Study of in vivo interactions between penicillin-binding proteins of Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a major human pathogen that has acquired resistance to practically all classes of β-lactam antibiotics, being responsible of Multidrug resistant S. aureus (MRSA) associated infections both in healthcare (HA-MRSA) and community settings (CA-MRSA). The emergence of laboratory strains with high-resistance (VRSA) to the last resort antibiotic, vancomycin, is a warning of what is to come in clinical strains. Penicillin binding proteins (PBPs) target β-lactams and are responsible for catalyzing the last steps of synthesis of the main component of cell wall, peptidoglycan. As in Escherichia coli, it is suggested that S. aureus uses a multi-protein complex that carries out cell wall synthesis. In the presence of β-lactams, PBP2A and PBP2 perform a joint action to build the cell wall and allow cell survival. Likewise, PBP2 cooperates with PBP4 in cell wall cross-linking. However, an actual interaction between PBP2 and PBP4 and the location of such interaction has not yet been determined. Therefore, investigation of the existence of a PBP2-PBP4 interaction and its location(s) in vivo is of great interest, as it should provide new insights into the function of the cell wall synthesis machinery in S. aureus. The aim of this work was to develop Split-GFPP7 system to determine interactions between PBP2 and PBP4. GFPP7 was split in a strategic site and fused to proteins of interest. When each GFPP7 fragment, fused to proteins, was expressed alone in staphylococcal cells, no fluorescence was detectable. When GFPP7 fragments fused to different peptidoglycan synthesis (PBP2 and PBP4) or cell division (FtsZ and EzrA) proteins were co-expressed together, fluorescent fusions were localized to the septum. However, further analysis revealed that this positive result is mediated by GFPP7 self-association. We then interpret the results in light of such event and provide insights into ways of improving this system.

A segurança alimentar no consumo de pescado cru com valência para a produção de sushi

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Tecnologia e Segurança Alimentar, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Caracterização de dois novos tipos de centros ferro-enxofre em duas proteínas isoladas de bactérias redutoras de sulfato (desulfovibrio gigas NCIB 9332)

Tese apresentada para obtenção do grau de Doutor

Unravelling novel modes of antimicrobial action

Dissertation presented to obtain the Ph.D. degree in Biochemistry at the Instituto de Tecnologia Química e Biológica, Universidade Nova de Lisboa

Implementação do método de suspensão quantitativa para avaliar a actividade bactericida de desinfectantes químicos, de acordo com a Norma Europeia EN 1040

As bactérias patogénicas presentes nos sistemas de processamento de alimentos podem ser potencialmente causadoras de doenças alimentares graves, quando sobrevivem à acção bactericida de desinfectantes. Esta acção depende da eficácia das substâncias activas que fazem parte da formulação do desinfectante e das condições ambientais onde se processa a interacção desinfectante – bactéria, sendo ainda específica para cada estirpe bacteriana. Este trabalho teve, como propósito, a implementação de um método que permita avaliar, in vitro, a eficácia bactericida de desinfectantes comerciais contra estirpes bacterianas que são potencialmente causadores de doenças de origem alimentar. A eficácia do desinfectante foi avaliada seguindo a Norma EN1040 e aplicando o método de diluição-neutralização. Para além das estirpes recomendadas naquele documento normativo, nomeadamente, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, foram também utilizadas Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes. Os desinfectantes foram seleccionados com base nas suas formulações, tendo sido escolhidos desinfectantes cujos princípios activos são, respectivamente: tensioactivos aniónicos; alcalis inorgânicos; hidrocloreto de biguanida polimérica; álcool etoxilado ou cloreto benzalcónio. Foram seleccionados como neutralizantes: tampão fosfato, tiosulfato de sódio, gema de ovo fresca e polisorbato 80 com histidina. Após cada ensaio, o número de bactérias sobreviventes foi obtido pelo cálculo da redução logarítmica decimal, a partir do número de unidades formadoras de colónia presentes em cada placa. A eficácia do desinfectante, na inactivação de cada estirpe alvo, foi classificada numa escala de redução logarítmica à qual 5 log corresponde a redução mínima aceitável do número de colónias quando o tempo de contacto é de 5 minutos, e a temperatura do ensaio é 20ºC. Conclui-se que o método de diluição-neutralização é sensível para todas as estirpes testadas. A gema de ovo fresca revelou ser o melhor neutralizante para desinfectantes contendo tensioactivos aniónicos, enquanto o tampão fosfato é mais adequado para neutralizar desinfectantes contendo alcalis inorgânicos. Porém, nenhum dos neutralizantes testados mostrou ser adequado para os desinfectantes contendo cloreto de benzalcónio ou hidrocloreto biguanida polimérica ou álcool etoxilado. Conclui-se também que as condições laboratoriais implementadas são as adequadas para testar a acção bactericida de desinfectantes utilizados em sistemas de processamento de alimentos.

Biological activity of well defined hydantoin derivatives on efflux pump systems of bacteria and cancer cells

A multi-resistência a antibióticos e medicamentos usados em quimioterapia é um dos grandes problemas com os quais as instituições de saúde se debatem hoje em dia. A acção provocada por bombas de efluxo é uma das suas causas. Estas bombas têm uma importância fundamental, uma vez que, ao expelirem todo o tipo de tóxicos para o exterior das células, também expelem medicamentos, fazendo com que estes não tenham o efeito desejado dentro delas. As bombas de efluxo são transportadores que se encontram nas membranas de todo o tipo de células. Existem dois grandes tipos de bombas de efluxo: as primárias e as secundárias. As primeiras conferem multi-resistência principalmente em células eucariotas, como as células do cancro em humanos, tendo como função a mediação da repulsa de substâncias tóxicas por intermédio da hidrólise de ATP. A primeira a ser descoberta e mais estudada destas bombas foi a ABCB1 que é o gene que codifica a glicoproteína-P (P de permeabilidade). Enquanto as secundárias, que são a maior fonte de multi-resistência em bactérias, promovem a extrusão de substâncias tóxicas através da força motriz de protões. Neste tipo de bombas são conhecidas quatro famílias principais, das quais uma das mais importantes é a superfamília RND, uma vez que inclui a bomba AcrAB-TolC, que é muito importante no metabolismo xenobiótico de bactérias Gramnegativas, nomeadamente a E.coli. Com o objectivo de reverter a multi-resistência, tanto em células eucariotas como procariotas, têm-se desenvolvido estratégias de combate que envolvem a descoberta de substâncias que inibam as bombas de efluxo. Assim sendo, ao longo dos tempos têm sido descobertas variadas substâncias que cumprem este objectivo. É o caso, por exemplo, dos derivados de fluoroquinolonas usados como inibidores de bombas de efluxo em bactérias ou do Tamoxifen, utilizado na terapia de pacientes com cancro da mama. Um dos grupos de substâncias estudados para o desenvolvimento de possíveis compostos que actuem como reversores de multi-resistência são os compostos derivados de hidantoínas. Estes, são conhecidos por possuírem uma grande variedade de propriedades bioquímicas e farmacológicas, sendo portanto usados para tratarem algumas doenças em humanos, como a epilepsia. Nestes, estão englobados compostos com actividade anti-convulsão que constitui a sua grande mais-valia e, dependente da substituição no anel que os constitui, uma grande variedade de outras propriedades farmacológicas como a anti-fungica, a anti-arritmica, a anti-viral, a anti-diabética ou por exemplo a antagonização de determinados receptores, como os da serotonina. Apesar de pouco usados em estudos experimentais para desenvolver substâncias anti-carcinogénicas, existem alguns estudos com este efeito. Objectivos: O presente projecto envolve o estudo de bombas de efluxo primárias e secundárias, em células eucariotas e procariotas, respectivamente. Em bactérias, foram usados quatro modelos experimentais: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, E. coli AG 100 e Salmonella Enteritidis NCTC 13349. Em células de cancro foram usadas, células T de linfoma de rato parentais e células T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1. O principal objectivo deste estudo foi a pesquisa de novos moduladores de bombas de efluxo presentes em bactérias e células do cancro, tentando assim contribuir para o desenvolvimento de novos agentes farmacológicos que consigam reverter a multi-resistência a medicamentos. Assim sendo foram testados trinta compostos derivados de hidantoínas: SZ-2, SZ-7, LL-9, BS-1, JH-63, MN-3, TD-7k, GG-5k, P3, P7, P10, P11, RW-15b, AD-26, RW-13, AD-29, KF-2, PDPH-3, Mor-1, KK-XV, Thioam-1, JHF-1, JHC-2, JHP-1, Fur-2, GL-1, GL-7, GL-14, GL-16, GL-18. Como forma de atingir estes objectivos, a actividade biológica dos trinta compostos derivados de hidantoínas foi avaliada nas quatro estirpes de bactérias da seguinte forma: foram determinadas as concentrações mínimas inibitórias dos trinta compostos como forma de definir as concentrações em que os compostos seriam utilizados. Os compostos foram posteriormente testadas com um método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo, que é um substrato comum em bombas de efluxo bacterianas, desenvolvido por Viveiros et al. A actividade biológica dos compostos derivados de hidantoínas nas células de cancro foi demonstrada por diferentes métodos. O efeito anti-proliferativo e citotóxico dos trinta compostos foi avaliado nas células T de linfoma de rato transfectadas com o gene humano MDR-1 pelo método de thiazolyl de tetrazólio (MTT). Como o brometo de etídeo também é expelido pelos transportadores ABC, estes compostos foram posteriormente testados com um método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo desenvolvido por Spengler et al nos dois diferentes tipos de células eucariotas. Resultados: A maioria dos compostos derivados de hidantoínas foi eficaz na modulação de bombas de efluxo, nas duas estirpes de bactérias Gram-negativas e nos dois diferentes tipos de células T de linfoma. Em contraste com estes resultados, nas duas estirpes de células Gram-positivas, a maioria dos compostos tiveram pouco efeito na inibição de bombas de efluxo ou até nenhum, em muitos dos casos. De uma maneira geral os melhores compostos nas diferentes estirpes de bactérias foram: Thioam-1, SZ-2, P3, Rw-15b, AD-26, AD-29, GL-18, GL-7, KF-2, SZ-7, MN-3, GL-16 e GL- 14. Foram portanto estes os compostos que provocaram maior acumulação de brometo de etídeo, inibindo assim com maior eficácia as bombas de efluxo. No presente estudo, a maioria dos compostos conseguiu inibir a resistência provocada pela bomba de efluxo ABCB1, tanto nas células parentais bem como nas células que sobre-expressam esta bomba, causando a acumulação de brometo de etídeo dentro das células. As células que sobreexpressam a bomba ABCB1 foram posteriormente testadas com citometria de fluxo que é a técnica padrão para pesquisa de inibidores de bombas de efluxo. Os compostos que foram mais efectivos na inibição da bomba ABCB1, causando assim maior acumulação de brometo de etídeo nas células que sobre-expressam esta bomba foram: PDPH-3, GL-7, KK-XV, AD-29, Thioam-1, SZ-7, KF-2, MN-3, RW-13, LL-9, P3, AD-26, JH-63 e RW- 15b. Este facto não corroborou totalmente os resultados da citometria de fluxo uma vez que os moduladores que provocaram maior inibição da bomba ABCB1 foram o MN-3, JH-63 e o BS-1, sendo que o último não foi seleccionado como um bom composto usando o método fluorométrico de acumulação de brometo de etídeo. Conclusão: Os compostos derivados de hidantoínas testados tiveram maior efeito nas estirpes de bactérias Gram-negativas do que nas Gram-positivas. Relativamente às células eucariotas, as estruturas mais activas apresentam substituintes aromáticos bem como alguns fragmentos aminicos terciários.

Desenvolvimento de uma cobertura para feridas baseada em nanofíbras de iodopovidona

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Genetic diversity of arginine catabolic mobile element in Staphylococcus epidermidis

PLos One, 4(11): ARTe7722

Update on the population structure of MRSA causing infection in a central hospital and in healthcare centers in Portugal

RESUMO:Staphylococcus aureus é um dos principais agentes patogénicos humanos, sendo frequentemente associado a infecções nosocomiais e infecções na comunidade. A prevalência de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) em hospitais portugueses é uma das mais elevadas da Europa e tem sido caracterizada extensivamente; contrariamente, a prevalência e epidemiologia de MRSA na comunidade em Portugal não tem sido devidamente seguida. Com o objectivo de compreender as causas possíveis do aumento na frequência de MRSA num dos maiores hospitais centrais portugueses (HSM) ao longo de 17 anos, isolados de MRSA recolhidos em 1993 (n=54) e 2010 (n=180) de pus, sangue e urina foram analisados por PFGE, MLST, tipagem do spa e tipagem de SCCmec. Os resultados mostraram que ocorreu uma mudança global nos tipos clonais predominantes, onde o clone ST22-IVh substituiu os clones, ST239-IIIvar e ST247-I, representando mais de 70% da população actual. Além disso, entre 1993 e 2010 verificou-se um aumento na diversidade genética dos tipos clonais de MRSA. Para determinar a frequência e a natureza clonal de MRSA e S. aureus sensíveis à meticilina (MSSA) isolados de infecções de pele e tecidos moles (SSTI) em pessoas que frequentam centros de saúde em Portugal, 73 amostras foram recolhidas em nove centros de saúde (Rede Médicos Sentinela). Isolou-se um total de 40 S. aureus (55%), dos quais 17,5% eram MRSA. Os isolados de MRSA pertenciam aos clones ST22-IVh (n=4), ST5-IVc (n=2) e ST105-II (n=1), que foram descritos neste estudo como sendo clones de origem hospitalar. Os nossos resultados sugerem que o aumento da frequência de MRSA no HSM pode estar associado à emergência de um clone de MRSA com maior capacidade epidémica. Além disso, verificámos que a principal causa de SSTI em pessoas que frequentam centros de saúde em Portugal são MRSA de origem hospitalar e não MRSA associados à comunidade.------ABSTRACT: Staphylococcus aureus is one of the most important human pathogens, being a major cause of infections worldwide both in the hospital and in the community. In Portugal, the prevalence of methicillin resistant S. aureus (MRSA) in hospitals is one of the highest in Europe and has been characterized extensively; contrarily the prevalence and epidemiology of MRSA in the community has not been followed in a meaningful way. To understand the epidemiological events that could explain a steep increase in MRSA frequency in a major Portuguese central hospital (HSM) within a 17 year period, two MRSA collections recovered in 1993 (n=54) and 2010 (n=180) from pus, blood and urine were analyzed by PFGE, MLST, spa and SCCmec typing. The results showed that a major clonal shift occurred, wherein ST22-IVh clone has replaced the previous ST239-IIIvar and ST247-I clones and accounts for more than 70% of the present population. Moreover, an increase in genetic diversity of MRSA clonal types was observed between the two study periods. With the aim of determining the frequency and clonal nature of MRSA and methicillin-susceptible S. aureus (MSSA) causing skin and soft tissue infections (SSTI) in patients attending healthcare centers in Portugal, 73 samples were collected from nine healthcare centers (Medicos Sentinela Network). A total of 40 S. aureus were isolated, accounting for 55% of the SSTI, of which 17.5% were MRSA. MRSA isolates belonged to ST22-IVh (n=4), ST5-IVc (n=2) and ST105-II (n=1) that have also been described in the hospital in an equivalent period. Our results suggest that the increase in MRSA frequency in HSM may be associated to the emergence of a MRSA clone with higher epidemic potential. Moreover, we propose that the spillover of MRSA from the hospital rather than community-associated-MRSA was the main cause of SSTI in persons attending healthcare centers in Portugal.

Pesquisa de novos metabolitos secundários bioactivos em bactérias de sedimentos marinhos

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

The role of Di-iron proteins in pathogen resistance

Dissertation presented to obtain the Ph.D. degree in Biochemistry

Prevalência de infecção numa população de hemodialisados, em ambiente clínico

RESUMO: Foram estudados, numa análise retrospectiva, 1689 doentes com insuficiência renal crónica (IRC), pertencentes a 11 clínicas de hemodiálise, num período de 1 Janeiro de 2009 a 1 de Janeiro de 2012 (três anos). Utilizaram-se os dados clínicos desses doentes relativos a amostras de hemoculturas, exsudados purulentos e urinas assépticas, de forma a caracterizar os microorganismos existentes e relacionou-se com alguns dados demográficos. Os doentes do sexo masculino estiveram sempre em maior número pelo que também possuíam a maior média de idades nos vários casos. O presente estudo observou que cerca de metade da população em estudo que se encontra em HD possui menos de 68 anos. Na análise aos dados das hemoculturas confirmou-se que o S.aureus é o microrganismo predominante dos casos de infecção, embora exista uma grande diversidade de microorganismos. Verificou-se também, que quanto maior a idade do doente maior é probabilidade de contrair uma infecção. Os doentes que contraíram infecção foram em número similar, pelo que a sua distribuição por sexo também foi idêntica na infecção, mas não o era inicialmente. Para as amostras de hemoculturas, também se observou que quanto maior é a dimensão da clínica (número de doentes), maior é o número de infecções. Embora esta heterogeneidade já tenha sido descrita para outros países, demonstra que possivelmente existe uma oportunidade de nivelar as clínicas pelas melhores clínicas de forma a obter ganhos em saúde. Nas amostras de exsudados purulentos, o microrganismo mais frequente foi S.aureus, observando-se que com o aumento da idade aumenta também o número de infecções. A distribuição por sexo de doentes com e sem infecção foi semelhante. Nas urinas assépticas o microorganismo predominante foi a E.coli. Mais uma vez se observou que com o aumento da idade aumenta o número de infecções. Na distribuição por sexo, os doentes do sexo feminino encontravam-se em maior número, pelo que também foi o género que mais infecções apresentou. Conclui-se que o padrão de microorganismos apresentado foi de encontro com o esperado, existindo uma grande diversidade de microorganismos nas amostras estudadas. Para além disso a heterogeneidade das clínicas apresenta uma oportunidade para um estudo mais aprofundado pelos profissionais interessados na organização e qualidade dos laboratórios de análises.----------ABSTRACT: This retrospective study involves 1689 patients with chronic kidney disease from 11 clinics, from January 1st 2009 to January 1st 2012 (3 years). The Clinical data used for these patients related to blood culture samples, aseptic urine and purulent exudates, in order to characterize the microorganisms within and its relationship to some demographic data. There was a higher number of male patients and their average age distribution was also wider. The present study observed that around half of the studied population that is in HD is below the age of 68 years. While analyzing the data from the blood cultures, it was confirmed that S. aureus is the predominant microorganism in infections, although a wide variety of microorganisms exists. It was also found that the greater the age of the patient, the greater is the probability of contracting an infection. Patients who contracted infection were in similar number so their gender distribution was also similar in infection, even though it was not so initially. For the blood culture samples, it was also observed that the greater the size of the clinic (number of patients), the greater the number of infections. Although this heterogeneity has already been described for other countries, it demonstrates that there is an opportunity to even all the clinics to the best, in order to obtain health gains. In the samples of purulent exudates, the most frequent microorganism was S. aureus, noting that, with increasing age, the number of infections also increases. The distribution of patients by sex with and without infection was similar. In aseptic urines the predominant microorganism was E.coli. Once again, it was observed the number of infections increases with age. In the distribution by gender, female patients were more numerous, and as such this gender suffered more infections. Overall, the pattern of microorganisms that was detected was as expected, with a registered large diversity in the studied samples. Furthermore, the heterogeneity of the clinics presents an opportunity for a more profound study to be undertaken by professionals interested in the quality and organization of clinical analysis laboratories.

Impregnação de fibras de celulose com nanopartículas de prata, óxido de zinco e óxido de cobre para aplicações anti-bacterianas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais

Avaliação de bacteriófagos com atividade antibacteriana em isolados provenientes de doentes com pneumonia associada ao ventilador

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Genética Molecular e Biomedicina

Structural investigation of the Bacillus subtilis morphogenic factor RodZ

A thesis to obtain a Master degree in Structural and Functional Biochemistry