dos tipos moleculares foi realizada através do método de RFLP no gene PLB1. Dos 267 isolados analisados, o tipo mais abundante foi VN I (61,42%), seguido por VN III (24,34%). Menos abundantes foram VN IV (10,11%) e VN II (3%), enquanto que VG I foi raro (1,12%). Os restantes tipos moleculares de C. gattii não foram encontrados. Usando o método de difusão em disco, 98 destes isolados foram analisados quanto à susceptibilidade antifúngica. Foi registada resistência ao voriconazol em apenas 3,1% dos isolados testados. Foi encontrada resistência ao fluconazol num elevado número de isolados (32,7%) e susceptibilidade dependendo da dose em 15,3%. Este trabalho, também teve o intuito de correlacionar os resultados anteriores com o tipo molecular. Todavia não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre qualquer dos tipos moleculares e as CMIs correspondentes ao fluconazol. Porém, os resultados mostram que alguns tipos moleculares são menos susceptíveis do que outros em relação ao voriconazol: VN I e VN IV são mais resistentes do que VN II, e VN I e VN II são mais susceptíveis que VN III. Concluindo, a elevada frequência de VN I está de acordo com resultados obtidos em outros estudos em países Europeus e Sul-Americanos. É notável a abundância de VN III em Portugal, tal como relatado noutros países do Sul da Europa, mas também no Chile, contrariamente a outras regiões do globo. A elevada resistência ao fluconazol é compatível com os resultados documentados em estudos anteriores. Esta investigação é um importante passo na epidemiologia da criptococose e da ocorrência de C. neoformans em Portugal.

Leptospirose humana na Província da Huíla: rastreio serológico e molecular de doentes assistidos no Hospital Central Dr. António Agostinho Neto, Lubango (Angola)

A Leptospirose é uma doença infecciosa causada por bactérias patogénicas do género Leptospira. Ocorre sobretudo nos países em desenvolvimento, em regiões tropicais e subtropicais. Nos últimos anos tem-se tornado um problema emergente de Saúde Pública, afectando uma grande diversidade de mamíferos (hospedeiros), incluindo os humanos. Actualmente observa-se um aumento do número de casos com alterações do padrão epidemiológico, assim como o ressurgimento de surtos epidémicos devido a alterações climáticas. No entanto, devido aos sintomas inespecíficos, o diagnóstico clínico é confundível com outras doenças e o laboratorial é difícil e dispendioso, requerendo recursos e técnicos especializados. Em Angola (Lubango), o diagnóstico laboratorial não é praticado devido à indisponibilidade de testes específicos, resultando no desconhecimento da sua prevalência. Assim, de modo, a determinar a sero-ocorrência da Leptospirose humana em doentes febris assistidos no Hospital Central do Lubango, contribuindo para: i) a possível inclusão desta doença no diagnóstico diferencial de doentes com síndromes febris indeterminados; e ii) implementar medidas de prevenção e controlo. Foram analisadas 300 amostras séricas obtidas em igual número de doentes febris que recorreram ao referido hospital, no período de Setembro a Dezembro de 2012, aos quais também se aplicou um inquérito clínico-epidemiológico. Foi realizada uma avaliação serológica usando a técnica de rastreio (MACROLepto), e a técnica de referência (Técnica de Aglutinação Microscópica; TAM). Para a análise molecular usou-se a Reacção em Cadeia de Polimerase (PCR), em soro utilizando primers baseados no gene hap1 (para leptospiras patogénicas). Os produtos amplificados foram sequenciados para determinação de espécies genómicas de Leptospira. A amostra populacional foi constituída por indivíduos do género masculino (111; 37%) e (189; 63%) do género feminino. A suspeita clínica de Leptospirose foi confirmada serologicamente pela TAM em (120+/300; 40%) dos doentes, e a análise por PCR foi positiva em (30+/193; 16%) das amostras analisadas. A sequenciação do DNA obtido permitiu identificar três espécies genómicas: L. borgpetersenii, L. interrogans e L. kirschneri. Os participantes no estudo foram distribuídos por grupos etários, e a média de idade foi de 30 anos, sendo os grupos (11-20 e 21- 30 anos) os mais representados, e o género feminino o mais afectado (61%). As principais manifestações clínicas foram a febre (91%), cefaleias (84%) e mialgias (59%). Em relação as variáveis de risco de infecção por Leptospira spp., verificou-se que a ausência de saneamento básico, exposição aos lixos, presença de roedores próximos das populações e o consumo de água não tratada, foram as situações mais referidas. O contacto com os roedores, seguido dos canídeos, foi referido por 97% e 41% dos doentes com resultado positivo. Quanto à proveniência, a maioria dos doentes veio de áreas suburbanas. No que respeita à ocupação destacaram-se as mulheres camponesas, estudantes e domésticas. Os soros com resultado positivo mostraram reactividade específica para leptospiras de 19 serogrupos (serovares) com maior destaque, Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Hebdomadis, Javanica (Poi) Australis (Bratislava) e Sejroe (Hardjobovis). O título mais elevado foi de 1:800 observado para os serovares Copenhageni, Ballum (Arborea), Panama e Pyrogenes. Os resultados obtidos mostraram que a Leptospirose está presente entre os doentes febris na província da Huíla, sendo importante incluir esta zoonose no diagnóstico diferencial e promover medidas de prevenção e controlo, especialmente nos grupos de risco agora identificados.

Tipagem molecular de isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans

As micoses estão incluídas entre as doenças infecciosas mais ubíquas em todo o mundo, afectando todos os estratos sociais e todos os grupos etários numa variedade de manifestações superficiais, cutâneas, subcutâneas e sistémicas. Um diagnóstico rápido e eficaz destas doenças, com uma correcta identificação da espécie fúngica responsável pela infecção, é essencial para um planeamento do tratamento mais eficaz para o doente infectado. Tem-se registado um aumento da incidência das infecções fúngicas também em consequência do aumento do número de casos de doentes imunodeprimidos, devido particularmente à crescente utilização de terapêuticas imunossupressivas, procedimentos médicos invasivos, prescrição de tratamentos prolongados, entre outros aspectos. O aparecimento da epidemia da Imunodeficiência Humana no início da década de 80, causada pelo vírus VIH, contribuiu também decisivamente para o aumento das infecções fúngicas oportunistas. A Criptococose é uma infecção fúngica, predominantemente oportunista e com uma distribuição epidemiológica mundial, causada por leveduras encapsuladas do género Cryptococcus. A espécie clinicamente mais relevante é Cryptococcus neoformans, cujas estirpes têm sido tradicionalmente classificadas em cinco serotipos relacionados com os antigénios da respectiva cápsula polissacárida: A (C. neoformans var. grubii); D (C. neoformans var. neoformans); B e C (actualmente reconhecidos como uma espécie distinta mas filogeneticamente próxima, C. gattii); e AD (estirpes híbridas). O presente trabalho teve como principal objectivo determinar retrospectivamente os tipos moleculares de uma colecção alargada de estirpes de C. neoformans, isoladas e mantidas durante os últimos 18 anos no Laboratório de Micologia do IHMT/UNL. A maioria das estirpes foi isolada de doentes imunodeprimidos com criptococose, existindo também algumas estirpes de origem ambiental. Foi utilizada a técnica de PCR-RFLP do gene URA5 para diferenciar as estirpes de Cryptococcus neoformans, tendo sido detectados quatro tipos moleculares: VN1 e VN2 (relacionados com C. neoformans var. grubii, serotipo A); VN3 (relacionado com as estirpes híbridas de serotipo AD); e VN4 (relacionado com C. neoformans var. neoformans, serotipo D). Não foram encontrados entre os isolados de origem clínica perfis de restrição correspondentes aos tipos moleculares VG1, VG2, VG3 e VG4 (relacionados com C. gattii, serotipos B e C). O tipo molecular VN1 foi o mais abundante entre os isolados de origem clínica (45% dos isolados), seguindo-se o grupo de 5 estirpes híbridas do tipo molecular VN3 (31%). Os tipos moleculares menos abundantes entre os isolados foram o VN2 (12%) e VN4 (12%). A estandardização do método de tipagem molecular utilizado neste trabalho permite comparar os resultados obtidos com os de outros estudos epidemiológicos semelhantes, realizados noutras regiões do globo e publicados em anos recentes, contribuindo para um conhecimento melhorado da epidemiologia global deste importante fungo patogénico. Em Portugal obteve-se uma percentagem mais elevada de isolados dos grupos moleculares VN1 e VN3 em relação a outros países da Europa e América Latina, em que os tipos mais abundantes são VN1 e VN2. Nestas mesmas regiões, o tipo molecular VN4, relacionado com as estirpes de C. neoformans var. neoformans do serotipo D, é muito raro. Esta variedade é mais comum em zonas mediterrâneas e está muito associada a casos clínicos de infecções cutâneas associadas a infecções do Sistema Nervoso Central. Este tipo molecular parece ser também significativamente mais abundante no nosso país.

Exploring ionic liquids′ unique stimuli to elucidate uncharacterised cellular and molecular mechanisms in filamentous fungi

The emergence of new fungal pathogens, either of plants or animals, and the increasing number of reported cases of resistant human pathogenic strains to the available antifungal drugs reinforces the need for better understanding the biology of filamentous fungi. Conventional drugs target components of the fungal membrane or cell wall, therefore identifying novel intracellular targets, yet unique to fungi, is a global priority.(...)

Influence of the molecular weight in mechanical properties and degradation kinetics of chitosan inverted colloidal crystals

Tissue engineering arises from the need to regenerate organs and tissues, requiring the development of scaffolds, which can provide an optimum environment for tissue growth. In this work, chitosan with different molecular weights was used to develop biodegradable 3D inverted colloidal crystals (ICC) structures for bone regeneration, exhibiting uniform pore size and interconnected network. Moreover, in vitro tests were conducted by studying the influence of the molecular weight in the degradation kinetics and mechanical properties. The production of ICC included four major stages: fabrication of microspheres; assembly into a cohesive structure, polymeric solution infiltration and microsphere removal. Chitosan’s degree of deacetylation was determined by infrared spectroscopy and molecular weight was obtained via capillary viscometry. In order to understand the effect of the molecular weight in ICC structures, the mass loss and mechanical properties were analyzed after degradation with lysozyme. Structure morphology observation before and after degradation was performed by scanning electron microscopy. Cellular adhesion and proliferation tests were carried out to evaluate ICC in vitro response. Overall, medium molecular weight ICC revealed the best balance in terms of mechanical properties, degradation rate, morphology and biological behaviour.

Transactions in dynamic reactive environments

Most of today’s systems, especially when related to the Web or to multi-agent systems, are not standalone or independent, but are part of a greater ecosystem, where they need to interact with other entities, react to complex changes in the environment, and act both over its own knowledge base and on the external environment itself. Moreover, these systems are clearly not static, but are constantly evolving due to the execution of self updates or external actions. Whenever actions and updates are possible, the need to ensure properties regarding the outcome of performing such actions emerges. Originally purposed in the context of databases, transactions solve this problem by guaranteeing atomicity, consistency, isolation and durability of a special set of actions. However, current transaction solutions fail to guarantee such properties in dynamic environments, since they cannot combine transaction execution with reactive features, or with the execution of actions over domains that the system does not completely control (thus making rolling back a non-viable proposition). In this thesis, we investigate what and how transaction properties can be ensured over these dynamic environments. To achieve this goal, we provide logic-based solutions, based on Transaction Logic, to precisely model and execute transactions in such environments, and where knowledge bases can be defined by arbitrary logic theories.