Produção de misturas betuminosas com betumes modificados: compactabilidade e comportamento mecânico

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Civil - Perfil de Construção

Encaminhamento com múltiplas árvores

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática

Interaction of malaria parasites with host late endocytic and autophagic pathways is essential for Plasmodium liver stage development

RESUMO: A Malária é causada por parasitas do género Plasmodium, sendo a doença parasitária mais fatal para o ser humano. Apesar de, durante o século passado, o desenvolvimento económico e a implementação de diversas medidas de controlo, tenham permitido erradicar a doença em muitos países, a Malária continua a ser um problema de saúde grave, em particular nos países em desenvolvimento. A Malária é transmitida através da picada de uma fêmea de mosquito do género Anopheles. Durante a picada, os esporozoítos são injetados na pele do hospedeiro, seguindo-se a fase hepática e obrigatória do ciclo de vida. No fígado, os esporozoítos infetam os hepatócitos onde se replicam, dentro de um vacúolo parasitário (VP) e de uma forma imunitária silenciosa, em centenas de merozoitos. Estas novas formas do parasita são as responsáveis por infetar os eritrócitos, iniciando a fase sanguínea da doença, onde se os primeiros sintomas se manifestam, tais como a característica febre cíclica. A fase hepática da doença é a menos estudada e compreendida. Mais ainda, as interações entre o VP e os organelos da células hospedeira estão ainda pouco caracterizados. Assim, neste estudo, as interações entre os organelos endocíticos e autofágicos da célula hospedeira e o VP foram dissecados, observando-se que os anfisomas, que são organelos resultantes da intersecção do dois processos de tráfego intracelular, interagem com o parasita. Descobrimos que a autofagia tem também uma importante função imunitária durante a fase hepática inicial, ao passo, que durante o desenvolvimento do parasita, já numa fase mais tardia, o parasita depende da interação com os endossomas tardios e anfisomas para crescer. Vesiculas de BSA, EGF e LC3, foram, também, observadas dentro do VP, sugerindo que os parasitas são capazes de internalizar material endocítico e autofágico do hospedeiro. Mais ainda, mostramos que esta interação depende da cinase PIKfyve, responsável pela conversão do fosfoinositidio-3-fosfato no fosfoinositidio-3,5-bifosfato, uma vez que inibindo esta cinase o parasita não é capaz de crescer normalmente. Finalmente, mostramos que a proteína TRPML1, uma proteína efetora do fosfoinositidio-3,5-bifosfato, e envolvida no processo de fusão das membranas dos organelos endocíticos e autofágicos, também é necessária para o crescimento do parasita. Desta forma, o nosso estudo sugere que a membrana do VP funde com vesiculas endocíticas e autofágicas tardias, de uma forma dependente do fositidio-3,5-bifosfato e do seu effetor TRPML1, permitindo a troca de material com a célula hospedeira. Concluindo, os nossos resultados evidenciam que o processo autofágico que ocorre na célula hospedeira tem um papel duplo durante a fase hepática da malaria. Enquanto numa fase inicial os hepatócitos usam o processo autofágico como forma de defesa contra o parasita, já durante a fase de replicação o VP funde com vesiculas autofágicas e endocíticas de forma a obter os nutrientes necessários ao seu desenvolvimento.--------- ABSTRACT: Malaria, which is caused by parasites of the genus Plasmodium, is the most deadly parasitic infection in humans. Although economic development and the implementation of control measures during the last century have erradicated the disease from many areas of the world, it remains a serious human health issue, particularly in developing countries. Malaria is transmitted by female mosquitoes of the genus Anopheles. During the mosquito blood meal, Plasmodium spp. sporozoites are injected into the skin dermis of the vertebrate host, followed by an obligatory liver stage. Upon entering the liver, Plasmodium parasites infect hepatocytes and silently replicate inside a host cell-derived parasitophorous vacuole (PV) into thousands of merozoites. These new parasite forms can infect red blood cells initiating the the blood stage of the disease which shows the characteristic febrile malaria episodes. The liver stage is the least characterized step of the malaria infection. Moreover, the interactions between the Plasmodium spp. PV and the host cell trafficking pathways are poorly understood. We dissected the interaction between Plasmodium parasites and the host cell endocytic and autophagic pathways and we found that both pathways intersect and interconnect in the close vicinity of the parasite PV, where amphisomes are formed and accumulate. Interestingly, we observed a clearance function for autophagy in hepatocytes infected with Plasmodium berghei parasites at early infection times, whereas during late liver stage development late endosomes and amphisomes are required for parasite growth. Moreover, we found the presence of internalized BSA, EGF and LC3 inside parasite vacuoles, suggesting that the parasites uptake endocytic and autophagic cargo. Furthermore, we showed that the interaction between the PV and host traffic pathways is dependent on the kinase PIKfyve, which converts the phosphoinositide PI(3)P into PI(3,5)P2, since PIKfyve inhibition caused a reduction in parasite growth. Finally, we showed that the PI(3,5)P2 effector protein TRPML1, which is involved in late endocytic and autophagic membrane fusion, is also required for parasite development. Thus, our studies suggest that the parasite parasitophorous vacuole membrane (PVM) is able to fuse with late endocytic and autophagic vesicles in a PI(3,5)P2- and TRPML1-dependent manner, allowing the exchange of material between the host cell and the parasites, necessary for the rapid development of the latter that is seen during the liver stage of infection. In conclusion, we present evidence supporting a specific and essential dual role of host autophagy during the course of Plasmodium liver infection. Whereas in the initial hours of infection the host cell uses autophagy as a cell survival mechanism to fight the infection, during the replicative phase the PV fuses with host autophagic and endocytic vesicles to obtain nutrients required for parasite growth.

Avaliação da qualidade do ar em Cascais através de monitorização portátil

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, perfil de Ordenamento do Território e Impactes Ambientais

Optimização de sistemas de tratamento de águas de escorrência de estradas

A deterioração da qualidade do meio hídrico e a afectação de ecossistemas pela influência de estradas deve-se ao transporte da poluição acumulada no pavimento pelas águas pluviais,designando-se como águas de escorrência de estradas. Entre os poluentes mais comuns e preocupantes encontram-se os metais pesados (zinco, cobre, chumbo, cádmio, crómio),hidrocarbonetos, partículas (sólidos suspensos totais), óleos e gorduras. Onde não é possível evitar a descarga das águas de escorrência e tratando-se de zonas sensíveis (como recursos hídricos que não garantam a diluição dos poluentes rodoviários, estuários, captações públicas ou privadas de água superficial e subterrânea, canais e valas de distribuição de água para rega, campos agrícolas e infraestruturas hidráulicas), devem estabelecer-se sistemas de tratamento, promovendo a diminuição da poluição para níveis aceitáveis antes da descarga. Deste modo, mostra-se pertinente a análise de sistemas de tratamento de águas de escorrência de estradas, incluindo a determinação de critérios para o efeito e a sua optimização. A presente dissertação tem por objectivo contribuir para o avanço de conhecimentos no domínio dos sistemas de tratamento de águas de escorrência de estradas, nomeadamente a avaliação em função de vários critérios, incluindo a monitorização, visando o contributo para proposta de regionalização da solução mais eficiente/sustentável para sistemas de tratamento de águas de escorrência de estradas, numa perceção holística e, com a focalização na avaliação de impactes ambientais, na proteção dos recursos hídricos e na correta gestão das atividades inerentes ao projecto, construção, exploração, manutenção e monitorização dos sistemas de tratamento. A análise de resultados incidiu essencialmente sobre as melhores estratégias de gestão (a nível nacional e internacional). Procedeu-se à comparação das condições hidrológicas e região, do caudal a tratar, do tráfego médio diário das vias rodoviárias em estudo, da eficiência de remoção dos poluentes face aos sistemas de tratamento implantados e custos associados (investimento e manutenção).

Surdez em Portugal: estudos genéticos e funcionais do gene da conexina

A surdez é a deficiência sensorial mais comum na população humana, afetando o desenvolvimento social do indivíduo afetado por esta patologia. Estima-se que 50% dos casos de deficiência auditiva podem ser evitáveis. Cerca de 1/1000 recém-nascidos apresentam surdez e 1/3 da população acima dos 65 anos é também afetada. No presente estudo, foram analisadas 19 famílias diferentes. Analisou-se ainda 399 amostras aleatórias de recém-nascidos provenientes das várias regiões de Portugal. Mutações no gene GJB2, que codifica para a Cx26, são a principal causa de surdez hereditária não sindrómica, como tal, foi analisado nos dois tipos de população em estudo, tal como o gene GJB6, que codifica para a Cx30. Nas famílias analisadas foram encontradas as mutações c.35delG, p.Met34Thr e p.R127H, no gene GJB2, as quais se contam entre as mutações mais comuns na população portuguesa. Na população aleatória foram encontradas as mutações c.35delG. p.Met34Thr e K224Q, assim como o polimorfismo F83L. Foram caracterizadas funcionalmente três mutações da Cx26 – a p.Leu213X, p.Gly160Ser e p.Gly160Cys. Verificou-se que as proteínas contendo a mutação p.Leu213X foram observadas principalmente no citoplasma, o que sugere que elas são aí retidas. O défice no seu tráfego para a membrana poderá estar relacionado com o facto de esta mutação originar um codão STOP no domínio C-terminal da proteína. As proteínas que continham a mutação p.Gly160Ser e a p.Gly160Cys são transportadas até à membrana plasmática, tal como a Cx26 selvagem. No entanto, a permeabilidade dos canais intercelulares compostos por Cx26 apresentando estas mutações não foi investigada. Este estudo contribui para o aprofundamento do conhecimento sobre a surdez hereditária e o espectro de mutações no locus DFNB1. Permitiu também a primeira caracterização funcional de três mutações da Cx26. Os estudos funcionais têm em vista a possível aplicação de terapias destinadas à recuperação da função nativa da Cx26.

Melanosome transfer between melanocytes and keratinocytes

RESUMO: A pele é o maior órgão do corpo humano e a sua pigmentação é essencial para a sua coloração e proteção contra os efeitos nocivos da radiação ultravioleta (UV). A pigmentação da pele resulta essencialmente de três processos: a síntese e o armazenamento de melanina pelos melanócitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melanócitos; e finalmente, a transferência dos melanossomas para os queratinócitos adjacentes. Nos queratinócitos, a melanina migra para a região perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,responsável pela proteção do DNA dos danos causados pela radiação UV. Os melanócitos estão localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratinócitos. Em conjunto, estas células formam a “unidade melano-epidérmica”. Apesar dos processos de síntese e transporte de melanina nos melanócitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes à transferência inter-celular de melanina são menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observação de amostras de pele humana por microscopia electrónica, indicam que a forma predominante de transferência de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melanócitos e subsequente endocitose da melanina por queratinócitos. Para além disso sabe-se que as proteínas Rab, que controlam o tráfego membranar, estão envolvidas em várias etapas de pigmentação da pele, nomeadamente na biogénese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionámo-nos sobre o seu envolvimento na transferência de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferência de melanina na pele, através do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as proteínas Rab que regulam o processo. Pretendemos também confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferência de melanina. Primeiro, explorámos a regulação da secreção de melanina pelos melanócitos e analisámos o papel de proteínas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um método in vitro, desenvolvido previamente no laboratório, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o número de melanossomas transferidos para os queratinócitos. Através de co-culturas de melanócitos e queratinócitos, verificou-se que os queratinócitos estimulam a libertação de melanina dos melanócitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferência para os queratinócitos. Além disso, a proteína Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferência para os queratinócitos. De facto, a diminuição da expressão de Rab11b em melanócitos provocou a redução da secreção de melanina estimulada por queratinócitos, bem como da transferência desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrámos a nossa investigação na internalização de melanina por queratinócitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explorámos o envolvimento de proteínas Rab na captação de melanina por queratinócitos. Como primeira abordagem, usámos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este método revelou-se ineficaz uma vez que a internalização destas esferas é independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captação de melanina por queratinócitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melanócitos, incluindo um programa informático especialmente desenhado para realizar uma análise semi-automatizada. Após internalização, os melanocores acumulam-se na região perinuclear dos queratinócitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captação de melanocores por queratinócitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para além disso, a necessidade de quatro proteínas Rab foi identificada na internalização de melanocores por queratinócitos. A redução da expressão de Rab1a ou Rab5b em queratinócitos diminuiu significativamente o nível de internalização de melanocores, enquanto o silenciamento da expressão de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em conclusão, os resultados apresentados corroboram as observações anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferência predominante é a exocitose de melanina pelos melanócitos, induzida por queratinócitos, seguida por endocitose pelos queratinócitos. A pigmentação da pele tem implicações tanto ao nível da cosmética, como ao nível médico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenças pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferência de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias para modular a pigmentação da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed “epidermal-melanin unit”, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.

Modelação e resposta dinâmica de vias ferroviárias balastradas. Comportamento a longo prazo

A programação e execução de atividades de manutenção nas vias ferroviárias requerem que antecipadamente sejam realizadas inspeções à via, verificando-se através de equipamentos específicos a conformidade dos parâmetros da via com as normas regulamentares. Assim, quando as inspeções o indicam, as entidades gestoras devem programar e realizar as ações de manutenção necessárias de modo a restabelecer a qualidade da via. Baseado em dados obtidos pelo veículo de inspeção de via, utilizado na rede ferroviária nacional, o trabalho desenvolvido na presente dissertação tem como objetivo, com recurso a modelação numérica, prever problemas de comportamento a longo prazo do balastro e do solo de fundação, identificando quando serão necessárias operações de manutenção. De acordo com as estruturas de via balastrada mais usuais em Portugal e os aspetos geotécnicos relacionados com a sua subestrutura, pretendeu-se desenvolver um estudo para melhor entender o seu comportamento a longo prazo, com recurso ao programa D-Track, e contribuir para uma eficaz previsão e preparação dos trabalhos de manutenção da via. Foram modelados numericamente três casos distintos de vias ferroviárias, considerando os aspetos estruturais relevantes. É tida em conta a passagem de vários comboios de acordo com o tipo de tráfego estimado e posteriormente é feita a análise dos resultados de saída, tais como, assentamentos do carril e balastro, forças de interação veículo/balastro. Os principais temas abordados são: os constituintes da via ferroviária balastrada, o que leva à sua degradação, análise de dados obtidos em inspeções de via pela EM120, modelação numérica dos casos estudo, análise de resultados e principais conclusões.

Reabilitação de taludes de escavação em rochas de baixa resistência na ER 266

A presente dissertação aborda a problemática da reabilitação de taludes de escavação em maciços de baixa resistência. Para o efeito foi estudado um trecho da estrada regional 266 (ER 266), executada nos anos 40 do século passado, que deve a sua construção à necessidade de ligação da estação de caminhos-de-ferro de Luzianes Gare à vila algarvia de Monchique. Esta estrada insere-se em terrenos xistentos/pelíticos da Formação de Mira (Grupo de Flysch do Baixo Alentejo), desenrolando-se o traçado em grande parte da sua extensão em escavação, sendo frequentes os taludes com altura superior a 5 m e com pendentes da ordem de 50º, cuja estabilidade é essencialmente comandada pela compartimentação do maciço rochoso e pelas especificidades das rochas de baixa resistência que os constituem É analisada a situação de estabilidade dos taludes de escavação em vários trechos da ER 266, quer de taludes já intervencionados, onde se verificou a ocupação da via pelos materiais deslocados, quer de outros cujo reforço ainda não foi implementado. Definem-se as características geométricas, físicas e mecânicas dos taludes analisados, efectua-se uma análise expedita da susceptibilidade ao movimento para cada um, com uma avaliação quantitativa do factor de segurança global e do risco associado ao evento. Posteriormente, estabelece-se uma metodologia de intervenção para as situações mais relevantes estudadas, propondo-se um conjunto de potenciais soluções para as mesmas, abordando a adequação da técnica de estabilização ao maciço em causa, e às características da via em estudo (tipo de via, a sua localização e o respectivo tráfego), tendo por objectivo ser um contributo válido na gestão da manutenção de taludes rodoviários. Por fim, referem-se as principais conclusões relativas a intervenções de reabilitação de taludes de escavação em condições similares, em terrenos de baixa resistência.

A abolição da dupla incriminação no mandado de detenção europeu

This essay presents the European Arrest Warrant and its relationship with the principle of double criminality, which was abolished in 2002 with the new Framework Decision (FD). This instrument was essential to implement the principle of mutual recognition and strengthen the police and judicial cooperation in criminal matters in the newly created space of freedom, security and justice. It was urgent to create mechanisms to combat cross-border crime, that alone States have struggled to counter. An analysis of the FD No 2002/584/JHA is made. The execution of warrants and the non-mandatory and optional grounds of refusal are studied in detail. As it is the implementation issue. The role of mutual recognition in practice is studied as well. The procedure is to introduce the principle of double criminality, to explain the concept and its abolition, warning for the consequences derived from them, related to the principle of legality and fundamental rights. The analysis of the European Arrest Warrant in practice in Portugal and in comparison with other Member States allows the measurement of the consequences from the abolition of dual criminality and the position of States on this measure. With the abolition of double criminality, the cooperation in judicial and criminal matters departs from what was intended by the European Council of Tampere. And without cooperation, fundamental rights of citizens are unprotected, so the states have to adopt measures to remedy the "failures" of the European Law.

Desempenho de sistemas de comunicações full-duplex

O aumento do volume de tráfego gerado em redes sem fios e a elevada taxa de ocupação do espectro Rádio-Eléctrico tem levado à procura e desenvolvimento de sistemas de elevada eficiência espectral. Recentemente, diversos grupos de investigação têm abordado a possibilidade de um dispositivo sem fios transmitir e receber dados em simultâneo na mesma banda. Estes dispositivos enquadram-se nos denominados “sistemas de comunicação Full-Duplex”, os quais, no limite, podem duplicar a capacidade da rede, quando comparados aos sistemas Half-Duplex. A grande dificuldade de implementação destes sistemas está associada ao cancelamento da auto-interferência. Esta interferência é provocada pela transmissão do próprio nó e, uma vez que apresenta uma potência muito superior à do sinal transmitido por outro dispositivo, impossibilita a captura desse sinal. Para permitir a transmissão e recepção de dados em simultâneo, os dispositivos Full-Duplex utilizam mecanismos de cancelamento do sinal auto-interferente, reduzindo-o para valores de potência próximos do nível de ruído. Nesta dissertação são abordados diversos tipos de mecanismos de redução da autointerferência, caracterizando as suas vantagens, desvantagens e limitações de utilização. De forma a estudar o funcionamento dos sistemas Full-Duplex, é caracterizado o efeito residual do cancelamento da auto-interferência e a capacidade de transmissão deste tipo de sistemas, incluindo a capacidade de recepção de múltiplos pacotes. Por fim, é proposto um protocolo de acesso ao meio para cenários onde vários dispositivos desejam comunicar com um nó receptor, utilizando um sistema de comunicação Full-Duplex.

Rede de turismo sustentável na região de Trás-os-Montes e Alto Douro

O turismo tornou-se um dos maiores sectores da economia a nível mundial. Tem a capacidade de relacionar os aspetos económicos, sociais, culturais e ambientais de forma a agir como uma força motriz para o seu reforço mútuo. É uma atividade económica relevante em regiões de baixa densidade. A problemática deste estudo está diretamente relacionada com o desenvolvimento local assente no turismo. A presente dissertação tem como principal objetivo contribuir para a criação, em Trás-os-Montes e Alto Douro, de um destino turístico capaz de trabalhar em rede. A região em estudo é de baixa densidade, com uma população envelhecida e socialmente deprimida. Contudo, pelas suas características endógenas únicas e pelos seus valores naturais e culturais, tem potencialidade para apostar num desenvolvimento assente no turismo. Com o objetivo de perceber o que estaria a condicionar o desenvolvimento da região, realizaram-se entrevistas e inquéritos a diferentes entidades: agentes políticos, agentes turísticos, associações de desenvolvimento local, agricultores e vitivinicultores. Através dos resultados obtidos verificou-se que na generalidade há consenso entre as entidades. Os principais obstáculos identificados em relação ao desenvolvimento local foram: evolução demográfica, rendimento médio mensal, interação entre entidades e apoio do poder local. As características mais valorizadas da região foram: paisagem natural e humanizada, património cultural, agricultura e gastronomia. Apesar da não interação entre entidades, as mesmas reconhecem as vantagens que podem resultar do trabalho em rede para o desenvolvimento local. Contudo, há temáticas em que é notória a divergência de opiniões, tais como: acesso a serviços de educação e saúde, a transformação do IP4 em A4 e a construção da barragem de Foz Tua. Os resultados permitiram concluir que, apesar de haver consenso sobre a importância do turismo e do trabalho em rede, o maior obstáculo ao desenvolvimento é a falta de interação e coordenação entre as diferentes entidades.

Primary cilia and the regulation of hedgehog signaling: link to cardiac development

RESUMO: As células eucarióticas evoluíram um sistema de sinalização complexo que lhes permite responder aos sinais extracelulares e intracelulares. Desta forma, as vias de sinalização são essenciais para a sobrevivência da célula e do organismo, uma vez que regulam processos fundamentais, tais como o desenvolvimento, o crescimento, a imunidade, e a homeostase dos tecidos. A via de transdução de sinal Hedgehog (Hh) envolve o receptor Patched1 (Ptch1), que tem um efeito inibidor sobre a proteína Smoothened (Smo) na ausência dos seus ligandos, as proteínas Sonic hedgehog (Shh). Estas proteínas são reguladores fundamentais do desenvolvimento embrionário, como ilustrado pelas malformações drásticas observadas em embriões humanos e de murganho com perturbações da transdução de sinal da via Hh e que incluem polidactilia, defeitos craniofaciais e malformações ósseas. Igualmente importantes são as consequências da ativação inapropriada da via de sinalização Hh na formação de tumores. Curiosamente, os componentes desta via localizam-se nos cílios primários. Além disso, demonstrou-se que esta localização é crucial para a sinalização através da via Hh. Na presença dos ligandos, Ptch1 é internalizado e destinado a degradação ou sequestrado num compartimento da célula de onde não pode desempenhar o seu papel inibitório. A proteína Arl13b é uma pequena GTPase pertencente à família Arf/Arl da superfamília Ras de pequenas GTPases e foi implicada no síndrome de Joubert, uma ciliopatia caracterizada por ataxia congénita cerebelar, hipotonia, atrso mental e cardiopatia congénita. Murganhos deficientes para Arl13b, chamado hennin (hnn) morrem morrem prematuramente ao dia 13,5 de gestação (E13,5) e exibem anomalias morfológicas nos cílios que levam à interrupção da sinalização Hh. Além disso, a Arl13b está diretamente envolvida na regulação da via Hh, controlando a localização de vários componentes desta via nos cílios primários. Neste trabalho, mostramos que a Arl13b se localiza em circular dorsal ruffles (CDRs), que são estruturas de actina envolvidas em macropinocitose e internalização de recetores, e que regula a sua formação. Além disso, aprofundámos o conhecimento do processo de ativação da via de sinalização Hh, mostrando que as CDRs sequestram seletivamente e internalizam o recetor Ptch1. As CDRs formam-se minutos após ativação da via por ligandos Shh ou pelo agonista de Smo SAG e continuam a ser formadas a partir daí, sugerindo uma indução contínua da reorganização do citoesqueleto de actina quando a via está ativada. Observámos ainda que a inibição da formação de CDRs através do silenciamento de WAVE1, uma proteína necessária para a formação destas estruturas, resulta na diminuição da ativação da via de sinalização Hh. Além disso, o bloqueio da macropinocitose, que se segue ao fecho das CDRs, através do silenciamento de uma proteína necessária para a cisão de macropinossomas, nomeadamente a proteína BARS, tem um efeito semelhante. Estes resultados sugerem que as CDRs e a macropinocitose são necessárias para a ativação da via de sinalização Hh e indicam que esta via de internalização controla os níveis de sinal Hh. Durante o desenvolvimento, as células proliferativas dependem do cílio primário para a transdução de várias vias de sinalização. A via Hh induz a diferenciação do músculo cardíaco. Por conseguinte, os murganhos deficientes na via de sinalização Hh exibem uma variedade de defeitos de lateralidade, incluindo alteração do looping do coração, como pode ser visto em murganhos deficientes para Arl13b. Por conseguinte, investigámos o papel da Arl13b no desenvolvimento do coração. Mostramos que a Arl13b é altamente expressa no coração de embriões de murganho e de murganhos adultos ao nível do mRNA e da proteína. Além disso, o perfil de distribuição da Arl13b no coração segue o dos cílios primários, que são essenciais para o desenvolvimento cardíaco. Corações de murganhos hnn no estadio E12,5 mostram um canal átrio-ventricular aberto, espessamento da camada compacta ventricular e aumento do índice mitótico no ventrículo esquerdo. Além disso, um atraso de 1 a 2 dias no desenvolvimento é observado em corações de murganhos hnn, quando comparados com controlos selvagens no estadio E13,5. Assim, estes resultados sugerem que a Arl13b é necessária para o desenvolvimento embrionário do coração e que defeitos cardíacos podem contribuir para a letalidade embrionária de murganhos hnn. Em suma, foi estabelecido um novo mecanismo para a regulação dos níveis de superfície do recetor Ptch1, que envolve a remodelação do citoesqueleto de actina e a formação de CDRs após a ativação da via de sinalização Hh. Este mecanismo permite um feedback negativo que evita a repressão excessiva da via através da remoção de Ptch1 da superfície da célula. Além disso, determinou-se que uma mutação de perda de função na Arl13b causa defeitos cardíacos durante o desenvolvimento, possivelmente relacionados com a associação dos defeitos em cílios primários e na sinalização Hh, existentes em murganhos deficientes para Arl13b. A via de sinalização Hh tem tido um papel central entre as vias de sinalização, uma vez que a sua regulação é crucial para o funcionamento apropriada da célula. Assim, a descoberta de um novo mecanismo de tráfego através de macropinocitose e CDRs que controla a ativação e repressão da via de sinalização Hh traz novas perspetivas de como esta via pode ser regulada e pode ainda conduzir à identificação de novos alvos e estratégias terapêuticas. --------------------ABSTRACT: Eukaryotic cells have evolved a complex signaling system that allows them to respond to extracellular and intracellular cues. Signaling pathways are essential for cell and organism survival, since they regulate fundamental processes such as development, growth, immunity, and tissue homeostasis. The Hedgehog (Hh) pathway of signal transduction involves the receptor Patched1 (Ptch1), which has an inhibitory effect on Smoothened (Smo) in the absence of its ligands, the Sonic hedgehog (Shh) proteins. These proteins are fundamental regulators of embryonic development, as illustrated by the dramatic malformations seen in human and mouse embryos with perturbed Hh signal transduction that include polydactyly, craniofacial defects and skeletal malformations. Equally important are the consequences of inappropriate activation of the Hh signaling response in tumor formation. Interestingly, the components of this pathway localize to primary cilia. Moreover, it has been shown that this localization is crucial for Hh signaling. However, in the presence of the ligands, Ptch1 is internalized and destined for degradation or sequestered in a cell compartment where it no longer can play its inhibitory role. ADP-ribosylation factor-like (Arl) 13b, a small GTPase belonging to Arf/Arl family of the Ras superfamily of small GTPases has been implicated in Joubert syndrome, a ciliopathy characterized by congenital cerebellar ataxia, hypotonia, intellectual disability and congenital heart disease. Arl13b-deficient mice, called hennin (hnn) die at embryonic day 13.5 (E13.5) and display morphological abnormalities in primary cilia that lead to the disruption of Hh signaling. Furthermore, Arl13b is directly involved in the regulation of Hh signaling by controlling the localization of several components of this pathway to primary cilia. Here, we show that Arl13b localizes to and regulates the formation of circular dorsal rufles (CDRs), which are actin-basedstructures known to be involved in macropinocytosis and receptor internalization. Additionally, we extended the knowledge of the Hh signaling activation process by showing that CDRs selectively sequester and internalize Ptch1 receptors. CDRs are formed minutes after Hh activation by Shh ligands or the Smo agonist SAG and keep being formed thereafter, suggesting a continuous induction of actin reorganization when the pathway is switched on. Importantly, we observed that disruption of CDRs by silencing WAVE1, a protein required for CDR formation, results in down-regulation of Hh signaling activation. Moreover, the blockade of macropinocytosis, which follows CDR closure, through silencing of a protein necessary for the fission of macropinosomes, namely BARS has a similar effect. These results suggest that CDRs and macropinocytosis are necessary for activation of Hh signaling and indicate that this pathway of internalization controls Hh signal levels. During development, proliferating cells rely on the primary cilium for the transduction of several signaling pathways. Hh induces the differentiation of cardiac muscle. Accordingly, Hh-deficient mice display a variety of laterality defects, including alteration of heart looping, as seen in Arl13b-deficient mice. Therefore, we investigated the role of Arl13b in heart development. We show that Arl13b is highly expressed in the heart of both embryonic and adult mice at mRNA and protein levels. Also, Arl13b localization profile mimics that of primary cilia, which have been shown to be essential to early heart development. E12.5 hnn hearts show an open atrioventricular channel, increased thickening of the ventricular compact layer and increased mitotic index in the left ventricle. Moreover, a delay of 1 to 2 days in development is observed in hnn hearts, when compared to wild-type controls at E13.5. Hence, these results suggest that Arl13b is necessary for embryonic heart development and that cardiac defects might contribute to the embryonic lethality of hnn mice. Altogether, we established a novel mechanism for the regulation of Ptch1 surface levels, involving cytoskeleton remodeling and CDR formation upon Hh signaling activation. This mechanism allows a negative feedback loop that prevents excessive repression of the pathway by removing Ptch1 from the cell surface. Additionally, we determined that the Arl13b loss-offunction mutation causes cardiac defects during development, possibly related to the associated ciliary and Hh signaling defects found in Arl13b-deficient mice. Hh signaling has taken a center stage among the signaling pathways since its regulation is crucial for the appropriate output and function of the cell. Hence, the finding of a novel trafficking mechanism through CDRs and macropinocytosis that controls Hh signaling activation and repression brings new insights to how this pathway can be regulated and can lead to the discovery of novel therapeutic targets and strategies.

A abolição da dupla incriminação no mandado de detenção europeu

This essay presents the European Arrest Warrant and its relationship with the principle of double criminality, which was abolished in 2002 with the new Framework Decision (FD). This instrument was essential to implement the principle of mutual recognition and strengthen the police and judicial cooperation in criminal matters in the newly created space of freedom, security and justice. It was urgent to create mechanisms to combat cross-border crime, that alone States have struggled to counter. An analysis of the FD No 2002/584/JHA is made. The execution of warrants and the non-mandatory and optional grounds of refusal are studied in detail. As it is the implementation issue. The role of mutual recognition in practice is studied as well. The procedure is to introduce the principle of double criminality, to explain the concept and its abolition, warning for the consequences derived from them, related to the principle of legality and fundamental rights. The analysis of the European Arrest Warrant in practice in Portugal and in comparison with other Member States allows the measurement of the consequences from the abolition of dual criminality and the position of States on this measure. With the abolition of double criminality, the cooperation in judicial and criminal matters departs from what was intended by the European Council of Tampere. And without cooperation, fundamental rights of citizens are unprotected, so the states have to adopt measures to remedy the "failures" of the European Law.

Avaliação da implementação da fase III da zona de emissões reduzidas de Lisboa

Os efeitos de uma qualidade do ar reduzida são sentidos principalmente em centros urbanos, como Lisboa, onde persistem situações de concentrações elevadas de dióxido de azoto (NO2) e matéria particulada (PM10), originadas pelo tráfego automóvel. Para diminuir a concentração desses poluentes foi implementada uma Zona de Emissões Reduzidas (ZER) em Lisboa, que entrou na fase III em janeiro de 2015. Avaliou-se a evolução da qualidade do ar nos últimos cinco anos em Lisboa, nomeadamente as excedências aos valores limite legais de curto prazo para NO2 e PM10, bem como a influência da meteorologia na sua ocorrência. A qualidade do ar, em geral, melhorou, registando-se a maioria das excedências no outono e inverno, em dias úteis e final da tarde e início da manhã, períodos coincidentes com a maior intensidade de tráfego rodoviário. A altura da base da inversão térmica e a velocidade do vento são mais reduzidas em dias com excedências, o que indicia um papel relevante da meteorologia. A avaliação do impacte da fase II da ZER nas excedências aos valores limite revelou que o número de excedências e a duração dos episódios de poluição diminuíram, mas mais significativamente em estações fora da ZER. Analisou-se a influência da fase III da ZER na composição da frota automóvel e nas emissões associadas de NOX e PM na Avenida da Liberdade, com base nos dados obtidos antes (2014) e depois (2015) da fase III. Verificou-se uma melhoria na frota em toda a cidade, mais acentuada na zona 2 que na zona 1. Concluiu-se que o impacte da fase III foi reduzido, principalmente na zona 1, possivelmente relacionado com a escassa fiscalização. Caso o número de veículos se tivesse mantido igual entre 2014 e 2015, teria sido possível uma redução de 23% nas emissões de NOX e de 8% nas de PM.