New roles of Rab GTPases on eye diseases: targeting VEGF secretion

RESUMO: A retina é composta, entre outras estruturas, pelo epitélio pigmentar da retina (EPR)e pela coróide. A região central da retina denomina-se mácula, e é a zona mais afetada na degenerescência macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescência da retina. Nesta doença, a secreção de fatores de crescimento pelo EPR é afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condição. A família de proteínas Rab GTPases está envolvida nas vias intracelulares de sinalização e tráfego membranares, essenciais na transdução de sinais extracelulares em respostas biológicas. A sua crucial importância nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreção do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho é identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreção e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificação ajudará a esclarecer a patogénese da degenerescência macular da retina, e poderá servir para uma procura mais direcionada de novos agentes terapêuticos. A caracterização de dois modelos in vitro do EPR, células primárias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que são ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como protótipo do EPR por permitir o acesso a um número ilimitado de células. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizámos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os níveis proteicos das proteínas Rab GTPases, com base na tecnologia de ácido ribonucleico (ARN) de interferência. O papel das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma proteína, ou combinando várias, segundo a sua localização e funções intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as proteínas Rab GTPases são importantes intervenientes no processo de secreção de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocíticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interação destas proteínas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importância das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF pelas células do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alteração se relaciona com a degenerescência da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPE’s homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases’ family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins’ role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins’ function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins’ function. To scrutinize the consequences of Rab proteins’ absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins’ absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins’ role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins’ interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements’ unravel Rab proteins’ role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.

Enterococcus faecalis V583 prophages: Dynamic interactions and contribution to bacterial pathogenic traits

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology.

Production of bacterial biopolymers from industrial fat-containing wastes

Dissertation presented in partial fulfilment of the Requirements for the Degree of Master in Biotechnology

Dissecting the function of the SpoIIIJ and YqjG membrane protein insertases during bacterial spore development

Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Biology, Microbial Biology

Longitudinal evaluation of hemorheological markers in acute inflammatory diseases

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Assembly and function of a protein cross-linking enzyme during bacterial spore morphogenesis

Sporulation in Bacillus subtilis culminates with the formation of a dormant endospore. The endospore (or spore) is one of the most resilient cell types known and can remain viable in the environment for extended periods of time. Contributing to the spore’s resistance and its ability to interact with and monitor its immediate environment is the coat, the outermost layer of B. subtilis spores. The coat is composed by over 70 different proteins, which are produced at different stages in sporulation and orderly assembled around the developing spore.(...)

Characterization and regulation of a bacterial sugar phosphatase of the HAD superfamily, AraL, from Bacillus subtilis.

AraL from Bacillus subtilis is a member of the ubiquitous haloalkanoate dehalogenase, HAD, superfamily. The araL gene has been cloned, over-expressed in Escherichia coli and its product purified to homogeneity. The enzyme displays phosphatase activity, which is optimal at neutral pH (7.0) and 65 °C. Substrate screening and kinetic analysis showed AraL to have low specificity and catalytic activity towards several sugar phosphates, which are metabolic intermediates of the glycolytic and pentose phosphate pathways. Based on substrate specificity and gene context within the arabinose metabolic operon, a putative physiological role of AraL in detoxification of accidental accumulation of phosphorylated metabolites has been proposed. The ability of AraL to catabolise several related secondary metabolites requires regulation at the genetic level. Here, by site- directed mutagenesis, we show that AraL production is regulated by a structure in the translation initiation region of the mRNA, which most probably blocks access to the ribosome-binding site, preventing protein synthesis. Members of HAD subfamily IIA and IIB are characterised by a broad-range and overlapping specificity that anticipated the need for regulation at the genetic level. In this study we provide evidence for the existence of a genetic regulatory mechanism controlling AraL production.

A infecção por Helicobacter pylori em populações de Angola

RESUMO: A infecção por H. pylori, enquadra-se nas doenças infecciosas gastroduodenais e estima-se que mais de 50% da população mundial esteja infectada. A história natural da infecção por H. pylori, sofre interferências relacionadas com a genética do hospedeiro, a estirpe e as características da toxicidade da bactéria. Associam-se a estes factores, o tempo de exposição à infecção, assim como as condições sociais e higiéno-sanitárias. Paralelamente, o H. pylori é considerado o principal agente patogénico das doenças gastroduodenais. Este estudo teve como objectivo principal caracterizar a infecção por H. pylori em populações de Angola e sua avaliação como problema de Saúde Pública. Trata-se de um estudo prospectivo dirigido a dois grupos populacionais, um constituído por indivíduos aparentemente saudáveis, sem queixas gástricas específicas, em ambiente de comunidade, Grupo I, e outro, Grupo II, constituído por doentes que acorreram ao serviço de Gastrenterologia do Hospital Militar Principal de Luanda (HMP). No que diz respeito ao estudo na comunidade a pesquisa de H. pylori foi realizada pelo método ELISA de pesquisa de antigénios nas fezes. Por sua vez, a nível hospitalar, os métodos de diagnóstico da infecção por H. pylori foram: a endoscopia digestiva alta para a colheita de biópsias da mucosa gástrica destinadas ao exame anatomopatológico, ao exame citobacteriológico e aos métodos moleculares. Como método não invasivos foi utilizado o teste respiratório com ureia marcada. Grupo I: o diagnóstico da infecção por H. pylori, realizado pela pesquisa de antigénios deste microrganismo nas fezes, revelou uma frequência de 69,6% na população em estudo. Considerando em cada região, verificou-se que a região do Sambizanga possuía o valor mais elevado de frequência, 81,2%, seguida do Dinge com 79,5%, estatisticamente significativas (p 0,001). A avaliação da distribuição da frequência da infecção por grupo etário, revelou que os indivíduos com idade inferior a 15 anos, possuíam uma frequência de infecção de 63,5% e sendo de 76% nos indivíduos com idade superior a 15 anos. Este estudo permitiu concluir que a frequência da infecção por H. pylori nas regiões estudadas, é de 70% à excepção do Capulo, zona litoral em que não obstante as precárias condições de saneamento, a frequência da infecção por H. pylori é baixa. Grupo II: dos 309 doentes avaliados, verificou-se que 22 (7%), apresentavam uma mucosa normal e 287 (93%) uma mucosa alterada. A avaliação histológica das biópsias do antro, em 270 amostras de acordo com o Sistema de Sidney, em 235 (87,0%), revelou a presença de gastrite, 13 (4,8%) a presença de úlcera e em 9 (3,3%), uma lesão tumoral. A avaliação histológica da actividade nas 226 amostras do antro gástrico, verificou-se que 129 (57%) possuíam actividade e 97 (43%) não possuíam. O estudo das 255 biópsias do corpo, revelou em 212 (83,1%), a presença de lesões de gastrite, em 7 (2,7%), observaram-se lesões tumorais e 2 (0.8%) apresentaram úlcera. Dos 263 doentes avaliados histologicamente para pesquisa do H. pylori, 148 (58,2%) revelaram a presença positiva desta bactéria e 106 (41,7%) foram negativas. No que diz respeito à susceptibilidade aos macrólidos, do universo de 158 doentes com H. pylori positivo, 125 (79,1%) doentes apresentaram estirpes sensíveis aos macrólidos e 33 (20,9%) estirpes resistentes. Em relação aos factores de virulência, na avaliação conjunta dos dois factores de virulência estudados (cagA e vacA), em relação ao tipo de lesões encontradas na mucosa gástrica, verificou-se que dos 11 doentes com úlcera, 7 (63,6%), apresentavam uma estirpe cagA negativa, sendo 6 vacA s1 (85,7%), uma s2 e 4 (36,3%) com uma estirpe cagA positiva e vacA s1. Por sua vez dos 2 doentes com tumor, ambas as estirpes eram cagA negativas, sendo uma vacA s1 e outra vacA s2. Em relação aos factores de virulência nos doentes aos quais se diagnosticou úlcera e tumor apresentavam estirpe cagA negativa, vacAs1. Em relação ás lesões gástricas inflamatórias, os doentes com gastrite apresentavam cagA positivo. Do presente trabalho, em atenção aos resultados obtidos no que concerne a prevalência em populações sem queixas gastrenterológicas, recomenda-se que o mesmo se possa vir a replicar numa abrangência maior, realizando-se, por exemplo, estudos comparativos de prevalência entre as populações residentes no litoral (beira-mar) e as do interior. Pelas características genotípicas de H. pylori, em correspondência com as lesões encontradas, após novos estudos mais abrangentes, recomenda-se a avaliação de uma terapêutica mais acessível para o doente e que seja de maior eficácia. Face à escassez de médicos especialistas em gastrenterologia em Angola e de meios de diagnóstico, recomenda-se um estudo mais alargado da eficácia do seguimento do doente dispéptico, conforme protocolo avaliado pelo Colégio da Especialidade de Gastrenterologia da Ordem dos Médicos de Angola e já em prática em algumas instituições de saúde.--------------------------- ABSTRACT: H.pylori infection, is part of the gastroduodenal infectious diseases and it is estimated that over 50% of the world population is infected. The natural history of H.pylori infection, is influenced by host genetic, strain type, of bacterial virulence factors, time of exposure to the infection, as well as social and hygienic-sanitary conditions. In parallel, H.pylori is considered the main pathogen of gastroduodenal diseases. This study's main objective was to characterize H.pylori infection in populations of Angola and its evaluation as a public health problem. This is a prospective study conducted in two population groups, one in community environment composed by healthy individuals without specific gastric complaints - Group I, and Group II consisting of patients who went to the Gastroenterology Service of the Hospital Military of Luanda (HMP). As regards to the study in the community detection of H.pylori was carried out by antigen search in faeces using ELISA method. At hospital level H.pylori infection diagnostic methods were: upper gastrointestinal endoscopy to obtain gastric mucosal biopsies for histology, culture and molecular methods. As a non-invasive breath test with labelled urea was used. Group I: the diagnosis of H.pylori infection, by antigens detection in faeces, revealed a frequency of 69.6% in the study population. Whereas in each region, it was found that the Sambizanga region had the highest frequency of positive cases, 81.2% , followed by Dinge with 79.5%, Funda with 78.7 and Capulo with 39.8% being differences statistically significant (p=0.001). The evaluation of the distribution of the infection frequency by age group, revealed that individuals younger than 15 years had a frequency of 63.5% and in individuals older than 15 years, 76%. This study showed that the frequency of H.pylori infection in the regions studied was 70% exception due to Capulo, a coastal zone where despite the poor sanitation conditions; the frequency of H.pylori infection is lower. Group II: from the 309 patients evaluated, it was found that 22 (7%) had a normal mucosa and 287 (93%) a modified mucosa. Histological evaluation of antrum biopsies in 270 samples according to the Sydney System revealed the presence of gastritis in 235 (87.0%), the presence of ulcers in 13 (4.8%) and a tumour in 9 (3 3%). Histological assessment of activity in the gastric antrum of 226 samples, revealed that 129 (57%) had activity and 97 (43%) did not. The evaluation of the 255 corpus biopsies showed in 212 (83.1%), the presence of lesions of gastritis, in 7 (2.7%) tumour lesions and in 2 (0.8%) an ulcer. Of the 263 patients histological evaluated for H.pylori, 148 (58.2%) revealed the presence of this bacteria and 106 (41.7%) were negative. As regards susceptibility to macrolides from the universe of 158 patients with H.pylori, 125 (79.1%) patients had macrolides susceptible strains and 33 (20.9%) resistant strains. Regarding virulence factors (vacA and cagA), it was found that from the 11 patients with ulcers, 7 (63.6%), had a cagA negative strain, being 6 vacA s1, (85.7%) one vacA s2 and 4 (36.3%) with a cagA positive strain vacA s1. Concerning the 2 patients with tumour, both strains were cagA negative, one vacA s1 and other vacA s2. Patients with ulcer and tumour had cagA negative strains vacAs1. From this work, considering the prevalence of H.pylori obtained in health population, it is recommended that the same study should be performed in larger scale to confirm these results. The results of H.pylori genotyping suggest that more comprehensive studies are needed. Given the reduce number gastroenterology specialist in Angola and the lack of diagnostics methods, we recommend a larger study of the effectiveness of follow-up the patient dyspeptic, according to the protocol assessed by the College of Gastroenterology Specialty of the Order of Doctors and Angola already in place in some health institutions.

Princípios de terapêutica antibiótica na doença crítica

RESUMO: A infeção é frequente durante a doença crítica, quer como causa da doença crítica quer como complicação da sua evolução. Paradoxalmente, os avanços da medicina moderna aumentaram eles próprios o risco de infeção, ao permitir a sobrevida até idades avançadas, ao criar um novo grupo de doentes imunodeprimidos, nomeadamente doentes tratados com fármacos que interferem com as suas defesas naturais (corticóides, citostáticos), ao aumentar o tempo de vida de hospedeiros com comorbilidades debilitantes. Os antibióticos são um dos elos essenciais no tratamento da infeção. Contudo o seu uso também promove a seleção e crescimento de bactérias resistentes. Para além disso as doses convencionais de antibióticos foram selecionadas numa altura em que a resistência era um fenómeno raro e podem não ser atualmente as mais adequadas. Existe hoje muita evidência acumulada que os doentes críticos sofrem alterações da sua farmacocinética (PK) que podem facilitar a ocorrência de falência terapêutica ou de toxicidade tanto por sub como por sobredosagem de antibióticos. Essas alterações são complexas e difíceis de estudar. Finalmente, também a farmacodinâmica (PD) dos antibióticos pode estar alterada nesta população, podendo haver necessidade de ajustar os alvos terapêuticos de forma individual. O objetivo deste trabalho foi investigar a relação entre a terapêutica antibiótica, as suas características PK e PD, a carga bacteriana e o prognóstico dos doentes críticos. O plano de investigação incluiu: 1. Dados da epidemiologia portuguesa de doentes críticos com infeção; 2. Avaliação da relação entre a carga bacteriana, o tempo até ao início do tratamento antibiótico e o prognóstico dos doentes críticos; 3. Avaliação da evolução da PK durante o tratamento da infeção; 4. Um estudo multicêntrico para avaliação da eficácia da terapêutica com um β- lactâmico doseado de acordo com a relação PK/PD. Na introdução é descrita a importância dos antibióticos, a sua origem e o problema crescente das resistências bacterianas relacionadas com o seu emprego e abuso. É salientada a importância de racionalizar a posologia, de acordo com os conceitos de PK e de PD. No Capítulo 1 são apresentados dados de epidemiologia portuguesa de infeção em doentes críticos, sobretudo retirados de dois estudos prospetivos, observacionais, os quais incluíram mais de 50% da capacidade de internamento em cuidados intensivos existente em Portugal. No Capítulo 2 são descritos os conceitos de PK e as suas alterações nos doentes críticos. De seguida são revistos os conceitos de PD de antibióticos e a sua aplicação a esta população, em particular durante as infeções graves (Capítulo 3). Nos capítulos seguintes são aprofundadas estas alterações da PK nos doentes críticos e as suas causas, de forma a destacar a importância da monitorização da concentração dos antibióticos. São apresentados os dados duma revisão sistemática de PK de antibóticos nesta população (Capítulo 4), pormenorizadas as alterações da PD que comprometem a eficácia da terapêutica antibiótica, facilitam o desenvolvimento de resistências e podem levar a falência terapêutica (Capítulo 5). Consequentemente a compreensão global destas alterações, da sua relevância clínica e a revisão da evidência disponível facilitou o desenvolvimento do próprio plano global de investigação (Capítulos 6 e 7). No Capítulo 6.1 são descritos os antibióticos tempo-dependente e a importância de aumentar o seu tempo de perfusão. Foi desenhado um estudo multicêntrico para comparar a eficácia e segurança da perfusão contínua da piperacilina tazobactam (um antibiótico β-lactâmico associado a um inibidor de β-lactamases) com a mesma dose do antibiótico, administrado em dose convencional, intermitente. A importância de dosear corretamente os antibióticos concentração-dependente foi também avaliada num estudo a primeira dose dos aminoglicosídeos (Capítulo 6.2). Outras estratégias para melhorar os resultados assistenciais dos doentes infetados são abordadas no Capítulo 7, em particular a importância da terapêutica antibiótica precoce, a avaliação da carga bacteriana e a compreensão da variação da PK ao longo do tratamento da infeção. Foi desenvolvido um algoritmo de abordagem terapêutica que incluiu estas alterações da PK e da PD nos doentes críticos. Finalmente no Capítulo 8 são descritos mecanismos de desenvolvimento das resistências bacterianas bem como estratégias para a sua abordagem. O Capítulo final (Capítulo 9) aponta um plano para futuras áreas de trabalho. O elemento chave identificado neste trabalho de investigação é o reconhecimento da variabilidade significativa da PK dos antibióticos durante a doença crítica, a qual condiciona a sua posologia. Estas alterações estão relacionadas com a própria gravidade da doença e tendem a diminuir ao longo do seu tratamento. No entanto nem a gravidade da doença nem as características individuais as permitem prever de forma aceitável pelo que a utilização duma posologia universal, independente da situação clínica concreta, pode ser inadequada. As estratégias para melhorar os resultados assistenciais dos doentes críticos infetados devem ser baseadas na individualização da posologia antibiótica de acordo com os princípios da PK e da PD, preferencialmente apoiadas em doseamentos da sua concentração. ------------------------------------ ABSTRACT: Infection commonly occurred during critical illness, either as a cause or complicating the course of the disease. Advances in medicine had paradoxically increase the risk of infection, both by improving survival to older ages and by introducing a new group of immunosuppressed patients, those who are treated with drugs that interfere with their natural defenses (corticosteroids, cytostatics) and those who survived longer with aggressive diseases. Antibiotics are of paramount importance for treating infection. However the use of these drugs also promote the selection and growth of resistant bacteria. Furthermore conventional antibiotic doses were calculated for less severe patients during a time when resistance was rare. Nowadays there is increasing evidence that critically ill patients experiment altered pharmacokinetics (PK) that may lead to therapeutic failure and/or drug toxicity. Equally, such PK alterations are complex and challenging to investigate. Finally pharmacodynamics (PD) may also be different in this population and antibiotic targets may need to be tailored to the individual patient. The aim of this research was to investigate the relationship between antibiotic therapy, its PK and PD, bacterial burden and critically ill patients outcomes. The research plan comprised of: 1. Epidemiological portuguese data of critically ill infected patients; 2. Relationship between burden of bacteria, time until the start of antibiotics and patient outcomes; 3. Evaluation of PK during treatment of infection; 4. A multicentre study evaluating PK guided β-lactam therapy. The introductory chapter outlines the importance of antibiotics, its origins, the problem of increasing bacteria resistance, related to its use and overuse and the importance of rational drug dosing using PK and PD concepts. In Chapter 1 portuguese epidemiological data of infections in critically ill patients is presented, mostly coming from two prospective observational studies, encompassing more than 50% of critically ill beds available in Portugal. Chapter 2 describes the concepts of PK and the changes occurring in critically ill patients. This is followed by a review of the concepts of PD of antibiotics and its application to this population, especially during severe infections (Chapter 3). In the following chapter these changes in antibiotics PK in critical illness are and its causes are detailed, to outline the importance of therapeutic drug monitoring. Data on a systematic review of antibiotics PK in those patients is provided (Chapter 4). The following chapter (Chapter 5) elucidates important changes in PD, that compromises antibiotic therapy, facilitate the occurrence of resistance and may lead to therapeutic failure. Thus, an understanding of the clinical problem and available evidence facilitated the development of a comprehensive research plan (Chapter 6 and Chapter 7). Chapter 6.1 describes time-dependent antibiotics and the importance of extending its perfusion time. A multicenter study was designed to compare the continuous infusion of piperacillin tazobactam (a β-lactam antibiotic) with the same daily dose, prescribed in a conventional, intermittent dose. The importance of correct dosing of antibiotics was also assessed through a study addressing aminoglycoside (a concentration-dependent antibiotic) therapy (Chapter 6.2), focusing on its first dose. Strategies to improve severe infected patients outcomes were addressed in Chapter 7, namely the importance of early antibiotic therapy, assessing the burden of bacteria and understanding changes in antibiotic concentration during the course of infection. An algorithm to include all the described changes in both PK and PD of critically ill patients was developed. Finally in Chapter 8 mechanisms of the increasing resistance of bacteria are described and strategies to address that problem are proposed. The closing chapter (Chapter 9) lays a roadmap for future work. The key finding of this research is the significant variability of the antibiotics PK during critical illness, which makes dosing a challenging issue. These changes are related to the severity of the infection itself and improve through the course of the disease. However neither disease severity nor individual characteristics are useful to predict PK changes. Therefore, the use of a universal dose approach, regardless of the individual patient, may not be the best approach. Strategies to improve patients’ outcomes should be based on tailoring antibiotics to the individual patient, according to PK and PD principles, preferentially supported by therapeutic drug monitoring.