The role of α2,3- and α2,6-sialylation

RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade, continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune. À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs) ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios, maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo. 2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações 37 nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas β2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar as moléculas envolvidas neste processo. 4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T. Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6- and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.

Continuidade e mudança. O sistema internacional no post‐Guerra Fria

O fim da Guerra Fria é um caso inédito de mudança pacífica da estrutura internacional, em que os Estados Unidos e a União Soviética transcendem a divisão bipolar para decidir os termos da paz no quadro das instituições que definem o modelo de ordenamento multilateral, consolidando a sua legitimidade. Nesse contexto, ao contrário dos casos precedentes de reconstrução internacional no fim de uma guerra hegemónica, o novo sistema do post-Guerra Fria, caracterizado pela unipolaridade, pela regionalização e pela homogeneização, forma-se num quadro de continuidade institucional. A ordem política do post-Guerra Fria é um sistema misto em que as tensões entre a hierarquia unipolar e a anarquia multipolar, a integração global e a fragmentação regional e a homogeneidade e a heterogeneidade política, ideológica e cultural condicionam as estratégias das potências. As crises internacionais vão pôr à prova a estabilidade da nova ordem e a sua capacidade para garantir mudanças pacíficas. A primeira década do post-Guerra Fria mostra a preponderância dos Estados Unidos e a sua confiança crescente, patente nas Guerras do Golfo Pérsico e dos Balcãs, bem como na crise dos Estreitos da Formosa. A reacção aos atentados do "11 de Setembro" revela uma tentação imperial da potência unipolar, nomeadamente com a invasão do Iraque, que provoca uma crise profunda da comunidade de segurança ocidental. A vulnerabilidade do centro da ordem internacional é confirmada pela crise constitucional europeia e pela crise financeira global. Essas crises não alteram a estrutura de poder mas aceleram a erosão da ordem multilateral e criam um novo quadro de possibilidades para a evolução internacional, que inclui uma escalada dos conflitos num quadro de multipolaridade regional, uma nova polarização entre as potências democráticas conservadoras e uma coligação revisionista autoritária, bem como a restauração de um concerto entre as principais potências internacionais.

Modelo de previsão para identificar fatores de risco dos reinternamentos hospitalares em 30 dias : um estudo ao GDH 127 - insuficiência cardíaca ou choque

A representatividade do número de reinternamento hospitalares, no quadro dos custos hospitalares, deverá ser encarada como um indicador de qualidade nos serviços prestados e um objeto de estudo no que diz respeito à forma como estão a ser geridos esses serviços. Caracterizar os utentes com maior propensão a um reinternamento e identificar os fatores de risco que lhe estão associados torna-se, pois, pertinente, pois só assim, se poderá, no futuro, desenvolver uma atuação proativa com o objetivo primeiro de uma redução de custos sem colocar, no entanto, em causa a qualidade dos serviços que as entidades hospitalares prestam aos seus utentes. O objetivo deste estudo consiste em criar um modelo preditivo, com base em árvores de decisão, que auxilie a identificar os fatores de risco dos reinternamentos em 30 dias relativos ao Grupos de Diagnóstico Homogéneo (GDH) 127 - Insuficiência cardíaca e/ou choque, de forma a auxiliar as entidades prestadoras de cuidados de saúde a tomar decisões e atuar atempadamente sobre situações críticas. O estudo é suportado pela base de dados dos Grupos de Diagnóstico Homogéneos, a qual, possui informação sobre o utente e sobre o seu processo de internamento, nomeadamente, o diagnóstico principal, os diagnósticos secundários, os procedimentos realizados, a idade e sexo do utente e o destino após a alta. Pode concluir-se após estudo, que as taxas de reinternamentos têm vindo a aumentar nos últimos anos, que a população idosa insere-se no universo sujeito ao maior risco de reinternamento e que além do diagnóstico principal, a existência de comorbidades representa um papel importante no incremento do risco, nomeadamente, quando são diagnosticadas em simultâneo doenças renais, diabetes mellitus ou doenças isquémicas crónicas do coração (NCOP).

Proposta de um modelo de medição e análise da satisfação de clientes em empresas de software : caso prático do ambiente business-to-business

Os estudos da satisfação e lealdade do cliente em ambiente Business-to-Business têm emergido devido ao interesse práctico e académico. Recorreu-se a um caso práctico de uma empresa de software internacional, ESRI, a operar em Portugal com modelo de negócio B2B e comportamento de compra extensivo. Desenvolveu-se um modelo estrutural com 11 variáveis latentes: lealdade; satisfação; imagem; atmosfera; cooperação; adaptação; processos; tecnologia; orientação ao cliente; competências; colaboradores e comunicação. Foram analisadas 304 respostas ao questionário de satisfação e de seguida aplicou-se o modelo a seis grupos de clientes segmentados de acordo com a contribuição do cliente para as receitas e o comportamento no processo de decisão de compra. Recorreu-se a modelos SEM (Structural Equation Modelling) com estimação dos parâmetros através da metodologia PLS (partial Least Squares). Os resultados mostram nos seis segmentos, que os valores da empresa, a cooperação através da competência dos colaboradores e da orientação ao cliente e a tecnologia são factores mais importantes para a satisfação e lealdade dos clientes.

Implementação de um modelo de geometric semantic genetic programming para aplicação naval

Recaí sob a responsabilidade da Marinha Portuguesa a gestão da Zona Económica Exclusiva de Portugal, assegurando a sua segurança da mesma face a atividades criminosas. Para auxiliar a tarefa, é utilizado o sistema Oversee, utilizado para monitorizar a posição de todas as embarcações presentes na área afeta, permitindo a rápida intervenção da Marinha Portuguesa quando e onde necessário. No entanto, o sistema necessita de transmissões periódicas constantes originadas nas embarcações para operar corretamente – casos as transmissões sejam interrompidas, deliberada ou acidentalmente, o sistema deixa de conseguir localizar embarcações, dificultando a intervenção da Marinha. A fim de colmatar esta falha, é proposto adicionar ao sistema Oversee a capacidade de prever as posições futuras de uma embarcação com base no seu trajeto até à cessação das transmissões. Tendo em conta os grandes volumes de dados gerados pelo sistema (históricos de posições), a área de Inteligência Artificial apresenta uma possível solução para este problema. Atendendo às necessidades de resposta rápida do problema abordado, o algoritmo de Geometric Semantic Genetic Programming baseado em referências de Vanneschi et al. apresenta-se como uma possível solução, tendo já produzido bons resultados em problemas semelhantes. O presente trabalho de tese pretende integrar o algoritmo de Geometric Semantic Genetic Programming desenvolvido com o sistema Oversee, a fim de lhe conceder capacidades preditivas. Adicionalmente, será realizado um processo de análise de desempenho a fim de determinar qual a ideal parametrização do algoritmo. Pretende-se com esta tese fornecer à Marinha Portuguesa uma ferramenta capaz de auxiliar o controlo da Zona Económica Exclusiva Portuguesa, permitindo a correta intervenção da Marinha em casos onde o atual sistema não conseguiria determinar a correta posição da embarcação em questão.

Instrumentos de responsabilidade social corporativa: desenvolvimento de um modelo de análise com aplicação ao setor do alojamento hoteleiro

O conceito de Responsabilidade Social Corporativa (RSC) reflete a necessidade das empresas desempenharem, a par da sua função primordial, funções importantes a nível das sociedades em que estão inseridas visando aumentar a sua contribuição para um mundo mais justo em termos económicos, sociais e ambientais. A Comissão Europeia (2004) define instrumentos como tendo o objetivo de ajudar as empresas a gerir os seus processos, sistemas e impactos, disponibilizando orientações e critérios de referência, apoiando as empresas na promoção da RSC e estabelecendo níveis mínimos de desempenho. Pretende-se nesta dissertação a criação e validação da aplicabilidade prática de um modelo de análise de instrumentos de RSC, adaptando e expandindo as propostas de classificação fornecidas pela literatura em diversidade e escala e dando origem a um modelo de análise para o setor do Alojamento Hoteleiro. Com este objectivo em mente foram compilados 347 instrumentos no modelo de análise elaborado, agrupados em cinco categorias diferentes, nomeadamente, Códigos de conduta, princípios e diretrizes; Sistemas de gestão e outros instrumentos de gestão de RSC; Índices bolsistas; Modelos de divulgação e comunicação; e Prémios e rankings. Foi verificada a sua validade e aplicabilidade prática com recurso à informação disponibilizada por uma amostra constituida por 31 empresas de de âmbito internacional, conseguida pela compilação dos seus relatórios de sustentabilidade publicados na base de dados online da Global Reporting Initiative (GRI). O estado de qualidade positiva da comunicação de temáticas de RSC através de indicadores GRI neste relatórios de sustentabilidade foi analisada e verificou-se inferior a 50%. Para a amostra de empresas de Alojamento Hoteleiro, a aplicação prática do modelo de análise foi validada com sucesso. Durante o teste da validação do modelo foi possivel obter alguns resultados que serão mencionados em seguida. A ordem das categorias do modelo de análise é coincidente com a ordem decrescente da frequência de utilização de instrumentos pela amostra. As frequências relativas mais altas verificaram-se em primeiro lugar em descritores da categoria Códigos de conduta, princípios e diretrizes, seguindo-se da categoria Sistemas de gestão e outros instrumentos de gestão de RSC de cariz ambiental. Parece, no entanto, existir uma falta de correspondência entre os indicadores requeridos pela GRI e avaliados na análise de qualidade dos relatórios e os dados práticos obtidos com a utilização de ferramentas de RSC. Um exemplo prático deste fenómeno vericou-se nos resultados destas duas categorias que obtiveram maiores frequências de utilização de instrumentos de RSC, pois estas foram também as que obtiveram piores resultados de qualidade de comunicação nos relatórios. Durante esta análise foi compilada uma listagem detalhada dos instrumentos mais utilizados em cada nível de análise de cada categoria do modelo.