Marketing plan for Gazela

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and Economics

Expressão e purificação da proteína E3 do vírus chikungunya (CHIKV)

RESUMO: O vírus chikungunya (CHIKV) é um vírus de RNA, com invólucro, da família Togaviridae, transmitido por mosquitos Aedes spp. Distribuído por largas regiões de África e Ásia, causa grandes epidemias de artrite grave. A semelhança de sintomas com outras doenças como a dengue e a malária e a persistência de IgM específicas, dificultam o diagnóstico da infeção por CHIKV. A deteção no sangue de E3, uma glicoproteína viral secretada, a incluir num ensaio imunoenzimático poderá melhorar o diagnóstico nos países onde as técnicas de biologia molecular são de difícil acesso. Para testar a utilidade de E3 num ensaio de diagnóstico, esta deverá ser expressa em quantidade, purificada e usada para produção de anticorpos específicos. Para expressar E3 numa forma solúvel, suscetível de ser purificada num único passo cromatográfico sem proteases, recorreu-se à estratégia da fusão com o domínio de ligação à quitina (CBD)-inteína (IMPACT™ System, NEB). A sequência codificadora de E3 foi amplificada a partir de RNA viral, clonada em pTYB21 e expressa em E. coli como uma proteína de fusão insolúvel de 64 kDa. A expressão a 12ºC induzida por IPTG 0,1 mM aumentou a solubilidade de CBD-inteína-E3. A aplicação de lisados celulares em colunas de quitina originou a retenção de CBD-inteína-E3 na matriz. Porém, a autoclivagem da inteína na coluna, induzida com reagentes tiol, foi pouco eficiente e mesmo a proteína E3 separada não eluiu da coluna. E3 foi ainda expressa em E. coli com uma cauda de seis histidinas (E3[His]6) por clonagem no vetor pET28b(+). Lisados celulares aplicados em colunas de níquel permitiram a eluição de uma proteína de 9 kDa, compatível com a massa molecular estimada para E3[His]6, ainda que com outros contaminantes proteicos. A identidade da proteína de 9 kDa será confirmada pela indução de anticorpos com esta preparação e reatividade daqueles com células infetadas com CHIKV.----------------ABSTRACT: Chikungunya virus (CHIKV) is an enveloped, positive strand RNA virus belonging to the family Togaviridae. Transmitted by Aedes spp mosquitoes, CHIKV causes large epidemics of severe arthritogenic disease in Africa and Asia and represents a serious threat in countries where vectors are present. Symptoms similarity with other diseases, e.g. dengue and malaria, along with CHIKV IgM persistence turns accurate CHIKV diagnosis a difficult task in low-income countries. Detection of E3, a small secreted viral glycoprotein, to be included in an immunoenzymatic test was envisaged as a possible improvement in CHIKV diagnosis. To test the diagnostic value of E3, recombinant E3 should be expressed and purified to generate antibodies. In order to express CHIKV E3 in a soluble form amenable to purification by a single step affinity chromatography, the chitin binding domain (CBD)-intein fusion strategy without proteases (IMPACT™ System, NEB) was employed. The E3 coding sequence was amplified from viral RNA, cloned in pTYB21 and expressed in E. coli ER2566 as an insoluble 64 kDa CBD-intein-E3 fusion protein. Solubility was partially achieved by lowering the expression temperature to 12ºC and the inducer (IPTG) concentration to 0.1 mM. Clarified cell lysate loaded onto a chitin column allowed ligation of the fusion protein but the intein-mediated cleavage efficiency was low and E3 failed to elute from the column as demonstrated by SDS-PAGE. E3 was further expressed with a six histidine tag, E3[His]6, employing the pET System (Novagen). E3[His]6 was expressed in E. coli Rosetta (30ºC, 0.4 mM IPTG) as a 9 kDa protein. Soluble cell extracts in 20-40 mM imidazole, applied onto a nickel column and eluted with 500 mM imidazole yielded a protein preparation enriched in the 9kDa protein. The 9 kDa will be used as antigen to generate antibodies that upon reaction with CHIKV infected cells will confirm its identity.

Sensitivity correction of images obtained with the prototype Clear-PEM in pre-clinical environment

Dissertation presented at Faculdade de Ciências e Tecnologia Universidade Nova de Lisboa to obtain a Master Degree in Biomedical Engineering

Mapeamento do perfil metabólico cerebral em indivíduos normais e com patologias do sistema nervoso central

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Transimpedance amplifier for early detection of breast cancer

Breast cancer is the most common type of cancer worldwide. The effectiveness of its treatment depends on early stage detection, as well as on the accuracy of its diagnosis. Recently, diagnosis techniques have been submitted to relevant breakthroughs with the upcoming of Magnetic Resonance Imaging, Ultrasound Sonograms and Positron Emission Tomography (PET) scans, among others. The work presented here is focused on studying the application of a PET system to a Positron Emission Mammography (PEM) system. A PET/PEM system works under the principle that a scintillating crystal will detect a gamma-ray pulse, originated at the cancerous cells, converting it into a correspondent visible light pulse. The latter must then be converted into an electrical current pulse by means of a Photo- -Sensitive Device (PSD). After the PSD there must be a Transimpedance Amplifier (TIA) in order to convert the current pulse into a suitable output voltage, in a time period lower than 40 ns. In this Thesis, the PSD considered is a Silicon Photo-Multiplier (SiPM). The usage of this recently developed type of PSD is impracticable with the conventional TIA topologies, as it will be proven. Therefore, the usage of the Regulated Common-Gate (RCG) topology will be studied in the design of the amplifier. There will be also presented two RCG variations, comprising a noise response improvement and differential operation of the circuit. The mentioned topology will also be tested in a Radio-Frequency front-end, showing the versatility of the RCG. A study comprising a low-voltage self-biasing feedback TIA will also be shown. The proposed circuits will be simulated with standard CMOS technology (UMC 130 nm), using a 1.2 V power supply. A power consumption of 0.34 mW with a signal-to-noise ratio of 43 dB was achieved.

Polímeros electrocrómicos confinados em sistemas mesoporosos

Esta dissertação teve como principal objectivo a síntese de materiais híbridos constituídos por polímeros electrocrómicos incorporados em sílicas mesoporosas e nanotubos de carbono. Esses materiais foram utilizados na construção de dispositivos electrocrómicos que foram caracterizados por voltametria cíclica e espectroelectroquímica. Foram sintetizados os polímeros poli (3,4-(2-etilhexiloxi)-tiofeno (P1), poli (3,4-(2-etilhexiloxi)-tiofeno-co-(3,4-dimetoxi)-tiofeno (P2), poli (3,4-(etilenodioxi)-tiofeno (P3) e o polímero Poli (3-metil)-tiofeno (P4) de maneira a serem utilizados como modelo. Os polímeros foram caracterizados por 1H-RMN e/ou Infravermelho e análise elementar. Posteriormente foram impressos em eléctrodos de PET-ITO ou vidro-FTO, caracterizados e construídos dispositivos electrocrómicos de acordo com o know-how da empresa Ynvisible®. Os materiais híbridos foram sintetizados utilizando o método ship-in-a-bottle. O material híbrido H3 (PEDOT@MCM-41) foi obtido de maneira análoga ao polímero P3 (PEDOT) utilizando 10 equivalentes de catalisador após optimização. Este material híbrido foi depositado em eléctrodos de vidro-FTO, construídos dispositivos electrocrómicos e caracterizados de maneira a comparar com o polímeros previamente sintetizados. Comparando o desempenho do polímero com o seu respectivo híbrido é possível observar um aumento de eficiência de coloração do material híbrido relativamente ao dispositivo com o polímero livre. Os dispositivos do material H3, na experiência de durabilidade, mantiveram-se funcionais durante 10000 ciclos comparativamente a 2000 ciclos dos dispositivos com PEDOT. Na experiência de SEM do material híbrido H3 foi possível observar uma grande quantidade de polímero formada no exterior do material mesoporoso MCM-41. De maneira a minimizar essa quantidade de polímero foram delineadas algumas estratégias de síntese, uma delas pelo método de sublimação. Esta estratégia originou um material híbrido onde o polímero se situava maioritariamente nos poros da sílica MCM-41, mas não apresenta actividade electrocrómica. Ainda nesta dissertação, e com o objectivo de serem misturados com nanotubos de carbono foi sintetizado o polímero funcionalizado com pireno: poli ((3,4-etilenodioxi)-tiofeno-pireno-co-3,4-(2-etilhexiloxi)-tiofeno), utilizando uma proporção de 1:10 (P6.1) e na proporção 1:6 (P6.2) do monómero EDOT-Pireno em relação ao monómero (3,4-(2-etilhexiolxi)-tiofeno. Os polímeros foram caracterizados por 1H-RMN, UV-Vis e voltametria cíclica.

Design of a CMOS amplifier for breast cancer detection

A transimpedance amplifier (TIA) is used, in radiation detectors like the positron emission tomography(PET), to transform the current pulse produced by a photo-sensitive device into an output voltage pulse with a desired amplitude and shape. The TIA must have the lowest noise possible to maximize the output. To achieve a low noise, a circuit topology is proposed where an auxiliary path is added to the feedback TIA input, In this auxiliary path a differential transconductance block is used to transform the node voltage in to a current, this current is then converted to a voltage pulse by a second feedback TIA complementary to the first one, with the same amplitude but 180º out of phase with the first feedback TIA. With this circuit the input signal of the TIA appears differential at the output, this is used to try an reduced the circuit noise. The circuit is tested with two different devices, the Avalanche photodiodes (APD) and the Silicon photomultiplier (SIPMs). From the simulations we find that when using s SIPM with Rx=20kΩ and Cx=50fF the signal to noise ratio is increased from 59 when using only one feedback TIA to 68.3 when we use an auxiliary path in conjunction with the feedback TIA. This values where achieved with a total power consumption of 4.82mv. While the signal to noise ratio in the case of the SIPM is increased with some penalty in power consumption.